劉亮澤， 岳瑞峰

(清華大學(xué) 微電子學(xué)研究所，北京 100084)

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基于單針三電極的動(dòng)態(tài)血糖傳感器研制

劉亮澤， 岳瑞峰

(清華大學(xué) 微電子學(xué)研究所，北京 100084)

摘要:研制了一種基于單根空心微針的新型植入式葡萄糖傳感器，用于對(duì)人體血糖變化趨勢(shì)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)。單根空心微針由結(jié)構(gòu)相同的兩個(gè)沿軸向磨去半邊的不銹鋼針管通過(guò)絕緣膠粘結(jié)而成，其分別作為傳感器的工作電極與輔助電極；參比電極是置于該微針通孔之中的Ag/AgCl細(xì)絲；葡萄糖氧化酶(GOD)置于針尖的通孔處。測(cè)試結(jié)果表明：傳感器的線性范圍為3～22 mmol/L，靈敏度為1.11 μA/mmol/L，響應(yīng)時(shí)間為10 s，且具有較好的抗干擾性。

關(guān)鍵詞:葡萄糖氧化酶； 葡萄糖傳感器； 連續(xù)監(jiān)測(cè)

0引言

糖尿病患者的血糖值受飲食、運(yùn)動(dòng)等的影響在一天中會(huì)有較大波動(dòng)，往往需要多次對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)以及時(shí)調(diào)整給藥量和治療策略。目前主要通過(guò)采指血的方法進(jìn)行體外血糖檢測(cè)，每天多次檢測(cè)無(wú)疑會(huì)給患者帶來(lái)劇痛和諸多不便。近年來(lái)，用于實(shí)時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)的血糖傳感器已經(jīng)成為研發(fā)的熱點(diǎn)，其中,針型葡萄糖傳感器由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、可植入性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛的關(guān)注[1-5]。由于體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜多變和電活性物質(zhì)的干擾，如何增強(qiáng)傳感器的抗干擾能力、提高靈敏度和響應(yīng)時(shí)間與線性范圍等已成為植入式檢測(cè)研發(fā)的重點(diǎn)[6～8]。前期曾報(bào)道過(guò)一種基于微針陣列的連續(xù)監(jiān)測(cè)葡萄糖傳感器[9]，其采用三根微針組成的三電極結(jié)構(gòu)，分別用作工作電極、輔助電極和參比電極；測(cè)試結(jié)果表明其具有很好的抗干擾性與線性范圍，鑒于三根微針之間的間距設(shè)置的比較大(2 mm)，靈敏度(0.575 μA/mm)和響應(yīng)時(shí)間(16 s)等性能還有待改進(jìn)。

為了進(jìn)一步提高靈敏度、降低響應(yīng)時(shí)間并減小刺入創(chuàng)口與疼痛，本文研制了一種由三電極結(jié)構(gòu)組成的單針葡萄糖傳感器。單針結(jié)構(gòu)不僅可以進(jìn)一步降低對(duì)人體的刺入創(chuàng)傷，且因大大縮小了電極間距而提升了靈敏度、降低了響應(yīng)時(shí)間。三電極體系可構(gòu)成差分結(jié)構(gòu)，能夠有效排除一些人體內(nèi)電活性物質(zhì)對(duì)傳感器的干擾，有利于提高抗干擾性。

1原理與設(shè)計(jì)

1.1傳感器工作原理

本文設(shè)計(jì)的葡萄糖傳感器是基于酶促反應(yīng)[10]來(lái)實(shí)現(xiàn)葡萄糖的電化學(xué)檢測(cè)的。葡萄糖在葡萄糖氧化酶(GOD)的催化作用下可被氧分子氧化生成葡萄糖酸和過(guò)氧化氫(H2O2)，而H2O2濃度與待測(cè)葡萄糖濃度之間具有嚴(yán)格的化學(xué)計(jì)量關(guān)系。通過(guò)電學(xué)方式測(cè)量H2O2的產(chǎn)生量即可獲得待測(cè)葡萄糖的濃度信息,其反應(yīng)原理如圖1所示。

