于建超，王勤章，王江平，錢 彪，李應(yīng)龍，王新敏，倪 釗，李 強(qiáng)

·論著·

含人干細(xì)胞白血病基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的效果研究

于建超，王勤章，王江平，錢 彪，李應(yīng)龍，王新敏，倪 釗，李 強(qiáng)

832000 新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科

【摘要】目的觀察攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)的含人干細(xì)胞白血病(SCL)基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的豚鼠膀胱Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞(ICC)的效果。方法2014年10月—2015年8月，選取普通級成年健康豚鼠16只。構(gòu)建含人SCL基因的慢病毒載體，并標(biāo)定病毒滴度；采用隨機(jī)數(shù)字表法選取健康豚鼠4只，采用頸椎脫臼方法將其殺死，體外培養(yǎng)豚鼠膀胱ICC。設(shè)置不同感染復(fù)數(shù)(MOI)(0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0)，利用含人SCL基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC，在激光共聚焦顯微鏡下觀察ICC生長狀態(tài)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率，確定最佳MOI。采用隨機(jī)數(shù)字表法將ICC分為正常對照組、空白質(zhì)粒對照組與慢病毒轉(zhuǎn)染組，其中正常對照組加入1%磷酸鹽緩沖液(PBS)，空白質(zhì)粒對照組加入空慢病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染組按最佳MOI加入含人SCL基因的慢病毒載體，計(jì)算各組轉(zhuǎn)染效率，確定最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測SCL mRNA表達(dá)情況。上述實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)4次。結(jié)果經(jīng)測定，病毒滴度為5×108 TU/ml。倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)一些特征性梭形細(xì)胞，其兩側(cè)有顯著外凸分枝，細(xì)胞核較大，其外形規(guī)則，有序地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞貼壁，而其他未貼壁細(xì)胞則呈現(xiàn)與ICC不一樣的形態(tài)，胞體多為橢圓形，細(xì)胞兩極無突起，整體形狀扁平。激光共聚焦顯微鏡下可以發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶生長因子受體(c-kit)受體成功表達(dá)，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是膀胱ICC。觀察各組ICC生長狀態(tài)，當(dāng)MOI為0.5、1.0、5.0、10.0時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)較好，無細(xì)胞死亡，當(dāng)MOI為50.0、100.0時(shí)，可見部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞活性降低；MOI為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為0.5時(shí)(P<0.05)；MOI為5.0、10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為1.0時(shí)(P<0.05)；MOI為10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為5.0時(shí)(P<0.05)；MOI為50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為10.0時(shí)(P<0.05)；綜合ICC生長狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率，確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳MOI為10.0。正常對照組、空白質(zhì)粒對照組ICC中無GFP表達(dá)；慢病毒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染3 d時(shí)ICC中GFP表達(dá)強(qiáng)度高于轉(zhuǎn)染2 d、轉(zhuǎn)染5 d時(shí)，確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為3 d。慢病毒轉(zhuǎn)染組中擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段大小1 036 bp一致，而正常對照組及空白質(zhì)粒對照組均未見特異性條帶表達(dá)，表明SCL基因成功導(dǎo)入ICC。結(jié)論利用含人SCL基因慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的ICC，并成功介導(dǎo)SCL基因在ICC中的表達(dá)，為下一步研究利用SCL基因進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】轉(zhuǎn)染；干細(xì)胞白血病基因；慢病毒載體；Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞

于建超，王勤章，王江平，等.含人干細(xì)胞白血病基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞的效果研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(15)：1796-1802.[www.chinagp.net]

Yu JC,Wang QZ,Wang JP,et al.Effect of transfecting human SCL gene lentiviral vectors into Cajal-like cells[J].Chinese General Practice，2016，19(15)：1796-1802.

