王翠峰 任美英 付玉華 楊麗

胸腹水液基薄層細(xì)胞涂片中Ki-67的表達(dá)聯(lián)合CA153、CYFRA211、CEA的檢測與胸腹水良惡性質(zhì)的相關(guān)性

王翠峰 任美英 付玉華 楊麗

目的 本實(shí)驗(yàn)通過選用單克隆抗體Ki-67標(biāo)記胸腹水液基薄層細(xì)胞涂片，并聯(lián)合定量分析CA153、CYFRA211及CEA等三項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物在胸腹水中的含量，對比這幾種檢測指標(biāo)的不同檢測組合的效能評價(jià)來鑒別胸腹水的良、惡性質(zhì)。方法 本實(shí)驗(yàn)共收集惡性組胸腹水標(biāo)本51例，良性組胸腹水標(biāo)本34例，對每份標(biāo)本部分采用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測液基薄層細(xì)胞涂片中Ki-67表達(dá)及半定量分析，其余部分檢測腫瘤標(biāo)志物CA153、CYFRA211及CEA的含量，后分別對4項(xiàng)指標(biāo)單獨(dú)及聯(lián)合檢測的不同組合進(jìn)行效能評價(jià)。結(jié)果 惡性組中胸腹水Ki-67的表達(dá)分析及CYFRA211、CEA含量均高于良性胸腔積液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在效能評價(jià)中，4個項(xiàng)目單獨(dú)檢測胸腹水時(shí)，敏感度和陰性預(yù)測值最低的是CA153、特異性最低的是CYFRA211、陽性預(yù)測值最低的是CEA。當(dāng)兩兩組合檢測中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，可達(dá)98.0%，但特異性最低。而Ki-67和CA153聯(lián)合檢測，特異性盡管最高，達(dá)76.4%，但敏感性卻最低，為88.3%。而在3項(xiàng)組合中，每種組合均可將敏感性提高到90.0%以上，但特異性卻比單項(xiàng)檢測或兩兩結(jié)合檢測的結(jié)果均低。而當(dāng)以上4項(xiàng)指標(biāo)共同聯(lián)合檢測時(shí)敏感度為100.0%，而特異性卻為幾種檢測方式中的最低，為44.1%。結(jié)論 分析所測結(jié)果，細(xì)胞免疫組化Ki-67的表達(dá)聯(lián)合CEA、CYFRA211檢測可將惡性胸腹水診斷的敏感性提高到98.0%，而特異性也可達(dá)到70.5%，從而成為在鑒別胸腹水良、惡性質(zhì)中最大互補(bǔ)作用的項(xiàng)目組合。

Ki-67；胸腹水；液基薄層細(xì)胞制片；免疫細(xì)胞化學(xué)染色；腫瘤標(biāo)志物

胸腹水是臨床上常見的一種并發(fā)癥，可由許多疾病引起，其中由于惡性腫瘤引起的胸腹水，是惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一個突出的臨床表現(xiàn)，約占所有胸腹水病因的10%～15%，患者出現(xiàn)惡性胸腹水常提示腫瘤已到終末期，預(yù)后極差[1]。故對于臨床來說，準(zhǔn)確判斷積液的性質(zhì)對疾病的診斷和治療至關(guān)重要。但目前對胸腹水性質(zhì)判斷仍未有較有效的方法。而本實(shí)驗(yàn)通過選用單克隆抗體Ki-67標(biāo)記經(jīng)液基薄層方法（TCT）制備的胸腹水的細(xì)胞學(xué)涂片，并聯(lián)合定量分析CA153、CYFRA211及CEA等3項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物在胸腹水中的含量，試通過對比這幾種檢測指標(biāo)的聯(lián)合檢測來尋求鑒別良、惡性胸腹水的客觀指標(biāo)，以指導(dǎo)臨床治療。