在酶膜層發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)式為

(1)

在一定電位下，金屬Pt對(duì)H2O2具有催化分解作用，電極處發(fā)生的反應(yīng)式為

(2)

圖1　酶電極工作原理圖Fig 1　Working principle diagram of enzyme electrode

產(chǎn)生的電荷轉(zhuǎn)移到酶電極會(huì)形成電流，電流大小與H2O2濃度呈正比，從而可以得出其與葡萄糖濃度的關(guān)系。

1.2結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

設(shè)計(jì)的葡萄糖傳感器如圖2所示的單根空心微針上的三電極結(jié)構(gòu)。其中，單根空心微針是采用結(jié)構(gòu)相同的兩個(gè)沿軸向磨去半邊的不銹鋼針管通過(guò)絕緣硅橡膠粘結(jié)組裝而成，在室溫下4 h即可固定牢固，其分別作為傳感器的工作電極與輔助電極，它們的表面均濺射有Ti/Pt金屬薄膜；參比電極是置于該微針通孔之中的Ag/AgCl細(xì)絲；葡萄糖氧化酶置于空心微針針尖的通孔處以防止在刺入過(guò)程中導(dǎo)致酶膜的脫落。輔助電極與工作電極之間的區(qū)別僅在于工作電極針尖上的葡萄糖氧化酶具有活性，而輔助電極針尖上的葡萄糖氧化酶已經(jīng)失活。通過(guò)這種三電極差分的形式可望有效去除體內(nèi)一些電活性物質(zhì)的干擾，提高傳感器測(cè)試的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

圖2　單針三電極結(jié)構(gòu)示意圖Fig 2　Diagram of single needle with three electrodes structure

2傳感器的制備

2.1工作電極和輔助電極的制備

首先，將數(shù)根外徑為450 μm且表面濺射了20 nm/200 nm厚Ti/Pt薄膜的不銹鋼空心微針固定在模具之中，借助模具沿與針管軸心平行的方向研磨微針，直至磨去1/2針管為止。將這些微針取出后，分別侵入丙酮、無(wú)水乙醇和去離子水中進(jìn)行超聲清洗。待烘干后，將微針?lè)湃肓姿猁}緩沖液中加100 mV/s低電壓進(jìn)行循環(huán)掃描，使微針中的電活性雜質(zhì)溶出，直至響應(yīng)電流穩(wěn)定為止。這些結(jié)構(gòu)相同的微針將作為工作電極或輔助電極備用。

本文采用戊二醛—牛血清蛋白交聯(lián)法對(duì)葡萄糖氧化酶進(jìn)行固定。戊二醛的醛基可以與蛋白質(zhì)的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)，形成交聯(lián)薄膜實(shí)現(xiàn)GOD在電極的固定。實(shí)驗(yàn)中取GOD(活性為340 U/mg)按1.8 mg分裝成若干份，置于-4 ℃冷藏保存。使用時(shí)，用磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)配置，使其活性達(dá)到6.8 U/μL。取GOD(活性為6.8 U/μL)、牛血清蛋白BSA和2 %的戊二醛溶液，按溶液體積比5︰5︰1的比例混合(GOD與BSA先混合后，再加入戊二醛溶液)并搖勻[11]。將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的上述微針電極的斷面凹腔朝上置于潔凈的橡膠墊上。用移液槍將少量配置好的GOD溶液涂覆在針尖處的凹腔之中，然后將其置于室溫潔凈的培養(yǎng)皿中靜置2 h晾干，并在4 ℃下儲(chǔ)存。

