劉新峰丁向彬王軼敏李新郭宏李光鵬

（1. 內(nèi)蒙古大學(xué) 國(guó)家轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究中心，呼和浩特 010070；2. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 3 00384）

fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿差異蛋白的研究

劉新峰1，2丁向彬2王軼敏2李新2郭宏2李光鵬1

（1. 內(nèi)蒙古大學(xué) 國(guó)家轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)研究中心，呼和浩特 010070；2. 天津農(nóng)學(xué)院 動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 3 00384）

以fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白為材料，利用2D-雙向電泳、生物信息學(xué)及血脂生化檢測(cè)技術(shù)對(duì)fat-1基因調(diào)控牛脂類代謝的潛在機(jī)制進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，8個(gè)相關(guān)差異蛋白（AHSG、KNG1、Serpin A3-1、ENSBTAG00000021729、Serpin A3-5、FAM208A、CTAGE5、LOC511240）被鑒定；經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)有63個(gè)蛋白與這8個(gè)差異蛋白存在互作關(guān)系，而且發(fā)現(xiàn)差異蛋白和互作蛋白富集了11個(gè)與脂類代謝密切相關(guān)的生物學(xué)通路，其中互作蛋白APOA1在11個(gè)通路中富集的頻率最高；經(jīng)血漿APOA1檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛顯著高于野生型牛；相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)APOA1與低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）高度負(fù)相關(guān)（r=-0.90），與高密度脂蛋白膽固醇/總膽固醇（HDL-C/TC）的比值存在顯著正相關(guān)（r=0.69）。綜合結(jié)果顯示了fat-1基因可能通過(guò)介導(dǎo)APOA1的表達(dá)調(diào)控轉(zhuǎn)基因牛的脂類代謝。

fat-1轉(zhuǎn)基因牛；血漿蛋白；n-3 PUFAs；脂類代謝

n-3多不飽和脂肪酸（n-3 PUFAs）與人類的健康密切相關(guān)。眾多研究已報(bào)道，增加n-3 PUFAs的攝入能夠降低心血管系統(tǒng)疾病、Ⅱ型糖尿病及許多癌癥疾病的發(fā)生率［1-4］。盡管n-3 PUFAs對(duì)人類健康有眾多有益作用，但人和哺乳動(dòng)物自身不能合成 n-3 PUFAs，只能通過(guò)飲食獲取的方式進(jìn)行補(bǔ)充。1997年，Spychalla等［5］利用擬南芥中已知的去飽和酶基因序列首次在線蟲(chóng)基因組中進(jìn)行掃描獲得了一個(gè)脂肪酸脫氫酶基因，被命名為fat-1基因。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)入fat-1基因的多種哺乳動(dòng)物中均能顯著提高體內(nèi)n-3 PUFAs的含量，降低n-6 PUFAs/n-3 PUFAs的比值。Kang等［6］首次獲得了第一批fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠可以通過(guò)體內(nèi)fat-1基因的持續(xù)表達(dá)可將n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs。同年，Lai等［7］利用fat-1基因又成功制備了轉(zhuǎn)基因豬，并發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因豬的n-3 PUFAs，特別是二十二碳六烯酸（do cosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosape ntaenoic acid，EPA）的含量分別提高4和15倍，總的n-6 PUFAs/n-3 PUFAs比率降低了5倍。隨后，許多實(shí)驗(yàn)室又 相繼誕生了富含n-3 PUFAs的fat-1轉(zhuǎn)基因牛［8］和羊［9］，充分顯示了fat- 1基因使哺乳動(dòng)物機(jī)體中n-6 PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3 PUFAs的功能。

