柴 芳，齊鳳杰，趙樹鵬，王 月，王 俊，李 強(qiáng)

·論著·

Roux-en-Y胃旁路術(shù)對血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的影響

柴 芳，齊鳳杰，趙樹鵬，王 月，王 俊，李 強(qiáng)

121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科(柴芳，趙樹鵬，王俊，李強(qiáng))，病理科(齊鳳杰，王月)

【摘要】目的通過建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型，觀察Roux-en-Y胃旁路術(shù)(RYGB)對血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的影響，探討其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。方法2014年10月—2015年4月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為正常對照組(NC組)、T2DM組和RYGB組，各20只。T2DM組和RYGB組予以高脂飲食3周，腹腔注入鏈脲佐菌素(STZ)30 mg/kg建立T2DM模型；NC組喂養(yǎng)普通飼料，腹腔注入相同濃度的檸檬酸鹽緩沖液。RYGB組行RYGB，NC組及T2DM組行假手術(shù)。記錄大鼠一般情況，包括術(shù)前、術(shù)后21 d體質(zhì)量。采用ELISA法檢測術(shù)前、術(shù)后21 d腫瘤壞死因子α(TNF-α)、脂聯(lián)素水平，HE染色法測定術(shù)后21 d血管內(nèi)膜厚度，免疫組化SABC法檢測術(shù)后21 d P-選擇素表達(dá)情況。結(jié)果術(shù)后RYGB組2只大鼠因吻合口梗阻死亡。T2DM組、RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于NC組(P<0.05)；RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于T2DM組(P<0.05)。NC組大鼠術(shù)后體質(zhì)量高于術(shù)前(P<0.05)；RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于術(shù)前(P<0.05)。T2DM組術(shù)前、術(shù)后TNF-α水平均高于NC組，術(shù)前、術(shù)后脂聯(lián)素水平均低于NC組(P<0.05)；RYGB組術(shù)前TNF-α水平高于NC組，術(shù)前脂聯(lián)素水平低于NC組(P<0.05)；RYGB組術(shù)后TNF-α水平低于T2DM組，術(shù)后脂聯(lián)素水平高于T2DM組(P<0.05)。RYGB組術(shù)后TNF-α水平低于術(shù)前，術(shù)后脂聯(lián)素水平高于術(shù)前(P<0.05)。3組大鼠血管內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.337，P=0.271)。NC組、RYGB組P-選擇素表達(dá)陽性率低于T2DM組(P<0.05)。結(jié)論RYGB可能通過脂聯(lián)素/TNF-α通路減少P-選擇素表達(dá)，進(jìn)而減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。

【關(guān)鍵詞】糖尿病,2型；胃旁路術(shù)；P選擇素；脂聯(lián)素

柴芳，齊鳳杰，趙樹鵬，等.Roux-en-Y胃旁路術(shù)對血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(15)：1792-1795.[www.chinagp.net]

Chai F,Qi FJ,Zhao SP,et al.Effect of Roux-en-Y gastric bypass on the expression of P-selectin in vascular endothelial cells[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1792-1795.

微血管病變是2型糖尿病(T2DM)的重要病理改變。研究表明，Roux-en-Y胃旁路術(shù)(RYGB)在有效降低血糖的同時，可以減少心腦血管事件的發(fā)生，明顯改善血管功能[1]。血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素是炎性反應(yīng)中白細(xì)胞黏附、錨定的關(guān)鍵步驟，與糖尿病微血管病變密切相關(guān)[2]。本研究通過建立T2DM大鼠模型，觀察RYGB對血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的影響，探討其對血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1動物來源60只SPF級雄性SD大鼠由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，7～8周齡，體質(zhì)量210～243 g，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(22±2)℃，相對濕度45%。

1.2主要材料鏈脲佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；大鼠脂聯(lián)素試劑盒(Phoenix，美國)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒、兔抗鼠P-選擇素一抗、羊抗兔二抗、即用型SABC免疫組化染色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3研究方法

1.3.1造模及分組2014年10月—2015年4月，采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只SD大鼠分為正常對照組(NC組)、T2DM組和RYGB組，各20只。NC組喂養(yǎng)普通飼料3周；T2DM組和RYGB組予以高脂飲食(22.19 kJ/g，蛋白質(zhì)占35%，碳水化合物占5%，脂類占60%)3周。第13天時清晨空腹12 h后，T2DM組和RYGB組腹腔注入STZ 30 mg/kg(0.1 mol/L檸檬酸鹽緩沖液配制)，NC組腹腔注入相同濃度的檸檬酸鹽緩沖液。72 h后測定空腹血糖(≥7.8 mmol/L)或餐后隨機(jī)血糖(≥11.1 mmol/L)，提示造模成功。