糖尿病膀胱異常病癥(DCP)是糖尿病末期出現(xiàn)頻率最高的并發(fā)癥之一，在糖尿病患者中的發(fā)病率為19%～84%[1-2]。DCP在發(fā)病末期會(huì)出現(xiàn)尿路感染、腎炎等，之后發(fā)展成尿毒癥[3-4]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)水平下降、氧化自由基形成、糖代謝異常、前列腺素E2(PGE2)水平下降、線粒體氧化應(yīng)激產(chǎn)物(reactive oxygen species，ROS)增多、血管的供應(yīng)減少等可能導(dǎo)致DCP的發(fā)生[5-7]，但其具體發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。近年研究發(fā)現(xiàn)，在人類、豚鼠等很多動(dòng)物的膀胱逼尿肌中存在著一種與胃腸道Cajal樣間質(zhì)細(xì)胞(interstitial cells of Cajal，ICC)形態(tài)類似的特殊細(xì)胞，稱之為膀胱ICC[8-9]。膀胱逼尿肌會(huì)出現(xiàn)一系列自發(fā)性收縮，此收縮現(xiàn)象完全受到ICC的調(diào)節(jié)，而膀胱起搏細(xì)胞即為ICC[10-11]。對于DCP患者而言，由于高血糖的誘導(dǎo)，ICC不斷萎縮或消失，造成干細(xì)胞因子(SCF)/酪氨酸蛋白激酶生長因子受體(c-kit)信號通路傳輸功能受損[12]，進(jìn)而導(dǎo)致膀胱感覺降低、尿儲存量升高、排尿階段逼尿肌收縮性減弱、膀胱剩余尿量變多等不適，致使膀胱功能完全癱瘓甚至失效。ICC存在兩個(gè)關(guān)鍵受體，分別是特異性蛋白受體c-kit和其配體SCF，c-kit和SCF特異性結(jié)合后啟動(dòng)SCF/c-kit信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞白血病(SCL)基因?qū)儆赾-kit上端的必不可少的調(diào)控遺傳基因，能夠增強(qiáng)c-kit 基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)DCP中ICC表型及功能的恢復(fù)[13]。因此，SCF/c-kit信號通路傳輸功能的好轉(zhuǎn)，對推動(dòng)ICC功能的逆轉(zhuǎn)發(fā)揮關(guān)鍵性作用，對于DCP的臨床治療發(fā)揮重要的引導(dǎo)作用。本研究組設(shè)想，可將含人SCL基因慢病毒載體通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)感染形態(tài)和功能被破壞的ICC，進(jìn)而促進(jìn)ICC數(shù)量及功能恢復(fù)。為此，本研究利用含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的ICC，并研究其轉(zhuǎn)染效果及SCL基因在ICC中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步利用含人SCL基因慢病毒載體進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及DCP治療提供新的思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物2014年10月—2015年8月，選取普通級成年健康豚鼠16只，雌雄不限，鼠齡6～12個(gè)月，體質(zhì)量250～400 g。購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2實(shí)驗(yàn)材料DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒(Fermentas公司)；攜帶增強(qiáng)綠色熒光蛋白(GFP)的含人SCL基因慢病毒載體(由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司協(xié)助合成)。

1.3含人SCL基因慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

1.3.1含人SCL基因質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增對含人SCL基因質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，上游引物為5′-GAGGATCCCCGGGTACCGGTCGCCACCATGACCGAGCGGCCGCCGAG-3′，下游引物為5′-TCACCATGGTGGCGACCGGCCGAGGGCCGGCTCCATC-3′，由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min。

1.3.2構(gòu)建含人SCL基因慢病毒載體將含人SCL基因質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物提純，通過In-Fusion轉(zhuǎn)換酶的催化將含人SCL基因質(zhì)粒的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與GV287-EGFP結(jié)合，形成重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL，即含人SCL基因慢病毒載體。

1.3.3篩選含人SCL基因慢病毒載體提取重組質(zhì)粒GV287-EGFP/SCL陽性克隆菌落PCR模板上的交換轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，長出菌落后加入到10 μl培養(yǎng)基混勻，抽取1 μl混合物設(shè)置模板，通過PCR法實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增，與陽性轉(zhuǎn)化子對接后分裝測序。

1.3.4包裝含人SCL基因慢病毒載體并測定病毒滴度以293T細(xì)胞為包裝細(xì)胞，制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其2種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，3種質(zhì)粒分別進(jìn)行高純度無內(nèi)毒素抽提，按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒使用說明共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染8 h后更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集含人SCL基因慢病毒載體的細(xì)胞上清液，對其濃縮后得到高滴度的含人SCL基因慢病毒載體濃縮液，用熒光法在293T細(xì)胞中測定病毒滴度。

1.4豚鼠膀胱ICC體外培養(yǎng)及鑒定

1.4.1體外培養(yǎng)ICC采用隨機(jī)數(shù)字表法選取健康豚鼠4只，采用頸椎脫臼方法將其處死，在無菌環(huán)境中取出膀胱組織，于顯微鏡下用眼科剪把膀胱組織搗碎至1 mm3，并放置在1.0 mg/ml胰蛋白酶里，于37 ℃下消化15 min，加入DMEM培養(yǎng)基(內(nèi)含1.0 mg/ml V型膠原酶、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素)，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化90 min。超凈臺下嚴(yán)格無菌操作，將消化好的絮狀液過濾，1 500 r/min離心5 min(離心半徑13 cm)。過濾上清液并丟棄，采用1%磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，1 500 r/min離心5 min(離心半徑13 cm)，重復(fù)離心3次，過濾溶液中的殘?jiān)?、酶和已污染的微生物；通過移液管全面吹打單細(xì)胞懸液，接種到6孔培養(yǎng)皿中，加入含有10% FBS、1%雙抗(100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素)的低糖DMEM培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。接種24 h后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，把未貼壁的平滑肌細(xì)胞過濾掉，將已貼壁的ICC放置在培養(yǎng)皿中，72 h后通過ICC特異性標(biāo)志物c-kit抗體做免疫測試鑒定。

