張春煜 孟杰 徐大鵬 張亮

Robo 1蛋白在胃癌中的表達(dá)及臨床意義

張春煜 孟杰 徐大鵬 張亮

目的 研究跨膜蛋白Robo 1在胃癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。方法 免疫組化P-V法檢測54例胃癌和20例癌旁組織中Robo 1蛋白的表達(dá)情況及Robo 1蛋白在不同病理特征下的表達(dá)；用CD 34標(biāo)記微血管，計算微血管密度（microvessel density，MVD）探討胃癌組織中Robo 1與MVD的關(guān)系。結(jié)果 Robo 1蛋白在胃癌中的陽性表達(dá)率為70.37%，在癌旁組織中的陽性表達(dá)率為10.00%，兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.48，P＜0.05）。Robo 1蛋白的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，與腫瘤的大小、分化程度無關(guān)。Robo 1蛋白在胃癌組織中MVD為（24.74±2.59），與癌旁組織（18.10±1.71）相比顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.629，P＜0.05）。結(jié)論 胃癌中Robo 1蛋白表達(dá)增高，且與腫瘤的臨床病理特征有關(guān)，提示Robo 1蛋白在胃癌的形成過程中扮演著重要角色，胃癌中微血管密度增高可以推測出微血管的形成促進(jìn)了腫瘤的生長與侵襲。

胃癌；Robo 1蛋白；微血管密度（microvessel density，MVD）；免疫組組織化學(xué)

Robo 1蛋白是跨膜蛋白Roundabout家族中的一員，另外還有Robo 2、Robo 3、Robo 4，在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的是Robo 1、2、3，參與神經(jīng)細(xì)胞的遷移和調(diào)控神經(jīng)軸突延伸。而Robo 4在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面表達(dá)，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。此外，Robo家族在非神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要的作用，尤其在一些腫瘤中表達(dá)異常，Robo 1啟動子甲基化和轉(zhuǎn)錄子沉默等表觀遺傳學(xué)的改變，導(dǎo)致了Robo 1表達(dá)減少或缺失，提示腫瘤的發(fā)生發(fā)展與Robo 1失活有關(guān)，Robo 1是抑癌基因；也有學(xué)者的研究證實Slit 2/ Robo 1可以通過β-catenin/TCF、PI 3K/Akt信號通路及

CXCL 12/CXCR 4、MMPs等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗通過檢測Robo 1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)及微血管形成情況，探討Robo 1蛋白在胃癌形成中的可能的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2014年1月～2015年9月間遼河油田總醫(yī)院病理科胃癌切除術(shù)標(biāo)本54例，其中男32例，女22例，年齡39～78歲，平均年齡（45.05±3.73）歲。同時收集20例癌旁組織（距癌變部位邊界5 cm以外且經(jīng)病理證實無癌變的胃粘膜組織），所有患者術(shù)前均未接受化療及放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm。兔抗人多克隆抗體Robo 1（濃度

1︰50，購自Abcam公司），鼠抗人CD 34抗體由北京中衫公司提供，操作步驟按照P-V 9000試劑盒說明書進(jìn)行。對照：以PBS代替一抗作為陰性對照；已知陽性片（胃癌）作為陽性對照。

1.2.2 免疫組化結(jié)果判讀 Robo 1陽性染色為胞漿著色，以陽性細(xì)胞數(shù)百分率和染色強(qiáng)度得分之和進(jìn)行評分。高倍鏡下隨機(jī)選取5個視野。（1）按細(xì)胞染色深淺評分：0分，細(xì)胞不顯色；1分，淺黃色；2分，棕黃色；3分，棕褐色。（2）按陽性細(xì)胞比例評分：1分，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)<25%；2分，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)25%～50%；3分，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)51%～75%；4分，陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)>75%。兩值相加≥3分為陽性，＜3分為陰性。

CD 34判斷標(biāo)準(zhǔn)為：管腔小于8個紅細(xì)胞大小的微血管或由內(nèi)皮細(xì)胞形成的條索、腔隙狀，染色為棕黃色。首先低倍鏡（×10）下找到腫瘤組織血管最密集區(qū)域，高倍鏡（×40）下計數(shù)3個不重復(fù)視野內(nèi)的微血管數(shù)，取其平均值作為最終微血管密度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)和例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Robo 1蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)及MVD計數(shù)Robo 1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)率為70.37%，明顯高于癌旁組織（10.00%），兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=21.48，P＜0.05）。胃癌組織中微血管排列紊亂，大小不一，其MVD為（24.74±2.59）；癌旁組織的MVD為（18.10±1.71），兩者比較，差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義（t=10.629，P＜0.05）。見表1。

2.2 胃癌組織中Robo 1蛋白與MVD計數(shù)的關(guān)系 38例

Robo 1蛋白陽性表達(dá)者，其MVD為（23.16±2.11），陰性表達(dá)16例，其MVD計數(shù)為（17.94±1.18），兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=9.26,P＜0.05）。