1.3.2手術(shù)方法禁食12 h但不禁水，腹腔注入10%水合氯醛(3 ml/100 g)麻醉。RYGB組行RYGB，經(jīng)上腹正中切口入腹，經(jīng)胃大小彎間切斷胃體，賁門附近保留20%胃體，距Treizs韌帶10 cm離斷空腸，遠(yuǎn)端空腸與殘胃吻合，距吻合口10 cm行空腸端側(cè)吻合，縫合切口，術(shù)畢。NC組及T2DM組行假手術(shù)，胃前壁切開7 mm后原位縫合。

1.4指標(biāo)檢測

1.4.1一般情況記錄大鼠一般情況，包括周齡、術(shù)前及術(shù)后21 d體質(zhì)量。

1.4.2ELISA法檢測TNF-α、脂聯(lián)素水平術(shù)前及術(shù)后21 d時經(jīng)鼠尾靜脈采血，1 500 r/min離心10 min(離心半徑15 cm)，收集血清，按TNF-α試劑盒、大鼠脂聯(lián)素試劑盒說明書操作，測定OD值，計算TNF-α、脂聯(lián)素水平。

1.4.3HE染色法測定血管內(nèi)膜厚度術(shù)后21 d時經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛麻醉，取部分胸主動脈經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)經(jīng)脫水、二甲苯透明、包埋，制作石蠟切片，切片厚度為4 μm，常規(guī)HE染色，采用HPLAS-1000型圖像分析系統(tǒng)測定血管內(nèi)膜厚度。

1.4.4免疫組化SABC法檢測P-選擇素表達(dá)情況術(shù)后21 d時取部分胸主動脈經(jīng)4%多聚甲醛固定，常規(guī)制作石蠟切片，采用免疫組化SABC法檢測P-選擇素表達(dá)情況。兔抗鼠P-選擇素一抗為1∶200稀釋，羊抗兔二抗為1∶100稀釋，按即用型SABC免疫組化染色試劑盒說明書操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。所有切片經(jīng)3名病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行閱片，細(xì)胞呈棕黃色為陽性表達(dá)，隨機(jī)讀取5個高倍視野(×400)計數(shù)陽性細(xì)胞率，結(jié)果采用半定量法分析。陽性細(xì)胞率≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；染色強(qiáng)度定義為：無顯色為0分，淺棕黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將上述兩項(xiàng)得分相加，0分判為“-”，1～2分判為“+”，3～4分判為“++”，5～6分判為“+++”?！?”和“+”定義為陰性表達(dá)，“++”和“+++”定義為陽性表達(dá)。

2結(jié)果

2.1一般情況術(shù)后RYGB組2只大鼠因吻合口梗阻死亡。3組大鼠周齡、術(shù)前體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；3組大鼠術(shù)后體質(zhì)量比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T2DM組、RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于T2DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NC組大鼠術(shù)后體質(zhì)量高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；T2DM組大鼠術(shù)前、術(shù)后體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2TNF-α、脂聯(lián)素水平比較3組大鼠術(shù)前、術(shù)后TNF-α、脂聯(lián)素水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。T2DM組術(shù)前、術(shù)后TNF-α水平均高于NC組，術(shù)前、術(shù)后脂聯(lián)素水平均低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RYGB組術(shù)前TNF-α水平高于NC組，術(shù)前脂聯(lián)素水平低于NC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；RYGB組術(shù)后TNF-α水平低于T2DM組，術(shù)后脂聯(lián)素水平高于T2DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。RYGB組術(shù)后TNF-α水平低于術(shù)前，術(shù)后脂聯(lián)素水平高于術(shù)前，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.3血管內(nèi)膜厚度比較NC組血管內(nèi)膜厚度為(10.0±1.8)μm，T2DM組血管內(nèi)膜厚度為(11.6±2.5)μm，RYGB組血管內(nèi)膜厚度為(10.8±2.0)μm。3組大鼠血管內(nèi)膜厚度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.337，P=0.271)。