1 資料與方法

1.1 一般資料 實(shí)驗(yàn)所用的胸腹水標(biāo)本均來自內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院的檢驗(yàn)科細(xì)胞病理室，2011年1月～2012年6月入院且為初治的患者，同時(shí)最終診斷明確者85例，其中惡性胸腹水（惡性組）51例，男25例，女26例，年齡34～86歲，平均（61.36±9.1）歲，均經(jīng)胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查、閉式經(jīng)皮胸膜活檢、纖維支氣管鏡檢查、淺表淋巴結(jié)穿刺等檢查獲得病理組織學(xué)或細(xì)胞學(xué)依據(jù)而確診。良性胸腹水（良性組）34例，其中男18例，女16例，年齡33～80歲，平均（58.16±10.7）歲，良性組均根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、胸腹水細(xì)菌性檢查、結(jié)核菌素試驗(yàn)、X線胸片或胸部CT檢查、閉式經(jīng)皮胸膜活檢臨床相關(guān)資料的綜合分析確定診斷。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)本采集 取臨床新鮮抽取的胸腹水100～200 mL,分裝5～10mL標(biāo)本用于3項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的定量檢測，其余量用于細(xì)胞涂片的制作。

1.2.2 制作液基涂片 將收集到的新鮮的胸腹水標(biāo)本混勻后離心，棄去上清將約1～2mL沉淀物加入到EasyFix細(xì)胞固定液中，按TCT制片方法進(jìn)行制片，每一份標(biāo)本至少制片5張。取1～2張玻片標(biāo)本進(jìn)行瑞氏染色，其余的通過乙醇固定液固定20 min用于免疫細(xì)胞化學(xué)染色。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色 惡性組和良性組的玻片標(biāo)本均采用免疫組化SP法，以PBS液代替一抗作陰性對照，陽性對照用已知Ki-67陽性的肺癌切片作。按照試劑說明書操作步驟進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。鼠抗人Ki-67單克隆抗體（即用型）、即用型快捷免疫組化MaxVisionTM試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2.4 胸腹水中腫瘤標(biāo)志物CA153、CYFRA211及CEA含量檢測 采用化學(xué)發(fā)光法嚴(yán)格按照羅氏全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀和試劑的SOP文件和使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.5 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 單克隆抗體Ki-67主要定位于增殖期的細(xì)胞核。細(xì)胞核呈棕黃色顆粒即為Ki-67陽性表達(dá)，陰性細(xì)胞的細(xì)胞核被蘇木素復(fù)染為藍(lán)紫色。每張玻片隨機(jī)計(jì)數(shù)10個高倍視野（×200）進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：陽性細(xì)胞標(biāo)記指數(shù)(labeling index,LI)=視野陽性細(xì)胞數(shù)/100×100%，分組統(tǒng)計(jì)時(shí)采用平均標(biāo)記指數(shù)(MLI)。再用捷達(dá)801圖像分析系統(tǒng)分別測定良性組和惡性組胸腹水中陽性細(xì)胞面積積分光密度值（area integrated optical density,AIOD），用陽性積分光密度值/ μm2表示Ki-67蛋白表達(dá)的相對含量，每張涂片在光學(xué)顯微鏡高倍視野下，隨機(jī)測2個單位面積，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.6 標(biāo)志物檢驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn) 各項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物正常值分別為：CEA<9.8ng/mL，CYFRA211：<3.3ng/mL，CA153<28U/mL，超過正常值即判斷為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對于Ki-67的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用“%”表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。因腫瘤標(biāo)志物的數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布資料，故統(tǒng)計(jì)腫瘤標(biāo)志物水平用中位數(shù)±四分位數(shù)間距表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 惡性組與良性組的一般臨床資料比較 2組患者在性別和年齡構(gòu)成上均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1、表2。

表1 惡性組與良性組性別構(gòu)成比較

表2 惡性組與良性組年齡比較（x±s）

2.2 胸腹水良、惡性組免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測Ki-67表達(dá)結(jié)果 51例惡性胸腹水標(biāo)本中42例見到Ki-67抗原的陽性表達(dá)，表達(dá)的陽性率為82.3%；良性組的僅為11.7%，且均為弱表達(dá)，二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表3、表4。后經(jīng)圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果顯示胸腹水中ki-67陽性細(xì)胞平均標(biāo)記指數(shù)（MLI）結(jié)果以及陽性細(xì)胞的面積積分光密度值均顯示出良性組與惡性組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表5、表6。

