王利鋒 袁芳 樂濤 秦建波 何紅秋

無創(chuàng)基因檢測在胎兒染色體非整倍體診斷中的應(yīng)用

王利鋒 袁芳 樂濤 秦建波 何紅秋

目的 評價無創(chuàng)基因檢測在胎兒染色體非整倍體診斷中的臨床應(yīng)用價值。方法 選取253例高齡孕婦，在知情同意的原則下采集外周血血漿,對其血漿中胎兒游離DNA進(jìn)行檢測；并與實驗孕婦的羊水染色體核型分析結(jié)果進(jìn)行比對驗證。結(jié)果 本試驗對253例樣本進(jìn)行了孕婦血漿胎兒游離DNA檢測，檢出21-三體陽性病例3例，檢出18-三體陽性病例1例，與染色體核型分析的結(jié)果一致。結(jié)論 無創(chuàng)基因檢測可以用于胎兒染色體拷貝數(shù)異常的檢測，具有無創(chuàng)、靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，在胎兒染色體拷貝數(shù)異常疾病的產(chǎn)前檢測中具有臨床實際應(yīng)用的價值。

高齡孕婦；染色體非整倍體異常；胎兒游離DNA；無創(chuàng)產(chǎn)前診斷

染色體非整倍體異常是指染色體數(shù)目不是相應(yīng)染色體組基數(shù)整倍數(shù)的狀態(tài)，其新生兒發(fā)病率約1‰～2‰。常以21、18、13-三體較為常見。其中以21-三體綜合征(又稱唐氏綜合征，Down’s syndrome或先天愚型)最為常見，新生兒發(fā)病率大約為1/600～1/800［1］。患兒通常都存在學(xué)習(xí)障礙、智能障礙或伴有臟器畸形等問題。目前對于該疾病的臨床檢測方法或假陽性比例較高，或存在一定的流產(chǎn)、致畸風(fēng)險，這使得患者依從性較差［2］，導(dǎo)致許多21、18、13-三體等非整倍體患兒出生。

隨著孕婦外周血中胎兒游離DNA逐漸被學(xué)者們證實，利用胎兒游離DNA進(jìn)行無創(chuàng)產(chǎn)前檢測越來越受到關(guān)注。該方法具有無創(chuàng)取樣、無流產(chǎn)風(fēng)險、高靈敏度及準(zhǔn)確性的特點［3］，可作為現(xiàn)有產(chǎn)前診斷技術(shù)的有益補充。在既往研究中，該方法常與唐氏血清學(xué)篩查方法進(jìn)行比較，而與染色體核型分析方法進(jìn)行比較的研究較少。本研究擬采用前瞻性研究策略，選取253例高齡孕婦，在早中孕期（孕13～26周）開展cff-DNA檢測，通過與臨床金標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)-染色體核型分析進(jìn)行比較，來對無創(chuàng)基因產(chǎn)前檢測技術(shù)的臨床應(yīng)用價值進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 研究對象 收集2013年2月～2014年5月重慶渝中地區(qū)因高齡妊娠和產(chǎn)前篩查高風(fēng)險等要求無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測的早、中孕期單胎孕婦253例，年齡35～46歲，孕周13～26周，平均（19.9±0.6）周。在知情同意的原則下采集孕婦靜脈血5mL，EDTA抗凝。

1.1.2 試劑與儀器 DNA提取試劑盒（天跟生化科技有限公司），T4多聚核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶（德國Qiagen公司）；Ampure Beads試劑盒（美國BeckmanCoulter公司），2100 Bioanalyzer（美國Agilent公司），Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit（Illumina公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取血漿DNA 將孕婦靜脈血于4℃、1600r/ min,離心10min，收集血漿后4℃、1600r/min，離心10min，取上層血漿，分裝，-80℃保存。以上操作在抽血后6h內(nèi)完成。參照DNA提取試劑盒操作說明書提取血漿中的DNA。

1.2.2 高通量測序文庫制備 (1)T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶將獲得的DNA片段修復(fù)成平末端、加“A”、加接頭、PCR富集，最終獲得用于高通量測序的DNA文庫。(2)使用Agilent 2100 Bioanalyzer對文庫質(zhì)量進(jìn)行分析，并使用real-time定量PCR對文庫進(jìn)行精確定量。按照要求進(jìn)行混合文庫（即Pooling）。

1.2.3 DNA測序 用Pooling后的文庫，經(jīng)C-bot橋式反應(yīng)擴增，在Illumina HiSeq平臺進(jìn)行大規(guī)?；虿⑿袦y序，獲得約百萬條短DNA序列reads。經(jīng)ELAND軟件將測序的數(shù)據(jù)與Ensemble數(shù)據(jù)庫的人類基因組參考序列進(jìn)行比對，獲得已去重復(fù)序列的參考序列上唯一位置的21、18、13號染色體的數(shù)目。每個樣本原始數(shù)據(jù)不得少于5×106個序列數(shù)，比對后獲得的唯一序列不得少于2×106個序列數(shù)。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［4］，每一母體血漿樣本中21、18、13號染色體序列數(shù)目與總的序列數(shù)目的比值。通過計算樣本待測染色體的比例與總體人群的比率之差，除以正常孕婦群染色體的標(biāo)準(zhǔn)方差，所得為Z值，若Z值大于或等于3，即認(rèn)為待測樣本為三體高危；反之若小于或等于3，則為單體高危。

1.2.4 胎兒染色體核型確診方法 采集上述早、中孕期單胎孕婦253例孕婦的羊水，由醫(yī)院婦產(chǎn)科產(chǎn)前診斷中心經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后G顯帶，再使用Video Test-Karyo 3.1(美國)全自動染色體分析系統(tǒng)進(jìn)行染色體核型分析。