2.4P-選擇素表達(dá)情況比較NC組P-選擇素表達(dá)陽性4只(20.0%)，T2DM組P-選擇素表達(dá)陽性15只(75.0%)，RYGB組P-選擇素表達(dá)陽性3只(16.7%)。3組大鼠P-選擇素表達(dá)陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=18.027，P<0.001)；NC組、RYGB組P-選擇素表達(dá)陽性率低于T2DM組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見圖1，本文圖1彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。

3討論

P-選擇素是黏附分子家族中的重要成員之一，其表達(dá)水平與肥胖、高血壓、高脂血癥、糖化血紅蛋白水平呈正相關(guān)[3]。P-選擇素儲存于內(nèi)皮細(xì)胞的懷布爾-帕拉德小體(Weibel-Palade小體)，活化時表達(dá)于細(xì)胞膜，與白細(xì)胞表面的P-選擇素1配體結(jié)合，使白細(xì)胞黏附，促進(jìn)動脈硬化的形成，并可通過促進(jìn)血小板聚集及血栓形成引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[4-5]。研究表明，P-選擇素水平與外周動脈硬化性病變的病程進(jìn)展程度呈正相關(guān)[6]。P-選擇素/基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP1)可通過抑制一氧化氮合酶從小窩蛋白解離而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞[7]。而手術(shù)減重可以持久有效地緩解T2DM患者的高血糖，并可減少心腦血管事件的發(fā)生，對動脈硬化有緩解作用[1,8-9]。本研究結(jié)果顯示，NC組、RYGB組P-選擇素表達(dá)陽性率低于T2DM組，提示P-選擇素在T2DM血管慢性損傷中發(fā)揮重要作用，RYGB可能通過降低P-選擇素水平來減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度。

表1　3組大鼠一般資料比較±s)

注：NC=正常對照，T2DM=2型糖尿病，RYGB=Roux-en-Y胃旁路術(shù)；與NC組比較，aP<0.05；與T2DM組比較，bP<0.05；與術(shù)前比較，cP<0.05

Table2ComparisonofthelevelsofTNF-αandadiponectinconcentrationamongthethreegroups

組別只數(shù)TNF-α術(shù)前 術(shù)后脂聯(lián)素術(shù)前 術(shù)后NC組201.3±0.31.3±0.55.6±1.35.6±1.4T2DM組204.0±0.7a4.1±0.7a1.2±0.9a1.5±0.7aRYGB組184.2±1.0a1.7±0.4bc1.4±0.8a5.2±0.9bcF值82.870147.75457.87743.206P值<0.001<0.001<0.001<0.001

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α；與NC組比較，aP<0.05；與T2DM組比較，bP<0.05；與術(shù)前比較，cP<0.05

注：NC=正常對照，T2DM=2型糖尿病，RYGB=Roux-en-Y胃旁路術(shù)

圖1免疫組化SABC法檢測P-選擇素表達(dá)情況(×400)

Figure 1Expression of P-selectin detected by immunohistochemical SABC method

本研究結(jié)果顯示，RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于NC組、T2DM組，RYGB組大鼠術(shù)后體質(zhì)量低于術(shù)前，考慮可能與大鼠RYGB后進(jìn)食量減少及體內(nèi)激素變化有關(guān)。T2DM組大鼠術(shù)后體質(zhì)量與術(shù)前無差異，但低于NC組、高于RYGB組，考慮可能與自身患有T2DM影響生長有關(guān)。NC組大鼠術(shù)后體質(zhì)量高于術(shù)前，考慮與正常生長發(fā)育有關(guān)。