雖然輔助電極的形狀、材質(zhì)與工作電極完全相同，同時(shí)也敷有GOD，但其氧化酶是處于失活狀態(tài)的。由于GOD的最佳工作溫度為30～50 ℃，70 ℃以上GOD會(huì)逐漸失去活性。因此，本文采用加熱法處理固定在輔助電極針尖處的GOD，通過(guò)循環(huán)伏安測(cè)試發(fā)現(xiàn)其已沒(méi)有明顯的氧化還原峰值，說(shuō)明其涂覆的GOD已經(jīng)失活。所以，設(shè)計(jì)的輔助電極測(cè)得的電流應(yīng)僅是溶液中的背景電流，不會(huì)產(chǎn)生響應(yīng)電流。

2.2Ag/AgCl參比電極的制備

采用電解法制備Ag/AgCl參比電極。首先用細(xì)砂紙對(duì)直徑為150 μm的實(shí)心銀絲進(jìn)行打磨以去除表面的氧化物。然后用去離子水將濃度為37 %的濃鹽酸稀釋至0.1 mol/L，并將處理后的Ag絲作為陽(yáng)極侵入稀釋后的濃鹽酸中，陰極也固定Ag絲置于溶液之中。在兩電極間施加5 V電壓，避光電解5 min，即可制備出致密均勻的白色Ag/AgCl參比電極。將陽(yáng)極制備好的Ag/AgCl細(xì)絲取出，用去離子水清洗后，置于飽和的KCl溶液中避光保存。

2.3傳感器的組裝

首先在針尖上固定有GOD的工作電極與輔助電極的半圓凹槽內(nèi)與研磨斷面處分別涂覆一薄層絕緣硅橡膠，然后將工作電極與輔助電極分別貼覆在Ag/AgCl參比電極兩側(cè)形成如圖2所示結(jié)構(gòu)，并放于潔凈培養(yǎng)皿中室溫固化24 h。各電極之間的絕緣由涂覆的絕緣硅橡膠完成，待完全固化后，在微針后端引線以備測(cè)試使用。

3傳感器性能測(cè)試

3.1電極循環(huán)伏安測(cè)試

將傳感器微針電極侵入1 mmol/L的葡萄糖溶液中，在工作電極和參比電極之間施加-0.3～0.9 V、變化速率為100 mV/s的三角波電壓，并記錄電流變化，如圖3所示。從圖中可明顯看出:電極的氧化還原峰值出現(xiàn)在0.7 V附近，故以后的測(cè)試均以0.7 V電壓作為最佳反應(yīng)電壓。

圖3　工作電極循環(huán)伏安曲線Fig 3　Cyclic voltammetric curve of working electrode

3.2滴加響應(yīng)臺(tái)階測(cè)試

為了保證實(shí)驗(yàn)環(huán)境接近人體環(huán)境，所有體外實(shí)驗(yàn)均在37 ℃的恒溫水浴池中進(jìn)行。將微針探頭侵入6 mL的PBS溶液中，對(duì)工作電極和輔助電極均施加0.7 V電壓。待電流響應(yīng)穩(wěn)定后開始計(jì)時(shí)，每隔3 s向溶液中滴加一定量濃度為30 mmol/L的葡萄糖溶液，被測(cè)試溶液每次濃度變化為1 mmol/L。測(cè)得的傳感器的響應(yīng)曲線如圖4所示，至第22次滴加時(shí)傳感器響應(yīng)均變化明顯，繼續(xù)滴加溶液響應(yīng)趨于飽和，整體趨勢(shì)符合Michaelis-Menten的酶?jìng)鞲衅魈匦?，其線性范圍在22 mmol/L左右。

圖4　滴加響應(yīng)曲線Fig 4　Dropwise response curve

3.3線性范圍和靈敏度測(cè)試

將微針探頭侵入一定量的PBS緩沖溶液中，施加0.7 V電壓，待響應(yīng)電流穩(wěn)定后，開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。葡萄糖傳感器在不同濃度的葡萄糖溶液中的響應(yīng)電流如圖5所示。通過(guò)線性擬合法分析響應(yīng)曲線，可以得出擬合方程為Y=1.11X+2.13,校正決定系數(shù),R2=0.998 7。從而可以得出:該傳感器的零位為2.13 μA，靈敏度為1.11 μA/mmol/L，線性范圍為3～22 mmol/L。