表1 Robo 1蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達(dá)及MVD計數(shù)結(jié)果

2.3 胃癌組織中Robo 1蛋白與臨床病理特征的關(guān)系Robo 1蛋白與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，與腫瘤的大小及分化程度無關(guān)。見表2。

表2 Robo 1蛋白與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

許多研究已經(jīng)證實，Robo 1蛋白在不同的腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用[1]。Robo 1蛋白在口腔癌、直腸癌、惡性黑色素瘤等多種腫瘤組織中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，發(fā)揮著癌基因的作用[2-5]。在肺癌和乳腺癌中Robo 1蛋白通過交接趨化因子受體4及其配體下游靶向分子的磷酸化，抑制腫瘤的生長[6-7]。本實驗中Robo 1蛋白在胃癌組織中的陽性表達(dá)為70.37%，高于癌旁組織，且與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，而與腫瘤的分化程度、腫瘤大小無關(guān)，推測Robo 1蛋白在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

當(dāng)實體腫瘤體積小于2 mm3時，腫瘤細(xì)胞通過彌散獲取營養(yǎng)，大于2 mm3時則必須有新生血管的形成，為腫瘤細(xì)胞繼續(xù)增殖和轉(zhuǎn)移提供氧氣和養(yǎng)料。腫瘤血管的形成是由宿主細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分泌的腫瘤血管生成因子（TAF）引起的，同時減少血管新生抑制物（TIMPs）的表達(dá)。新生血管管壁薄弱，只有一層內(nèi)皮細(xì)胞，無平滑肌、神經(jīng)末梢及相應(yīng)的淋巴管道，腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞器增多，呈現(xiàn)高度擴(kuò)張的狀態(tài)；而且新生血管內(nèi)皮細(xì)胞的基底膜不完整，腫瘤細(xì)胞易穿透，為腫瘤的增殖及侵襲轉(zhuǎn)移做好準(zhǔn)備。腫瘤微血管密度（MVD）是反映腫瘤新生血管的一個重要指標(biāo)，是評估腫瘤增殖及侵襲的一個重要條件[8]。本實驗中胃癌組織中的MVD為（24.74±2.59），高于癌旁組織，進(jìn)一步證實了微血管形成及增生對腫瘤的生長及侵襲的重要影響。

已有的研究發(fā)現(xiàn)，Robo 1作為Slit 2的受體，與Slit 2結(jié)合后能夠使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生遷移，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤微血管的生成，作為血管形成中的重要通路之一，Slit/Robo這一信號通路具有相對獨立性，受血管受體類型及其他信號分子的調(diào)控[9-12]。Wang等[13-14]發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞能夠分泌Slit 2，用特異性抗體R 5阻斷Slit 2/Robo 1信號通路后,腫瘤血管密度明顯降低、腫瘤體積顯著縮小。

腫瘤的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常是腫瘤的發(fā)生發(fā)展的一個重要因素,雖然研究者己經(jīng)發(fā)現(xiàn)了若干分子在信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著不可替代的作用，但各種分子之間的相互調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。本實驗中顯示高表達(dá)的Robo 1蛋白能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長及新生血管的形成，為腫瘤的輔助診斷和抗血管治療提供了重要的線索。

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Objective To study the Robo 1 transmembrane protein expression in gastric carcinoma tissue and its relationship with clinical pathological features.Methods Immunohistochemical method to detect P-V 54 cases of gastric carcinoma and 20 cases Robo 1 protein expression in tissue adjacent to carcinoma,and compare the different pathological characteristics under Robo 1 protein expression;With CD 34 markers capillaries,microvascular density (microvessel density,MVD),and to discuss the relationship between gastric cancer tissues Robo 1 and MVD. Results The positive expression rate of Robo 1 protein in gastric carcinoma was 70.37%,the positive expression rate was 10.00% in the tissue adjacent to carcinoma,both comparison,difference was statistically significant (χ2= 21.48,P < 0.05).Robo 1 protein expression level and lymph node metastasis and TNM stages related,has nothing to do with the degree of differentiation and tumor size.Robo 1 protein positive MVD in gastric cancer tissue was (24.74 ± 2.59),significantly higher compared with tissue adjacent to carcinoma (18.10 ± 1.71）,with statistical significance (t = 10.629,P < 0.05).Conclusion Higher Robo 1 protein expression in gastric cancer,and is associated with the clinical pathological features of the tumor,prompt Robo 1 protein plays an important role in the formation process of gastric cancer,cancer of the stomach in the microvascular density increased can infer the formation of the microvascular promoted the growth and inasieness of tumor.

Gastric carcinoma; Robo 1 protein; Microvessel density (MVD); Immunohistochemical

10.3969/j.issn.1009-4393.2016.17.002

遼寧 124010 遼河油田總醫(yī)院 （張春煜 孟杰 張亮） 盤錦骨科醫(yī)院 （徐大鵬）

張亮 E-mail：huizi 320@163.com