石琳胡延萍王建科王鈞許小寧李毅王莉

（1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 青海省縣鎮(zhèn)企業(yè)技術(shù)組廠站，西寧 810008）

云生毛茛ISSR-PCR體系優(yōu)化與引物篩選

石琳1，2胡延萍1王建科1，2王鈞1，2許小寧3李毅1王莉1

（1. 中國科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧 810001；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 青海省縣鎮(zhèn)企業(yè)技術(shù)組廠站，西寧 810008）

旨在建立穩(wěn)定可靠的云生毛茛ISSR-PCR反應(yīng)體系。采用正交試驗設(shè)計方法，對影響云生毛茛ISSR-PCR擴增結(jié)果的Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物、模板DNA五個因素進行優(yōu)化篩選，對反應(yīng)程序進行優(yōu)化，建立適用于云生毛茛的最佳反應(yīng)體系和擴增程序，并對反應(yīng)體系和擴增程序進行驗證；在此基礎(chǔ)上篩選多態(tài)性好的ISSR引物，采用梯度法篩選各個引物的最適退火溫度。結(jié)果表明，云生毛茛20 μL ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系為：模板DNA 30 ng，Mg2+1.95 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.04 U/μL，dNTP 0.150 mmol/L，引物 0.5 μmol/L；最佳反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，49.6-60.6℃復(fù)性1 min，72℃延伸100 s，38個循環(huán)；72℃下延伸6 min。在優(yōu)化的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序條件下，從100條ISSR引物中篩選獲得16條ISSR擴增引物，并確定了引物各自的最適退火溫度。經(jīng)過不同居群云生毛茛的驗證，證明優(yōu)化后體系擴增條帶清晰且重復(fù)性好，可用于后續(xù)云生毛茛遺傳多樣性的研究。

云生毛茛；ISSR-PCR；正交實驗設(shè)計；體系優(yōu)化；引物篩選

云生毛茛（Ranunculus nephelogenes var. nephelogenes）為毛茛科（Ranunculaceae）毛茛屬（Ranunculus Linn.）多年生草本，生長于海拔2 210-4 800 m的高山草甸、沼澤草甸、河灘、濕地等處，在我國主要分布于甘肅、青海、云南、四川、西藏和新疆等省區(qū)［1］。同時云生毛茛是祁連山濕地主要的挺水植物之一，在祁連山濕地水土保持和氣候調(diào)節(jié)中占據(jù)重要地位。

目前對于云生毛茛的研究較少，僅涉及藥用價值、核型、繁育系統(tǒng)等研究。云生毛茛具有輕微毒性，全草可入藥，有清熱解毒，利尿解表的功效［2］，其中所含的毛茛黃酮有抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性［3，4］；毛茛苷類成分具有顯著的抗炎、鎮(zhèn)痛和抗心肌肥大等作用［5，6］；開發(fā)和利用其藥用價值前景廣闊。聶谷華［7］報道云生毛茛染色體數(shù)目為32，其核型公式2n = 4x = 32 = 16m + 10sm + 6st，核型類型3B；趙志剛等［8-10］的研究認為云生毛茛為兼性無融合生殖，性分配偏向雄性功能的分配，并會隨著自交率的增加而降低。

毛茛屬中許多類群在形態(tài)上存在漸變性變化，有些物種的分類學(xué)地位尚不確定。近年來，分子生物學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于分類學(xué)中，Jensen和Hoot［11］基于多個基因片段建立的系統(tǒng)樹，把毛茛科分成3個亞科：黃連亞科、扁果草亞科和毛茛亞科。其中毛茛亞科包括7個族，側(cè)金盞花族單列為一族，包括了美化草屬、側(cè)金盞花屬和金蓮花屬3個屬，并認為側(cè)金盞花族和毛茛族獨立進化，而且側(cè)金盞花屬和金蓮花屬的關(guān)系較近。Paun等［12］基于ITS、matK、trnK分子片段對毛茛屬及其近緣類群的研究表明：毛茛屬的核心成員和水毛茛屬近緣，向外依次為角果毛茛屬、堿毛茛屬和鴉拓花屬。尚未見利用分子標(biāo)記技術(shù)研究云生毛茛遺傳特征的報道。