表3 良惡性胸腹水中Ki-67表達(dá)的結(jié)果

表4 良惡性胸腹水中Ki-67免疫組化染色結(jié)果

表5 良惡性胸腹水中Ki-67陽性細(xì)胞MLI結(jié)果（x±s）

表6 Ki-67在良惡性胸腹水中陽性細(xì)胞面積積分光密度值（x±s）

2.3 胸腹水良、惡性組腫瘤標(biāo)志物水平比較 惡性組中胸腹水CEA、CYFRA211均高于良性胸腔積液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而CA153在良、惡性胸腹水中的測定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表7。

表7 良、惡性胸腔積液組胸水腫瘤標(biāo)志物水平比較（M±Q）

2.4 單項(xiàng)檢測胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的效能評價(jià) 胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的四項(xiàng)檢測項(xiàng)目中敏感度最低的是CA153、特異性最低的是CYFRA211、陽性預(yù)測值最低的是CEA、陰性預(yù)測值最低的是CA153。見表8。

表8 單項(xiàng)待測的敏感性、特異性、準(zhǔn)確度和陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值

2.5 聯(lián)合檢測胸腹水中CEA、CA153、CYFRA211及Ki-67的效能評價(jià) 將4項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行多種組合，以良性胸腹水組為對照組，分別計(jì)算兩兩組合、3項(xiàng)組合、4項(xiàng)組合的敏感性、特異性、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值。試驗(yàn)中只要有一個試驗(yàn)呈現(xiàn)陽性即診斷為陽性。在兩項(xiàng)組合檢測中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，可達(dá)98.0%，但特異性最低，為67.6%。而Ki-67和CA153聯(lián)合檢測，特異性盡管最高，達(dá)76.4%，但敏感性卻最低，為88.3%。而在3項(xiàng)組合中，每種組合均可將敏感性提高到100.0%以上，但特異性卻比單項(xiàng)檢測或兩兩結(jié)合檢測的結(jié)果均低。見表9。

表9 聯(lián)合試驗(yàn)檢測胸腹水中待測指標(biāo)的敏感性、特異性、陽性預(yù)值、陰性預(yù)測值

3 討論

胸腹水在臨床上較常見，引起胸腹水的原因有多種，通過體格檢查和影像學(xué)檢查難以對其良性惡性進(jìn)行有效地鑒別診斷。常規(guī)胸腹腔穿刺可以抽取胸腹水進(jìn)行常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)方面的檢查，但各有不足之處。這就迫切要求人們尋找一種有效地方法，來準(zhǔn)確鑒別良、惡性胸腹水。

Ki-67即細(xì)胞核相關(guān)抗原（nuclear-associatedantigen, ki-67），其功能目前認(rèn)為與細(xì)胞有絲分裂有關(guān)，其高表達(dá)是細(xì)胞增殖活躍的重要標(biāo)記，檢測該抗原的表達(dá)有助于判斷腫瘤的生物學(xué)特性[1-2]。本實(shí)驗(yàn)利于免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測了51例惡性胸腹水和34例良性胸腹水的液基細(xì)胞涂片標(biāo)本中Ki-67陽性表達(dá)情況。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理表明：在惡性胸腹水和良性胸腹水的液基細(xì)胞涂片中，Ki-67的細(xì)胞表達(dá)數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），在進(jìn)行Ki-67 AIOD定量測定中，惡性胸腹水相對含量明顯高于良性胸腹水，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。引起惡性胸腹水的絕大多數(shù)原因是腫瘤栓子種植于臟層胸膜、壁層胸膜或腫瘤胸腹膜轉(zhuǎn)移，故胸腹水中富含腫瘤或核異質(zhì)細(xì)胞，導(dǎo)致Ki-67在異常增生的腫瘤細(xì)胞或核異質(zhì)細(xì)胞中明顯表達(dá)，而正常的細(xì)胞中幾乎無或很少表達(dá)[3]。而在胸腹水中少數(shù)間皮細(xì)胞見弱表達(dá)，可能與腫瘤或炎性等因素的刺激下，間皮細(xì)胞增生活躍，導(dǎo)致Ki-67的表達(dá)增加。