fat-1基因具有使哺乳動(dòng)物自身合成n-3 PUFAs的功能已毋庸置疑，但涉及其調(diào)控脂類代謝的深入機(jī)制仍缺乏理論依據(jù)。血漿中富含的蛋白最為豐富，其表達(dá)變化能真實(shí)的反映出機(jī)體的代謝狀況。通過(guò)血漿差異蛋白研究基因的功能或機(jī)體某種疾病的患病機(jī)制在國(guó)內(nèi)外已有眾多報(bào)道。Ding等［10］研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)牛生長(zhǎng)激素基因的小鼠隨著年齡的變化血漿蛋白表達(dá)也發(fā)生變化，變化的蛋白與轉(zhuǎn)基因小鼠的壽命降低存在重要聯(lián)系。高昭輝等［11］利用血漿蛋白組學(xué)研究了奶牛蹄葉炎發(fā)病的可能機(jī)制。劉珊珊等［12］對(duì)不同環(huán)境條件下雙峰駝的血漿差異蛋白進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)高溫環(huán)境能引起駱駝內(nèi)分泌系統(tǒng)變化，從而改變了一 些血漿蛋白的表達(dá)變化，并發(fā)現(xiàn)發(fā)生變化的血漿蛋白主要與機(jī)體的免疫反應(yīng)、物質(zhì)運(yùn)輸及物質(zhì)代謝等密切相關(guān)。fat-1基因作為一種不飽和脂肪酸合成的重要基因，其必定參與機(jī)體脂類代謝的調(diào)控，通過(guò)血漿蛋白組學(xué)的研究對(duì)于揭示fat-1基因調(diào)控機(jī)體脂類代謝的潛在機(jī)理有重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)擬先通過(guò)2D-雙向電泳技術(shù)對(duì)fat-1轉(zhuǎn)基因牛的血漿差異蛋白進(jìn)行鑒定，利用生物信息學(xué) 技術(shù)預(yù)測(cè)與差異蛋白互作的蛋白，分析其參與的脂類代謝生物學(xué)通路，同時(shí)結(jié)合血脂常規(guī)生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果，分析fat-1基因參與調(diào)控轉(zhuǎn)基因牛機(jī)體脂類代謝的可能方式，旨在為深入揭示fat-1基因參與脂類代謝的機(jī)制積累重要資料，同時(shí)為今后生產(chǎn)更安全、健康的fat-1轉(zhuǎn)基因牛提供可參考的資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 分光光度儀（UV1800，美譜達(dá)儀器公司）、純水裝置（摩爾公司）、超聲波細(xì)胞破碎儀（寧波新芝）、IPGhor 等電聚焦儀（GE Healthcare）、Ettan DALT-SIX SDS-PAGE（GE Healthcare）、Etta n-DALT-Six系統(tǒng)水浴循環(huán)儀（GE Healthcare）、Image Scanner掃描儀（GE Healthcare）、PDquest分析軟件（Bio-Rad）、全自動(dòng)生化分析儀（Glamour3000）。

1.1.2 主要試劑 17 cm非線性固相化梯度膠條（IPG，PH3-10）為GE公司產(chǎn)品；三羥甲基氨基甲烷（Tris-base）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、3-［（3-膽酰胺丙基）-二乙胺］-丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、碘乙酰胺（IAA）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（Bis-acrylamide）、過(guò)硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、甘氨酸（Gly）、2D 電泳樣品提取緩沖液系列（PL039）、低 熔 點(diǎn) 瓊 脂 糖、 乙 醇（C2H5OH）、 冰 醋 酸（CH3COOH）、2D 平衡緩沖液（SD6030）、非干擾型蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒（SK3071）、Protein Stains K質(zhì)譜用快速銀染試劑盒（BSP021）、柱式血清白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒（BSP064）均為上海生工生物工程有限公司；載脂蛋白A1（APOA1）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）及低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）檢測(cè)試劑盒均為英科新創(chuàng)科技有限公司；其余藥品均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 實(shí)驗(yàn)選擇由實(shí)驗(yàn)室先前通過(guò)體細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的3頭fat-1轉(zhuǎn)基因成年牛及3頭野生型成年牛，于試驗(yàn)前2個(gè)月飼養(yǎng)于同一個(gè)圈舍，飲食及飼養(yǎng)方式相同。2個(gè)月后，頸靜脈采集6頭牛的血液置于加抗凝劑的采血管中，4 000 r/min 離心收集血漿，將3頭轉(zhuǎn)基因牛和3頭野生型牛血漿分別等量混樣后，立即凍存于-80℃冰箱備用，剩余血漿以同樣方式單獨(dú)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血漿蛋白提取 使用柱式血清白蛋白/免疫球蛋白清除試劑盒，按試劑盒推薦的方法去除血漿中的高豐度蛋白，將收集管中的濾液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入 5 倍體積丙酮，-20℃過(guò)夜。離心收集沉淀，冷凍干燥，加入適量的蛋白裂解液溶解蛋白，使用非干擾型蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白濃度。