簡單重復(fù)序列間擴增（inter simple sequence repeat，ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)是以簡單序列重復(fù)標(biāo)記（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記為基礎(chǔ)建立的第二代分子標(biāo)記技術(shù)［13］，利用基因組中存在的簡單重復(fù)序列SSR設(shè)計引物，在SSR的3'或5'端加錨1-4個隨機堿基，以此作為3'或5'引物，對兩側(cè)具有反向排列的SSR間的基因組片段進行擴增。與SSR相比，ISSR技術(shù)具有無需預(yù)知研究對象的基因組序列、無需設(shè)計專門引物、對DNA模板質(zhì)量要求較低等優(yōu)點，廣泛適用于不同植物的遺傳多樣性分析、種質(zhì)鑒定、基因定位和比較基因組學(xué)研究等方向［14-16］。利用ISSR技術(shù)對云生毛茛的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性進行分析，將為研究祁連山濕地藥用資源開發(fā)與保護提供重要實驗依據(jù)。本研究以云生毛茛為研究對象，在預(yù)實驗基礎(chǔ)上對影響PCR擴增結(jié)果的模板DNA、Mg2+、dNTP、Taq DNA聚合酶及引物5個因子進行優(yōu)化篩選，以期建立適合于云生毛茛ISSR分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系，為后續(xù)深入研究云生毛茛遺傳多樣性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

樣品于2012年采自青海省祁連山地區(qū)，經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所盧學(xué)峰研究員鑒定為云生毛茛，每個植株樣品采集嫩葉，迅速放入塑料自封袋中，并加入硅膠干燥保存。憑證標(biāo)本保存于中國科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（采集號2013001-2013002）。

本實驗采用由加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）提供的Set#9引物序列［17］作為ISSR擴增引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。經(jīng)初步試驗，選用擴增片段清晰、多態(tài)性豐富的引物UBC810（5'-GAGAGAGAGAGAGAGAT-3'）作為建立反應(yīng)體系的固定引物。實驗中使用的dNTP mixture、Taq DNA聚合酶、10×Buffer、100 bp DNA Ladder、200 bp Ladder均購自寶生物工程（大連）有限公司。

C1000 TouchTMThermal Cycler PCR儀，美國Bio-Rad；Power PacTMUniversal 電泳儀，美國Bio-Rad；ChemiDocTMMP凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 云生毛茛基因組總DNA提取 采用改良CTAB法［17］提取云生毛茛的基因組總DNA。各取3 μL DNA樣品，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測；使用Nano Drop 2000c微量分光光度計測定DNA濃度、A260和A280值。DNA純度以A260/A280比值為標(biāo)準(zhǔn)進行評估。提取得到的云生毛茛基因組總DNA樣品放入-20℃冰箱保存。

1.2.2 云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)體系優(yōu)化 采用正交設(shè)計法，設(shè)計以Mg2+濃度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP濃度、引物用量、DNA濃度為變量的五因素四水平正交實驗（表1），研究各因素對擴增結(jié)果的影響。PCR反應(yīng)程序設(shè)置為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，58℃退火1 min，72℃延伸100 s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸6 min。反應(yīng)產(chǎn)物在1.2% 瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL EB）中電泳拍照。正交實驗重復(fù)2次。參照何正文等的直觀分析法［18，19］，對每一處理結(jié)果進行評分。依據(jù)條帶清晰度、多態(tài)性、穩(wěn)定性對各實驗結(jié)果進行評分，特異性高、條帶清晰、亮度最高的16分，最低1分。評分結(jié)果用DPS 7.05 統(tǒng)計軟件進行方差分析［20］。

表1 云生毛茛ISSR-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計表

1.2.3 云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)程序優(yōu)化 設(shè)計33、35、38、40和45個擴增循環(huán)次數(shù)和60 s、80 s、100 s、120 s和150 s五個延伸時間，比較不同循環(huán)次數(shù)和延伸時間對PCR擴增結(jié)果的影響。

1.2.4 云生毛茛ISSR-PCR擴增體系驗證 以不同居群的云生毛茛基因組總DNA為模板，在優(yōu)化得到的最佳反應(yīng)條件下用引物UBC810進行PCR擴增，檢驗建立的擴增體系的穩(wěn)定性。每個樣品做兩個重復(fù)。