圖5　傳感器對(duì)不同濃度葡萄糖溶液的響應(yīng)曲線Fig 5　Response curve of sensor to glucose solution with different concentration

3.4響應(yīng)時(shí)間測(cè)試

傳感器的響應(yīng)時(shí)間是表征其性能的重要參數(shù)。測(cè)試時(shí)先將葡萄糖傳感器侵入在3 mmol/L的葡萄糖溶液中，待反應(yīng)穩(wěn)定后，向溶液中滴加一定高濃度的葡萄糖溶液，并做稍許攪拌，此時(shí)溶液濃度可以迅速提升達(dá)到10 mmol/L。由加入溶液后開始反應(yīng)到其響應(yīng)電流穩(wěn)定，所經(jīng)歷時(shí)間約為10 s，如圖6所示。

圖6　傳感器響應(yīng)時(shí)間曲線Fig 6　Response time curve of sensor

4抗干擾能力測(cè)試

人體正常的血糖變化范圍為3.9～6.1 mmol/L(空腹)，本文取6 mmol/L葡萄糖溶液作為測(cè)試基液。先將葡萄糖傳感器置于6 mL的PBS基液中，待響應(yīng)穩(wěn)定后開始測(cè)試。30 s后滴加一定量30 mmol/L的葡萄糖溶液，此時(shí)基液濃度可達(dá)6 mmol/L。90 s后滴加一定量濃度(0.2 mmol/L)的抗壞血酸溶液。從測(cè)試結(jié)果可以看出:三電極結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的干擾電流為0.65 μA，沒(méi)有輔助電極的雙電極結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的干擾電流為3.71 μA，如圖7所示，說(shuō)明三電極結(jié)構(gòu)傳感器具有較強(qiáng)的抗干擾能力。

圖7　抗壞血酸對(duì)葡萄糖傳感器的影響Fig 7　Effects of ascorbic acid on glucose sensor

5結(jié)論

本文提出了一種基于單微針三電極結(jié)構(gòu)的新型葡萄糖傳感器，通過(guò)對(duì)初期樣品進(jìn)行體外測(cè)試評(píng)價(jià)結(jié)果表明:該傳感器的線性范圍為3～22 mmol/L并具有較強(qiáng)的干擾能力；單針結(jié)構(gòu)中的電極間距變小直接導(dǎo)致了響應(yīng)時(shí)間更短、靈敏度更高；以針壁作為電極，氧化酶覆在針尖凹腔之中，探針刺入皮膚時(shí)可望有效保護(hù)GOD以免其脫落，而采用單針結(jié)構(gòu)則能在很大程度上減少傳感器刺入時(shí)造成的創(chuàng)傷。

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Study and fabrication of dynamic glucose sensor based on single needle with three electrodes

LIU Liang-ze, YUE Rui-feng

(Institute of Microelectronics,Tsinghua University,Beijing 100084,China)

Abstract:A new type of implantable glucose sensor based on hollow micro-needle is studied and fabricated used for continuous monitoring on human blood glucose concentration.The hollow micro-needle is constituted by two same slot-type stainless steel needles used as working electrode and auxiliary electrode respectively,which glued together with silicone rubber,a Ag/AgCl filament is placed in the hollow micro-needle as reference electrode,and glucose oxidase is placed on the tip of the micro-needle.The experimental results show that linear range of the sensor is 3～22 mmol/L with glucose concentration,sensitivity is 1.11 μA/mmol/L,response time is 10s,and with good anti-jamming performance.

Key words:glucose oxidase(GOD); glucose sensor; continuous monitoring

DOI:10.13873/J.1000—9787(2016)02—0078—03

收稿日期：2015—05—26

中圖分類號(hào):TP 212.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1000—9787(2016)02—0078—03

作者簡(jiǎn)介:

劉亮澤(1989-)，男，北京人，碩士研究生，研究方向?yàn)樯飩鞲衅鳌?/p>