1.2.3 雙向電泳 吸取2組制備好的蛋白樣品各150 μg與上樣緩沖液混合后進(jìn)行第一向等點(diǎn)聚焦，等電聚焦程序?yàn)?0 V 12 h（主動(dòng)水化）；500 V（線性）1 h；1 000 V（線性）1 h；9 000 V（線性）5 h；9 000 V（快速）8 000 Vh；500 V（快速）任意時(shí)間。將第一向聚焦完成的膠條加 2D 平衡緩沖液（加1% DTT）10 mL，搖床平衡15 min。清洗膠條，加入2D平衡緩沖液（加2.5% IAA），搖床平衡15 min。將平衡后的膠條放入凝膠板中，加入低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液（0.5%低熔點(diǎn)瓊脂糖+電泳緩沖液），室溫靜置20 min后開(kāi)始第二向電泳。第二向SDS-PAGE凝膠濃度為12.5%，電泳參數(shù)設(shè)定為：100 V/膠，電泳45 min；200 V/膠，至溴酚藍(lán)離膠下沿0.5 cm處停止；冷循環(huán)設(shè)定溫度為15℃。

1.2.4 凝膠染色及圖像掃描 使用Protein Stains K質(zhì)譜用快速銀染試劑盒（BSP021）進(jìn)行染色。染色后的膠經(jīng)脫色處理后進(jìn)行掃描，分辨率為300 dpi。使用PDquest 8.0軟件對(duì)同一樣品3次重復(fù)的圖像進(jìn)行分析，選取轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛表達(dá)量>1.5倍且P<0.05的差異蛋白點(diǎn)用于質(zhì)譜鑒定。

1.2.5 質(zhì)譜鑒定 切取差異蛋白點(diǎn)，送上海生工生物工程有限公司完成差異蛋白的質(zhì)譜鑒定?；静襟E為：將差異點(diǎn)酶切后，用MAL-DI-TOF/TOF-MS分析，用Mascot軟件搜索NCBInr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)樣品的物種判定差異蛋白。

1.2.6 差異蛋白互作蛋白預(yù)測(cè)與分析 鑒定出的差異蛋白通過(guò)http://string-db.org/ 網(wǎng)站進(jìn)行互作蛋白的預(yù)測(cè)，合并差異蛋白及互作蛋白信息，繼續(xù)利用http://string-db.org/ 網(wǎng)站進(jìn)行GO和KEGG富集分析，篩選出與脂類代謝密切相關(guān)的生物學(xué)通路。

1.2.7 血漿APOA1及血脂生化指標(biāo)檢測(cè)及關(guān)聯(lián)分析 用全自動(dòng)生化分析儀及相應(yīng)試劑盒，分別檢測(cè)3頭轉(zhuǎn)基因牛與3頭野生型牛血漿中APOA1及血脂生化水平（TG、TC、HDL-C、LDL-C）。所得數(shù)據(jù)通過(guò)t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05被認(rèn)為差異顯著。應(yīng)用Excell中Pearson相關(guān)性分析函數(shù)，分析血漿中APOA1水平與顯著變化血脂生化指標(biāo)的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.00為無(wú)相關(guān)性，0.00