1.2.5 引物篩選及其退火溫度優(yōu)化 應(yīng)用以優(yōu)化的反應(yīng)體系與反應(yīng)程序，選取一個云生毛茛基因組總DNA樣品作為模板，分別與100條ISSR引物進行PCR擴增，選取擴增條帶清晰、豐富、多態(tài)性好的引物作為云生毛茛ISSR-PCR擴增的最佳引物。再根據(jù)公式Tm= 4（G+C）+ 2（A+T），計算出各引物的理論退火溫度Tm。在理論退火溫度Tm值上下1-3℃范圍內(nèi)，利用PCR儀自動生成的溫度梯度進行PCR擴增，優(yōu)化各引物的最佳退火溫度。

2 結(jié)果

2.1 云生毛茛基因組總DNA提取結(jié)果

云生毛茛基因組總DNA凝膠電泳結(jié)果如圖1所示，DNA條帶清晰明亮，無拖尾現(xiàn)象，說明所提取的云生毛茛基因組總DNA完整性好，無明顯降解。微量分光光度計測得DNA樣品濃度在239-823 ng/μL 之間，A260/A280的比值均在1.8-2.0之間，說明用改良CTAB法提取獲得的DNA樣品純度較高，能夠滿足后續(xù)實驗要求。

2.2 云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)體系優(yōu)化

云生毛茛正交實驗電泳結(jié)果如圖2所示，各因素不同濃度組合的擴增結(jié)果差異明顯，其中實驗7多態(tài)性位點多，且條帶清晰明亮。對正交實驗各處理擴增結(jié)果進行評分，評分結(jié)果，見表1。

圖1 云生毛茛基因組DNA電泳圖

圖2 云生毛茛正交實驗電泳圖

根據(jù)評分計算同一因素不同水平間極差R和平均值X，結(jié)果見表2。極差值R越大，說明該因素對擴增結(jié)果的影響越大；平均值X最大的因素水平即為該因素的最佳濃度。表2中結(jié)果顯示，各因素對擴增結(jié)果的影響從大到小依次為引物>Mg2+> dNTP>DNA>Taq DNA聚合酶；Mg2+和DNA水平2、 Taq DNA聚合酶水平3、dNTP和引物水平4最好，即模板DNA 30 ng，Mg2+1.95 mmol/L，Taq DN聚合酶0.04 U/μL，引物0.5 μmol/L，dNTP 0.150 mmol/L。

方差分析（表3）結(jié)果顯示，各因素對實驗結(jié)果均有影響，且每個因素對擴增結(jié)果的影響均達到極顯著水平（P<0.01）。F值顯示的各因素對擴增結(jié)果的影響從大到小依次為引物 > Mg2+> dNTP > DNA> Taq DNA聚合酶，與極差法分析的結(jié)果一致。為確定每個因素的最適濃度水平，對5個因素進行Duncan多重比較，結(jié)果見表4。

引物是影響云生毛茛ISSR-PCR擴增結(jié)果的最大因素，本實驗中當(dāng)引物濃度為0.5 μmol/L時極差分析評分結(jié)果均值最大，且與其它水平之間差異顯著，因此選擇0.5 μmol/L為最佳引物濃度。

Mg2+對云生毛茛ISSR-PCR反應(yīng)的影響僅次于引物，本實驗中當(dāng)Mg2+濃度為1.95 mmol/L時極差分析評分結(jié)果均值最大，且與其它水平之間差異顯著，因此選擇1.95 mmol/L為Mg2+最佳濃度。

表2 云生毛茛正交實驗直觀分析結(jié)果

表3 正交實驗方差分析

dNTP是ISSR-PCR擴增反應(yīng)的重要原料，本實驗中當(dāng)dNTP濃度為0.150 mmol/L時評分結(jié)果均值最大，且與其它水平之間差異顯著。因此選擇0.150mmol/L為dNTP的最佳濃度。

表4 各因素水平間Duncan多重比較

本實驗中DNA含量為30 ng時極差分析評分結(jié)果均值最大，且與其它水平之間差異顯著。因此選擇30 ng為DNA的最佳用量。Taq DNA聚合酶濃度對擴增結(jié)果影響最小，當(dāng)Taq DNA聚合酶濃度為0.04 U/μL時，極差分析評分結(jié)果均值最大，與低濃度水平1、2間差異顯著，但與高濃度水平4（0.05 U/μL）無顯著差異。因此從經(jīng)濟角度選擇0.04 U/μL為Taq DNA聚合酶的最佳濃度。