2 結(jié)果

2.1 胎兒“21-三體綜合征”無創(chuàng)基因檢測 檢測出21-三體陽性樣本3例，陰性樣本250例。染色體核型分析結(jié)果檢測出21-三體陽性樣本3例，陰性樣本250例。與臨床金標(biāo)準(zhǔn)—核型分析相比，胎兒“21-三體綜合征”無創(chuàng)基因檢測的21-三體檢出率為100.00%，21-三體假陰性率為0.00%，21-三體假陽性率為0.00%，正確百分率為100.00%。見表1。

表1 21-三體兩種檢測方法的結(jié)果

2.2 胎兒“18-三體綜合征”無創(chuàng)基因檢 測檢測出18-三體陽性樣本1例，陰性樣本252例。染色體核型分析結(jié)果檢測出18-三體陽性樣本1例，陰性樣本252例。與臨床金標(biāo)準(zhǔn)—核型分析相比，胎兒“18-三體綜合征”無創(chuàng)基因檢測的18-三體檢出率為100.00%，18-三體假陰性率為0.00%，18-三體假陽性率為0.00%，正確百分率為100.00%。見表2。

表2 18-三體兩種檢測方法的結(jié)果

3 討論

無創(chuàng)產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷是婦產(chǎn)科基礎(chǔ)研究和臨床工作的關(guān)注熱點。目前常用的產(chǎn)前篩查和診斷方法有：臨床上14～20孕周進(jìn)行的“唐氏綜合征”血清學(xué)篩查、超聲NT篩查、羊水穿刺檢查、和臍帶血穿刺。血清學(xué)篩查法通過檢測孕婦外周血生化指標(biāo)綜合計算出21-三體、18-三體及13-三體的發(fā)病概率，臨床上各種生化篩查方法的檢出率僅為66%～80%不等（包括二聯(lián)、三聯(lián)、四聯(lián)篩查），漏檢20%～34%不等，且假陽性率高［5］，每100個唐篩高危的患者，僅有不到1%是真正的唐氏兒；超聲檢查高度依賴于檢測設(shè)備分辨率和醫(yī)生個人經(jīng)驗，難以形成統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且超聲檢查是對發(fā)育異常嚴(yán)重的畸變類型進(jìn)行的診斷，對超聲指標(biāo)不明確或有爭議的發(fā)育異常仍無法判斷。有創(chuàng)產(chǎn)前診斷技術(shù)（羊水穿刺檢查、臍血穿刺）準(zhǔn)確率高，為臨床的金標(biāo)準(zhǔn)，但有創(chuàng)取樣有0.5%～2%的流產(chǎn)風(fēng)險及1%左右的致畸風(fēng)險［6］，且容易導(dǎo)致破水、羊膜腔炎、陰道出血、胎兒刺傷、呼吸窘迫等并發(fā)癥。其中文獻(xiàn)報道的羊水穿刺、胎兒臍帶血穿刺的流產(chǎn)率分別為0.5%和2%［7］。

與目前臨床常用的篩查和診斷方法相比，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)基因檢測技術(shù)具有早孕期檢測、無創(chuàng)取樣、無流產(chǎn)風(fēng)險、高靈敏度以及高準(zhǔn)確度的特點［8］，另外胎兒DNA在孕早期就可以檢測到，且分娩后很快被清除，不會受到前次妊娠的影響，且不影響再次妊娠［9］。因此，對孕婦外周血中胎兒游離DNA的檢測及其臨床應(yīng)用研究將對無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測技術(shù)的發(fā)展產(chǎn)生重大影響。

本研究共檢測253例樣本，檢測出21-三體陽性樣本3例，陰性樣本250例；18-三體陽性樣本1例，陰性樣本252例。與臨床金標(biāo)準(zhǔn)—核型分析結(jié)果相比，胎兒無創(chuàng)基因檢測的21-三體和18-三體檢出率為100.00%，假陰性率為0.00%，假陽性率為0.00%，正確百分率為100.00%。

從以上數(shù)據(jù)中可以看出，運用胎兒“21-三體綜合征”無創(chuàng)基因檢測篩查21、18-三體與臨床核型結(jié)果之間無統(tǒng)計學(xué)差異，符合臨床檢測要求，其敏感性、特異性與核型分析技術(shù)具有較高的一致性。本技術(shù)具有無創(chuàng)性、高準(zhǔn)確性、高通量等優(yōu)勢，具有臨床實際應(yīng)用價值。建議針對高齡、高危孕婦，選取個體化的產(chǎn)前診斷策略，在早孕期充分利用cff-DNA檢測等新興高端技術(shù)，對胎兒染色體非整體異常做到早檢測、早診斷、早干預(yù)。至于在低危孕婦中的應(yīng)用，以及能否徹底代替唐氏血清學(xué)篩查，則需要更多衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)方面的研究。

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Objective To validate the clinical value of noninvasive gene Detection in fetal chromosomal aneuploidy diagnosis. Methods A total of 235 pregnant women with advanced maternal ages were screened for maternal plasma cell-free fetal DNA (cff-DNA) examination, and the results were then confirmed by karyotype analysis. Results Of the 253 women examined, cff-DNA screening detected chromosomal aneuploidy in 4 cases, including trisome-21 in 3 cases, trisome-18 in 1 case as confirmed subsequently by karyotype analysis. Conclusion Noninvasive gene examination is efficient for detecting fetal chromosomal aneuploidies, and is non-invasive highly sensitive and specific. It therefore has a practical clinical value.

Advanced maternal age; Chromosomal aneuploidy; Cell-free fetal DNA; Non-vasive prenatal diagnosis

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.6.003

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