雖然免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示多數(shù)惡性胸腹水中有Ki-67蛋白的表達(dá)，但仍有部分標(biāo)本細(xì)胞中未見表達(dá)，從而使得Ki-67表達(dá)的敏感性只達(dá)到82.3%，特異性只有88.2%?？赡茉蛴校河捎贙i-67的表達(dá)具有細(xì)胞周期的依賴性，僅在細(xì)胞的G1后期出現(xiàn)，S、G2期升高，M期達(dá)峰值，G0期消失，如果腫瘤細(xì)胞處于細(xì)胞周期的G0期或G1的前期則無法檢測到Ki-67的表達(dá)。另外，常規(guī)檢測Ki-67表達(dá)所使用的標(biāo)本多為組織切片，而本課題所使用的標(biāo)本是通過TCT所制的脫落細(xì)胞學(xué)涂片，它的優(yōu)勢在于可以使細(xì)胞分散，大細(xì)胞團(tuán)少，背景干凈，減少了背景中的非特異性著色[4]，但劣勢在于標(biāo)本在收集和處理時(shí)，可能存在細(xì)胞中的抗原丟失，導(dǎo)致無法檢測到Ki-67或表達(dá)較弱。所以為了提高診斷方法的敏感度、特異度及準(zhǔn)確率，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了免疫細(xì)胞化學(xué)染色與腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測。

腫瘤標(biāo)志物（Tumor marker）是存在于細(xì)胞、體液或組織中的，由腫瘤自分泌產(chǎn)生或腫瘤與宿主機(jī)體相互作用產(chǎn)生的一類物質(zhì)，反映了惡性腫瘤的產(chǎn)生和發(fā)展過程及癌基因的活化程度。本課題所選擇的3個腫瘤標(biāo)志物包括CEA、CFYRA211、CA153。癌胚抗原（CEA）最初發(fā)現(xiàn)于成人結(jié)腸癌組織中，是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的可溶性糖蛋白。多數(shù)研究證實(shí)，細(xì)胞癌變時(shí)，相應(yīng)染色體上的基因發(fā)生阻抑，致使原來被阻抑的基因在癌組織中重新活躍并產(chǎn)生CEA[5]。由于CEA的分子量大，在胸腔內(nèi)形成的CEA不易進(jìn)入血液循環(huán)，且未經(jīng)肝臟代謝，因此惡性胸腔積液中CEA較高，出現(xiàn)也早。肺腺癌引起的胸腔積液中CEA升高最為明顯，CEA對良惡性胸腹腔積液的鑒別有一定價(jià)值，但CEA有時(shí)在一些正常人及良性腫瘤患者的血清中也有不同程度的升高，本研究中CEA的敏感性為72.6%，特異性為79.4%，比其它研究結(jié)果稍偏低。

細(xì)胞角蛋白19片段（CYFRAF21-1）是一種酸性多肽，主要分布在肺泡上皮。當(dāng)這些細(xì)胞發(fā)生癌變時(shí)，可釋放CYFRA21-1進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致CYFRA21-1的血清水平升高。J.Niklinski等[6]研究顯示：CYFRA211對鱗癌的敏感性（76.5%）較腺癌（47.8%）和SCLC（42.1%）顯著增高（P<0.01,P<0.05）。它對非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的早期診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后判斷均有重要意義。我們對胸水中的CYFRA211進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，惡性胸腹水中的水平較良性組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

CA153是一種由腺體分泌的粘蛋白，可以存在于多種腺癌內(nèi)，如乳癌、卵巢癌、胰腺癌等，臨床上常用于乳癌及卵巢癌的檢測[7]。近年來對CA153在肺癌診斷中的作用已有報(bào)道，本研究顯示其在胸水中敏感度較低，僅為43.2%，而特異性較高，為88.2%?？紤]可能因?yàn)橄嚓P(guān)研究的惡性胸腔積液包含多例乳腺癌轉(zhuǎn)移至胸膜病例，而本研究病例中乳腺癌的病例數(shù)較少，也可能對統(tǒng)計(jì)結(jié)果有一定影響，可做為一種聯(lián)合檢測指標(biāo)。