2 結(jié)果

2.1 雙向電泳結(jié)果分析

轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛血漿樣品3次重復(fù)的2-DE圖譜中具有1.5倍以上表達(dá)，且P<0.05的差異蛋白點(diǎn)共有16個(gè)，如圖1所示。其中在fat-1轉(zhuǎn)基因牛上調(diào)的點(diǎn)有13個(gè)，下調(diào)的點(diǎn)有3個(gè)。

圖1 血漿差異蛋白點(diǎn)表達(dá)圖譜

2.2 差異蛋白點(diǎn)的鑒定

16個(gè)差異蛋白點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果見(jiàn)表1。其中10個(gè)差異蛋白點(diǎn)鑒定成功，其余6個(gè)鑒定失敗。10個(gè)得到鑒定的點(diǎn)為8種不同的蛋白，分別是AHSG， KNG1，Serpin A3-1，ENSBTAG00000021729，serpin A3-5，F(xiàn)AM208A，CTAGE5和 LOC511240， 除LOC511240外，其余蛋白在fat-1轉(zhuǎn)基因牛均呈上調(diào)表達(dá)。

表1 血漿差異蛋白點(diǎn)質(zhì)譜鑒定

2.3 差異蛋白潛在功能分析

為分析鑒定出的8種差異蛋白所具有潛在功能，本研究首先對(duì)這8種差異蛋白分別進(jìn)行互作蛋白預(yù)測(cè)，最終獲得71個(gè)互作蛋白（包括8種差異蛋白），其互作調(diào)控關(guān)系如圖2所示，除ENSBTAG00000021729、CTAGE5和CCDC68外，其余蛋白均存在良好的互作關(guān)系，互作網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)顏色相同的蛋白表示互作關(guān)系密切。圖2可見(jiàn)節(jié)點(diǎn)顏色主要有3類（粉色、黃色和綠色），顯示這71個(gè)蛋白可能存在3類重要的調(diào)控生命活動(dòng)的功能。

為進(jìn)一步挖掘差異蛋白與互作蛋白對(duì)機(jī)體發(fā)揮的可能分子功能，本研究繼續(xù)對(duì)這71個(gè)蛋白進(jìn)行GO和KEGG富集分析，結(jié)果（圖3）顯示，發(fā)現(xiàn)有11個(gè)與脂類代謝密切相關(guān)的生物學(xué)通路，主要包括脂類運(yùn)輸、脂類結(jié)合、脂類定位、脂類應(yīng)答等。11個(gè)脂類代謝的生物學(xué)通路中共有12互作蛋白被富集，并發(fā)現(xiàn)APOA1出現(xiàn)的頻率最高。

2.4 互作蛋白APOA1血漿表達(dá)分析

基于上述研究結(jié)果，研究選擇出現(xiàn)頻率最高的互作蛋白APOA1，比較其在fat-1轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛血漿中的表達(dá)情況。如圖4所示，轉(zhuǎn)基因牛血漿中APOA1表達(dá)顯著高于野生型牛（P<0.05）。

2.5 常規(guī)血脂生化指標(biāo)分析

表2可見(jiàn)，3項(xiàng)指標(biāo)在轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛中發(fā)生了顯著的變化。其中轉(zhuǎn)基因牛的TC和LDL-C的含量均顯著低于野生型牛（P<0.05）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因牛的HDL-C/TC比值顯著高于野生型牛（P<0.05）。

2.6 血漿APOA1與顯著變化血脂的相關(guān)性分析

如表3所示，Spearman 相關(guān)性分析顯示APOA1與顯著變化的血脂均存在一定的相關(guān)性。其中APOA1與LDL-C高度負(fù)相關(guān)，與TC也存在負(fù)相關(guān)，但相關(guān)性較低，而與HDL-C/TC比值顯著正相關(guān)。

3 討論

圖2 差異蛋白互作蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖3 脂類代謝富集的生物學(xué)通路