綜上分析結(jié)果確定云生毛茛ISSR-PCR最佳反應(yīng)體系為：每20 μL反應(yīng)體系模板DNA 30 ng，Mg2+1.95 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.04 U/μL，引物0.5 μmol/L，dNTP 0.150 mmol/L。

2.3 云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)程序優(yōu)化

不同循環(huán)次數(shù)下云生毛茛ISSR-PCR擴增結(jié)果如圖3所示，38個循環(huán)的擴增可獲得明亮清晰的條帶，循環(huán)次數(shù)再增加，條帶無明顯變化，說明該擴增體系在38循環(huán)時到達平臺期。

不同延伸時間下的云生毛茛ISSR-PCR擴增結(jié)果（圖3）顯示，延伸時間在60-80 s之間時，條帶豐富但比較模糊，延伸時間在100-120 s之間時條帶豐富、清晰明亮，且擴增結(jié)果并沒有明顯差異，延伸時間在150 s 時產(chǎn)生了非特異性條帶。為了保證擴增結(jié)果同時減少擴增時間，本實驗選擇了100 s 作為最適延伸時間。

2.4 云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)體系驗證

采用優(yōu)化所得的ISSR-PCR反應(yīng)體系，引物UBC810與不同居群的云生毛茛基因組總DNA樣品進行擴增反應(yīng)，每個樣品做兩個重復(fù)。擴增結(jié)果如圖4所示，不同居群樣本在該體系下均能獲得清晰豐富且重復(fù)性好的擴增條帶，證明此體系穩(wěn)定可靠，適合云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)。

圖3 不同循環(huán)次數(shù)與不同延伸時間下的擴增結(jié)果

2.5 引物篩選及其退火溫度優(yōu)化

通過對100條引物的篩選，共得到16條ISSRPCR擴增結(jié)果良好的引物。溫度梯度PCR擴增結(jié)果（圖5）顯示，退火溫度對PCR擴增結(jié)果影響明顯。退火溫度為52.2℃時擴增條帶最豐富，明亮清晰，穩(wěn)定性好，因此選擇該溫度為此引物的最適退火溫度。16條引物的序列及各自最適退火溫度，見表5。

3 討論

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于各種藥用植物的種質(zhì)鑒定與分類、遺傳多樣性分析等，比傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)、細胞學(xué)方法更加準(zhǔn)確可靠，同時比基因測序等新技術(shù)手段更加方便經(jīng)濟。但ISSR擴增結(jié)果易受到Mg2+、引物、dNTPs及Taq DNA聚合酶、模板DNA等因素的影響。建立精確的ISSR-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，對保證ISSR實驗結(jié)果的可靠性十分必要。

正交實驗設(shè)計能用較少處理組合獲得各因素不同水平對擴增結(jié)果的影響，考察不同因素對擴增結(jié)果的影響顯著性。在本實驗中擴增結(jié)果的直觀分析結(jié)果表明不同因素的各水平組合對云生毛茛ISSR擴增結(jié)果影響較大；極差分析結(jié)果顯示各因素對擴增結(jié)果的影響由大到小依次是：引物> Mg2+>dNTP>DNA>Taq DNA聚合酶；方差分析結(jié)果與極差分析結(jié)果一致，且每個因素對擴增結(jié)果均有極顯著影響。

圖4 引物UBC810與不同云生毛茛個體的擴增結(jié)果

圖5 引物（UBC812）不同退火溫度下的擴增結(jié)果

表5 篩選所得引物及其最適退火溫度

引物是影響云生毛茛ISSR擴增反應(yīng)最大的因子，引物濃度低會降低ISSR體系的擴增效率，濃度過高則會引起錯配和非特異性擴增，并容易形成引物二聚體。該結(jié)論與雜交油菜［21］的ISSR體系建立等研究結(jié)果一致。Mg2+濃度過高，PCR擴增反應(yīng)特異性降低，會出現(xiàn)非特異擴增，濃度過低會降低Taq DNA聚合酶活性，降低ISSR體系的擴增效率。Mg2+對云生毛茛ISSR-PCR擴增結(jié)果同樣有極顯著影響，但其影響力小于引物。而在黔產(chǎn)寬葉纈草［22］、紫云英等［23］ISSR擴增體系中，Mg2+對擴增結(jié)果影響最大。說明在不同物種，各影響因素對擴增結(jié)果影響不同。通過對影響擴增結(jié)果的主要因素進行優(yōu)化篩選，建立針對研究物種的最佳反應(yīng)體系是十分必要的。優(yōu)化獲得的體系對不同樣品均能獲得清晰明亮，豐富高，重復(fù)性好的擴增結(jié)果，證明該體系適合云生毛茛ISSR-PCR擴增。