本研究顯示單項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物的檢測有一定局限，為了克服單項(xiàng)檢測的不足，本研究組將細(xì)胞免疫組化聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行胸腹水的良、惡性質(zhì)的判斷，經(jīng)過對數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析顯示，在兩項(xiàng)組合檢測中Ki-67和CYFRA211的敏感性最高，但特異性最低。而Ki-67和CA153聯(lián)合檢測，特異性盡管高，但敏感性卻很低。而在3項(xiàng)組合中，每種組合均可將敏感性提高到90%以上，但特異性卻比單項(xiàng)檢測或兩兩結(jié)合檢測的結(jié)果均低，經(jīng)對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，本研究組在Ki-67聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物檢測結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)Ki-67聯(lián)合CEA和CYFRA211的敏感性和特異性均不是最高，但敏感性可達(dá)98%，而特異性在所有檢測組合選擇中位于偏高水平，可達(dá)70.5%，這3項(xiàng)組合是我們所選擇的敏感性及特異性均理想的組合檢測。

本研究的結(jié)論表明細(xì)胞免疫組化Ki-67的表達(dá)聯(lián)合腫瘤標(biāo)志物比單項(xiàng)檢測在鑒別良、惡性胸腹水上有更高的敏感性和較好的特異性。而在聯(lián)合檢測中，尤以Ki-67聯(lián)合CEA、CYFRA211檢測可將惡性胸腹水診斷的敏感性提高到98%，而特異性也可達(dá)到70.5%，從而成為在鑒別胸腹水良、惡性質(zhì)中最大互補(bǔ)作用的檢測項(xiàng)目組合，進(jìn)而使臨床減少漏診率和誤診率。

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Objective In this study, the choice of ki-67 monoclonal antibody marked pleural effusion and ascites’s cells smears by Thinlayer cytology test, and combining the quantitative analysis of joint CA153, CYFRA211 and CEA, such as three levels of tumor marker in pleural effusion and ascites, Comparative Effectiveness evaluation of combination of several different detection indicators to identify benign and malignant nature of pleural effusion and ascites. Methods In this study, samples were collected of 51 cases of malignant pleural and peritoneal effusions as the malignant group, and collected of 34 cases of benign pleural and peritoneal effusions as the benign group. Part of each samples Use immunohistochemical staining method to detect expression of Ki-67 in cells smears of malignant group and benign group by Thin-layer cytology test and semi-quantitative analysis. At the same time, the rest of the detection of tumor markers CA153, CYFRA211content CEA , Then each of the four indicators alone or in various combinations were detection effectiveness evaluation. Results Ki-67 expression and CYFRA 211, CEA levels In malignant group were higher than benign group, the difference was significant difference (P<0.05). In the evaluation of effectiveness, When four project testing pleural and peritoneal effusions alone, Sensitivity and negative predictive value is the lowest CA153, specificity is the lowest CYFRA211, positive predictive value is the lowest CEA. When pairwise combinations of the highest sensitivity in the detection is CYFRA211 and Ki-67, and up to 98.0%, but the specificity is low. Ki-67 and CA153 in specificity despite the highest, to 76.4%, but the sensitivity is lowest at 88.3%. In the three combinations, each combination may increase the sensitivity to 90.0%, but the specificity than single test or the results of pairwise binding assays were low. The sensitivity of the above four indicators together when combined detection of 100.0%, while specificity was detected in several ways to the lowest, to 44.1%. Conclusion Analysis of measured results, the expression of cell immunohistochemistry ki-67 Joint CEA, CYFRA211 detection sensitivity can be improved diagnosis of malignant pleural effusion to 98.0%, specificity can also be reached 70.5%, become the largest combination of complementary role in differentiating nature of benign pleural effusion and malignant.

Ki-67; Pleural effusion and ascites; Thin-layer cytology test; Immunohistochemical staining method; Tumor marker

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.001

包頭市社會發(fā)展科技支撐項(xiàng)目 （2011S2012-01-9）

內(nèi)蒙古 014010 內(nèi)蒙古包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 （王翠峰 任美英 付玉華 楊麗）