由于2D-雙向電泳檢測(cè)靈敏度的局限性，本研究只鑒定了8種差異蛋白，為了深入挖掘這8種差異蛋白對(duì)機(jī)體所起的作用，本研究運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)獲得了這8種差異蛋白的63種互作蛋白，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白與互作蛋白主要參與了11個(gè)與脂類代謝密切相關(guān)的生物學(xué)通路，其中APOA1被發(fā)現(xiàn)在11個(gè)脂類代謝通路中出現(xiàn)的頻率最高，表明fat-1基因參與對(duì)脂類代謝的調(diào)控 可能與APOA1 有密切關(guān)系。眾所周知，APOA1是HDL-C的主要成分，對(duì)脂類代謝和脂類運(yùn)輸起著重要作用，其水平增高時(shí)可降低膽固醇的含量，與冠心病的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)關(guān)系［13，14］。本研究發(fā)現(xiàn)fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白中APOA1的含量顯著高于野生型牛，暗示了fat-1基因的表達(dá)可以通過(guò)升高APOA1的表達(dá)降低機(jī)體發(fā)生冠心病的可能性。Ahmed等［15］報(bào)道，增加n-3 PUFAs的飲食可以提升APOA1的表達(dá)，這一報(bào)道更加支持了本研究的結(jié)果。

圖4 轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛APOA1血漿表達(dá)情況比較

表2 轉(zhuǎn)基因牛與野生型牛血脂指標(biāo)分析

表3 APOA1與顯著變化血脂的相關(guān)性分析

機(jī)體血脂水平的變化不僅是脂類代謝變化狀況的反映，也與機(jī)體的健康狀況密切相關(guān)。TG主要參與機(jī)體的能量代謝，TG的升高與肥胖發(fā)生密切相關(guān)，肥胖可以導(dǎo)致多種代謝性疾病，比如糖尿病、胰島素抵抗、心血管疾病、脂肪肝、高血壓以及代謝綜合癥等［16，17］。TC是動(dòng)物細(xì)胞各種生物膜結(jié)構(gòu)和神經(jīng)髓鞘的組成部分，是類固醇激素、膽汁酸和維生素D3的前體，所以具有重要的生理功能。血液中TC含量過(guò)高，便會(huì)沉積在血管壁，造成血管變窄，容易引起血壓升高和血管閉塞，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。HDL-C和LDL-C都是運(yùn)輸內(nèi)源性的膽固醇酯，但它們的作用卻截然不同。人類醫(yī)學(xué)上，HDL-C是冠心病臨床診斷的一個(gè)重要參考指標(biāo)，它的升高可以降低冠心病發(fā)生的幾率，并能防治和延緩動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，而LDL-C水平的升高會(huì)增加患冠狀動(dòng)脈心臟病和動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，n-3 PUFAs可以通過(guò)降低HMG-CoA還原酶的活性，增強(qiáng)ACAT的活性從而抑制TC的生物合成，同時(shí)，n-3 PUFAs 可以促進(jìn)TC代謝為膽酸和中性固醇，形成膽汁，經(jīng)糞便排出，因此也能夠有效降低TC的水平［18，19］。n-3 PUFAs也能降低LDL-C的水平，升高HDL-C水平及HDL-C/TC的比值［19-21］。本研究結(jié)果與以上研究結(jié)果一致的是，fat-1基因的轉(zhuǎn)入顯著降低了牛血漿中TC與LDL-C的含量，而且顯著升高了HDL-C/TC的比率。基于這些結(jié)果，本研究繼續(xù)將血漿APOA1的表達(dá)與顯著變化的TC、LDL-C含量及HDL-C/TC的比率進(jìn)行了相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)APOA1與LDL-C呈高度負(fù)相關(guān)，與HDL-C/TC呈顯著正相關(guān)，進(jìn)一步表明fat-1基因與APOA1在參與脂類代謝中的重要聯(lián)系，特別是揭示了fat-1基因可能通過(guò)介導(dǎo)APOA1的表達(dá)調(diào)控脂類代謝進(jìn)程的潛在機(jī)制，為后續(xù)開(kāi)展更為深入的研究提供了理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究在3頭fat-1轉(zhuǎn)基因牛血漿蛋白中鑒定了8個(gè)差異蛋白，分析獲得了63個(gè)蛋白與差異蛋白存在互作關(guān)系，而且發(fā)現(xiàn)差異蛋白和互作蛋白富集了11個(gè)與脂類代謝密切相關(guān)的生物學(xué)通路，其中APOA1在11個(gè)通路中富集的頻率最高。進(jìn)一步的研究也證實(shí)轉(zhuǎn)基因牛血漿中APOA1的含量顯著高于野生型牛，并發(fā)現(xiàn)APOA1與LDL-C高度負(fù)相關(guān)，而與HDL-C/TC比值顯著正相關(guān)。本研究結(jié)果初步揭示了fat-1基因通過(guò)介導(dǎo)APOA1的表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因牛脂類代謝調(diào)控的可能機(jī)制。