同一引物在不同物種的ISSR擴增體系中最適退火溫度也各不相同，甚至差異巨大。如引物UBC810在本實驗中對云生毛茛ISSR-PCR擴增反應(yīng)的最適退火溫度為52.2℃，而在瓜蔞［24］的ISSR-PCR反應(yīng)體系中，最適退火溫度為53.6℃，在長葉紅砂［25］的ISSR-PCR擴增體系中的最適退火溫度為48℃。因此應(yīng)在理論退火溫度的基礎(chǔ)上，針對不同物種對引物的退火溫度進行適當(dāng)?shù)暮Y選與調(diào)整，以期獲得穩(wěn)定可靠的擴增圖譜。

4 結(jié)論

采用正交實驗設(shè)計，對實驗結(jié)果進行直觀分析、極差分析和方差分析，確定了模板DNA、Mg2+、Taq DNA聚合酶、引物、dNTP五個主要因素對云生毛茛ISSR-PCR擴增的影響力大小及最佳用量，最終確定云生毛茛ISSR-PCR的最佳反應(yīng)體系為：20 μL反應(yīng)體系中，包含模板DNA 30 ng，Mg2+1.95 mmol/L，Taq DNA聚合酶0.04 U/μL，引物0.5 μmol/L，dNTP 0.15 mmol/L；通過對循環(huán)次數(shù)和延伸時間的優(yōu)化確立云生毛茛ISSR-PCR擴增的最佳反應(yīng)程序，即為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，49.6-60.6℃復(fù)性1 min，72℃延伸100 s，共38個循環(huán)；72℃下再延伸6 min。驗證實驗表明，該體系穩(wěn)定可靠，適于云生毛茛的ISSR-PCR擴增。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of ISSR-PCR Reaction System on Ranunculus nephelogenes var. nephelogenes and Primer Selection

SHI Lin1，2HU Yan-ping1WANG Jian-ke1，2WANG Jun1，2XU Xiao-ning3LI Yi1WANG Li1
（1. Northwest Institute of Plateau Biology，Chinese Academy of Sciences，Xining 810001；2. University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049；3. Technology Extension Stations of Township Enterprises of Qinghai Province，Xining 810008）

This work is aimed to establish a stable ISSR-PCR system for Ranunculus nephelogenes var. nephelogenes. A L16（45）orthogonal design was used to screen 5 main parameters（Mg2+，dNTP，Taq DNA polymerase，primer，and template DNA）；then the process of ISSR-PCR reaction was optimized，and consequently the optimal reaction system and amplifying procedure for R. nephelogenes var. nephelogenes was established；further，the optimized reaction system and amplifying procedure was verified. Results showed that the optimal concentrations in 20 μL reaction mixture were template DNA 30 ng，Mg2+1.95 mmol/L，Taq DNA polymerase 0.04 U/μL，dNTP 0.150 mmol/L，and primer 0.5 μmol/L. The optimal reaction procedure was：pre-denaturalization for 5 mins at 94℃，denaturalization for 20 s at 94℃，renaturation for 1 min at 49.6-60.6℃，followed by 38 cycles of extension for 100 s at 72℃，and final extension for 6 min at 72℃. Under the above optimized reaction system and procedure，16 amplified primers were screened from 100 ISSR primers，and the optimal annealing temperature for each primer was determined. Verification in R. nephelogenes var. nephelogenes of different populations with the optimized ISSR system confirmed that bands amplified were clear and steady，thus the established ISSR-PCR could favor further studies on the genetic diversity of R. nephelogenes var. nephelogenes.

Ranunculus nephelogenes var. nephelogenes；ISSR-PCR；orthogonal design；optimization of system；primer selection

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.09.010

2016-01-06

國家自然科學(xué)基金項目（31300269），青海（應(yīng)用）基礎(chǔ)研究計劃項目（2013-Z-756）

石琳，女，碩士研究生，研究方向：植物生物技術(shù)；E-mail：silvia20@163.com

王莉，女，博士，副研究員，研究方向：植物遺傳資源與繁育；E-mail：wangli@nwipb.cas.cn