脂聯(lián)素由脂肪細(xì)胞分泌，具有減輕胰島素抵抗、減少心腦血管疾病等多種生物學(xué)作用，脂聯(lián)素水平降低對高脂血癥誘導(dǎo)的血管損傷的保護(hù)作用減弱[10]。臨床研究顯示，RYGB后心腦血管事件發(fā)生減少與脂聯(lián)素/TNF-α通路相關(guān)[11]。脂聯(lián)素可以減少T2DM小鼠主動脈TNF-α表達(dá)水平[12]。研究表明，TNF-α具有增加血管內(nèi)皮細(xì)胞P-選擇素表達(dá)的作用[13]。本研究結(jié)果顯示，T2DM組術(shù)前、術(shù)后TNF-α水平均高于NC組，術(shù)前、術(shù)后脂聯(lián)素水平均低于NC組；RYGB組術(shù)前TNF-α水平高于NC組，術(shù)前脂聯(lián)素水平低于NC組；RYGB組術(shù)后TNF-α水平低于T2DM組，術(shù)后脂聯(lián)素水平高于T2DM組；RYGB組術(shù)后TNF-α水平低于術(shù)前，術(shù)后脂聯(lián)素水平高于術(shù)前?？紤]脂聯(lián)素水平降低及TNF-α水平升高與T2DM血管病變密切相關(guān)，提示RYGB作為一種手術(shù)減重的方法能夠上調(diào)脂聯(lián)素水平，并可能通過降低TNF-α水平來減少P-選擇素表達(dá)，進(jìn)而影響糖尿病血管病變的早期事件。這一機(jī)制考慮與RYGB治療后體質(zhì)量減輕、體內(nèi)能量平衡改變、脂肪組織釋放的生物活性因子改變有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，3組大鼠血管內(nèi)膜厚度無差異，與既往研究不一致[14]，考慮可能與本實(shí)驗(yàn)造模時間短、動物血管病理損傷相對輕有關(guān)。

總之，RYGB可能通過脂聯(lián)素/TNF-α通路減少P-選擇素表達(dá)，進(jìn)而減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷程度，TNF-α、脂聯(lián)素、P-選擇素等分子為T2DM血管病變的治療提供了新靶點(diǎn)，但其具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：柴芳進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；齊鳳杰、王月、王俊、李強(qiáng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評估、資料收集；趙樹鵬進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Roux-en-Y Gastric Bypass on the Expression of P-selectin in Vascular Endothelial Cells

CHAIFang,QIFeng-jie,ZHAOShu-peng,etal.

DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofLiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the influence of Roux-en-Y gastric bypass(RYGB) on the expression of P-selectin by establishing T2DM rat models and to investigate its protection mechanism for vascular endothelial cells.MethodsFrom October 2014 to April 2015,we divided sixty SD rats into three groups:normal control group(NC group),T2DM group and RYGB group,with 20 rats in each group.T2DM group and RYGB group were administrated with high fat diet for three weeks and were given 30 mg/kg streptozotocin(STZ) by intraperitoneal injection to build T2DM models,and NC group was fed with normal fodder and was given citric acid buffer solution of the same concentration.RYGB was undertaken in RYGB group,and sham operation was undertaken in NC group and T2DM group.The general data of the rats were recorded,including body weight before surgery and 21 days after surgery.The levels of TNF-α and adiponectin concentration were detected by ELISA before surgery and 21 days after surgery;vessel intima thickness was determined by HE staining method 21 days after surgery,and the expression of P-selectin was detected by immunohistochemistry SABC method 21 days after surgery.ResultsTwo rats in RYGB group died from anastomotic obstruction after surgery.T2DM group and RYGB group were lower than NC group in postoperative body weight(P<0.05);RYGB group was lower than T2DM group in body weight after surgery(P<0.05).NC group had higher body weight after surgery than that before surgery(P<0.05);RYGB group had lower body weight after surgery than that before surgery(P<0.05).T2DM group was higher in TNF-α level and lower in adiponectin concentration than NC group before and after surgery(P<0.05).RYGB group was higher in TNF-α level and lower in adiponectin concentration than NC group before surgery(P<0.05);RYGB group was lower in TNF-α level and higher in adiponectin concentration than T2DM group after surgery(P<0.05).RYGB group had lower TNF-α level and higher adiponectin concentration after surgery than those before surgery(P<0.05).The three groups were not significantly different in vessel intima thickness(F=1.337,P=0.271).NC group and RYGB group were lower than T2DM group in the positive rate of P-selectin expression(P<0.05).ConclusionRYGB possibly reduces P-selectin expression by adiponectin/TNF-α signaling pathways,and then reduces the damage of vascular endothelial cells.

【Key words】Diabetes mellitus,type 2;Gastric bypass;P-selectin;Adiponectin

基金項(xiàng)目：遼寧省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013022044)；遼寧醫(yī)學(xué)院博士科研啟動基金項(xiàng)目(Y2012B017)；遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院科技啟動基金項(xiàng)目(Fyk201211)

通信作者：趙樹鵬，121001 遼寧省錦州市，遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科；E-mail：lyfsdyyy@163.com

【中圖分類號】R 587.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.011

(收稿日期：2015-09-23；修回日期：2016-03-07)