［1］Liu F, Li Z, Lv X, et al. Dietary n-3 polyunsaturated fatty acid intakes modify the effect of genetic variation in fatty acid desaturase 1 on coronary artery disease［J］. PLoS One, 2015, 10（4）：e0121255.

［2］Psota TL, Gebauer SK, Kris-Etherton P. Dietary omega-3 fatty acid intake and cardiovascular risk［J］. Am J Cardiol, 2006, 98（4A）：3i-18i.

［3］White PJ1, Arita M, Taguchi R, et al. Transgenic restoration of longchain n-3 fatty acids in insulin target tissues improves resolution capacity and alleviates obesity-linked inflammation and insulin resistance in high-fat-fed mice［J］. Diabetes, 2010, 59（12）：3066-3073.

［4］Algamas-Dimantov A, Yehuda-Shnaidman E, Hertz R, et al. Prevention of diabetes-promoted colorectal cancer by（n-3）polyunsaturated fatty acids and（n-3）PUFA mimetic［J］. Oncotarget, 2014, 5（20）：9851-9863.

［5］Spychalla JP, Kinney AJ, Browse J. Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis［J］. Proc Nat1 A cad Sci USA, 1997, 94（4）：1142-1147.

［6］Kang JX, Wang J, Wu L, et al. Transgenic mice：fat-1 mice convert n-6 to n-3 fatty acids［J］. Nature, 2004, 427（6974）：504.

［7］Lai L, Kang JX, Li R, et al. Generation of cloned transgenic pigs rich in omega-3 fatty acids［J］. Nat Biotechnol, 2006, 24（4）：435-436.

［8］Wu X, Ouyang H, Duan B, et al. Production of cloned transgenic cow expressing omega-3 fatty acids［J］. Transgenic Res, 2012, 21（3）：537-543.

［9］Zhang P, Liu P, Dou H, et al. Handmade coned transgenic sheep rich in omega-3 fatty acids［J］. PLoS One, 2013, 8（2）：e55941.

［10］Ding J, Berryman DE, Kopchick JJ. Plasma proteomic profiles of bovine growth hormone transgenic mice as they age［J］. Transgenic Res, 2011, 20（6）：1305-1320.

［11］高昭輝, 荔霞, 嚴(yán)作廷, 等. 蹄葉炎奶牛血漿蛋白質(zhì)組學(xué)2D-圖譜的構(gòu)建及分析［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2013, 33（7）：1078-1082.

［12］劉珊珊, 陶金忠, 武小虎, 等. 不同環(huán)境溫度條件下雙峰駝血漿蛋白組學(xué)差異［J］. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2014, 34（11）：1824-1828.

［13］Sierra-Johnson J, Fisher RM, Romero-Corral A, et al. Concentration of apolipopr -teinB is comparable with the apolipoprtein B/apolipoprotein A-1 ratio and better than routine clinical lipid measurements in predicting coronary heart disease mortality：findings from a multiethnic US population［J］. J Eur Heart, 2009, 30（6）：710-717.

［14］Cho KH, Shin DG, Baek, et al. Myocardial infraction patients show altered lip-oproteins and function when compared with stable angina pectoris patients［J］. J Exp Mol Med, 2009, 41（2）：67-76.

［15］Ahmed AA, Balogun KA, Bykova NV, Cheema SK. Novel regulatory roles of omega-3 fatty acids in metabolic pathways：a proteomics approach［J］. Nutr Metab（Lond）, 2014, 11（1）：6.

［16］Despres JP, Lemieux I. Abdominal obesity and metabolic syndrome［J］. Nature, 2006, 444（7121）：881-887.

［17］He Y, Li Y, Zhao T, et al. . Ursolic acid inhibits adipogenesis in 3T3-L1 adipocytes through LKB1/AMPK pathway［J］. PLoS One, 2013, 8（7）：e70135.

［18］Ikeda I, Wakamatsu K, Inayoshi A, et al. alpha-Linolenic, e icosapentaenoic and docosahexaenoic acids affect lipid metabolism differently in rats［J］. J Nutr, 1994, 124（10）：1898-1906.

［19］Conquer JA, Holub BJ. Effect of supplementation with different doses of DHA on the levels of circulating DHA as non-esterified fatty acid in subjects of Asian Indian background［J］. J Lipid Res, 1998, 39（2）：286-292.

［20］Conquer JA, Holub BJ. Supplementation with an algae source of docosahexaenoic acid increases（n-3）fatty acid status and alters selected risk factors for heart disease in vegetarian subjects［J］. J Nutr, 1996, 126（12）：3032-3039.

［21］Davidson MH, Maki KC, Kalkowski J, et al. Effects of docosahexaenoic acid on serum lipoproteins in patients with combined hyperlipidemia：a randomized, double-blind, placebocontrolled trial［J］. J Am Coll Nutr, 1997, 16（3）：236-243.

（責(zé)任編輯 馬鑫）

Study of Plasma Differential Proteins in fat-1 Transgenic Cow

LIU Xin-feng1，2DING Xiang-bin2WANG Yi-min2LI Xin2GUO Hong2LI Guang-peng1
（1. National Research Center for Animal Transgenic Biotechnology，Inner Mongolia University，Hohhot 010070；2. College of Animal Science and Animal Medicine，Tianjin Agriculture College，Tianjin 300384）

Using the plasma proteins in fat-1 transgenic cow as the research material，the potential mechanism of fat-1 regulating lipid metabolism were studied using two-dimensional electrophoresis，bioinformatics and plasma lipid biochemical detection technology. The result showed that 8 differential proteins（AHSG，KNG1，Serpin A3-1，E NSBTAG00000021729，Serpin A3-5，F(xiàn)AM208A，CTAGE5，and LOC511240）were identified. Bioinformatics predicted that there were 63 proteins interacting with these 8 differential proteins，and it was discovered that differential proteins and interacting proteins enriched in 11 biological pathways related to lipid metabolism，and the APOA1 of which enriched at the hig hest frequency in the 11 pathways. Accordingly，the significantly higher plasma level of APOA1 was detected in fat-1 transgenic cow than wild-type cow. Then，the plasma level of APOA1 was negatively related to the plasma level of low density lipoprotencholesterol（LDL-C，r=-0.90），whereas positively related to the ratio of high density lipoproten-cholesterol/total cholesterol（HDL-C/TC，r=0.69）. These results indicated the fat-1 gene regulated the lipid metabolism by mediating the expression of APOA1 in transgenic cow.

fat-1 transgenic cow；plasma protein；n-3 PUFAs；lipid metabolism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.027

2016-01-14

國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)（2014ZX08007-002）

劉新峰，男，博士研究生，研究方向：轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)與安全評(píng)價(jià)；E-mail：lxf20001924036@126.com

郭宏，男，博士，教授，研究方向：動(dòng)物分子育種與轉(zhuǎn)基因技術(shù)；E-mail；guohong64@163.com

李光鵬，男，博士，研究方向：動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)與生產(chǎn)；E-mail：imudwzx@163.com