1.4.2免疫測試鑒定ICC在6孔培養(yǎng)板各孔中放置無菌消毒的載玻片，采用移液器將ICC懸液移至載玻片中間位置，加入約1 ml培養(yǎng)基，接種8 h后再加入1 ml培養(yǎng)基；培養(yǎng)48 h后用鑷子取出細(xì)胞爬片，用抗體稀釋液分別稀釋特異性一抗(大鼠抗小鼠的單克隆c-kit抗體)和二抗(異硫氰酸熒光素標(biāo)記的兔抗大鼠抗體)，使其工作濃度達(dá)1∶100；1% PBS漂洗3次，15 min/次；室溫條件下用100%丙酮溶液固定15 min，風(fēng)干后再次1% PBS漂洗3次，15 min/次；采用0.03% H2O2溶液將內(nèi)源性過氧化物酶密封處理約0.5 h；1% PBS漂洗3次，5 min/次；室溫條件下用1% FBS清蛋白開展孵化實(shí)驗(yàn)，共0.5 h；緩慢吸取孵化液，與經(jīng)過稀釋的1 μl一抗(大鼠抗小鼠的單克隆c-kit抗體，1∶100)融合，濕盒內(nèi)室溫孵育2 h后置于-4 ℃冰箱繼續(xù)孵育48 h；1% PBS漂洗3次，5 min/次；室溫條件下，與二抗(FITC標(biāo)記熒光兔抗大鼠抗體)避光孵育60 min；1% PBS漂洗3次，5 min/次；在細(xì)胞爬片上滴加50%甘油溶液，用蓋玻片封閉，吸去周圍滲出的甘油，風(fēng)干3～5 min后在激光共聚焦顯微鏡下觀察c-kit受體表達(dá)情況。

1.5確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection，MOI)參照慢病毒轉(zhuǎn)染手冊(由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司提供)，設(shè)置不同MOI(0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0)，ICC中加入5×108TU/ml的含人SCL基因慢病毒載體，同時(shí)加入10 μg/ml的聚凝胺(Polybrene)；置于溫箱中，培養(yǎng)8～12 h后在顯微鏡下觀察各MOI下的細(xì)胞狀態(tài)，棄去培養(yǎng)基，加入新鮮配制的完全培養(yǎng)基；繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察ICC生長狀態(tài)并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率〔轉(zhuǎn)染效率=(表達(dá)GFP的細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞)×100%〕，確定最佳MOI。

1.6確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間以3×104～5×104個(gè)/ml將ICC接種于96孔培養(yǎng)板中，體積為90 μl。采用隨機(jī)數(shù)字表法將ICC分為正常對照組、空白質(zhì)粒對照組與慢病毒轉(zhuǎn)染組，其中正常對照組加入1% PBS，空白質(zhì)粒對照組加入空白慢病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染組按最佳MOI加入含人SCL基因慢病毒載體，同時(shí)加入10 μg/ml的聚凝胺。培養(yǎng)24 h后用移液器吸去培養(yǎng)基，1% PBS漂洗2次，加入1 ml新鮮配制的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分別在轉(zhuǎn)染2、3、5 d時(shí)，采用激光共聚焦顯微鏡，沿單孔板垂直于水平連續(xù)視野(約0.77 mm2/視野)，連續(xù)觀測20個(gè)視野(×200)，通過觀察GFP表達(dá)強(qiáng)度來確定最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間。

1.7RT-PCR法檢測SCL mRNA表達(dá)情況分別在轉(zhuǎn)染2、3、5 d時(shí)提取ICC總RNA，采用RT-PCR法分析SCL mRNA的表達(dá)情況。SCL上游引物為5′-GAGGATCCCCGGTACCGGTCGCCACCATGCGAGCGGCCGCCGAG-3′，下游引物為5′-TCACCATGGTGGCGACCGACCGGCCGAGGGCCGGCTCCATC-3′，大小約為1 036 bp；GAPDH上游引物為5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物為5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，大小約為456 bp。PCR反應(yīng)條件：94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)，最后1個(gè)循環(huán)72 ℃延伸10 min。行瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠分析系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像及灰度分析，檢測各組ICC中SCL mRNA表達(dá)情況。

上述實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)4次。

2結(jié)果

2.1病毒滴度經(jīng)測定，病毒滴度為5×108TU/ml。

2.2ICC體外培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

2.2.1ICC體外培養(yǎng)結(jié)果倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)一些特征性梭形細(xì)胞，其兩側(cè)有顯著外凸分枝，細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)中存在一些黑色糖原粒子，其外形規(guī)則，有序地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞貼壁(見圖1，本文圖1～5彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)，而其他未貼壁細(xì)胞則呈現(xiàn)與ICC不一樣的形態(tài)，胞體多為橢圓形，細(xì)胞兩極無突起，整體形狀扁平(見圖2)。

2.2.2ICC鑒定結(jié)果激光共聚焦顯微鏡下可以發(fā)現(xiàn)c-kit受體成功表達(dá)，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是膀胱ICC(見圖3)。

2.3ICC生長狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率比較觀察各組ICC生長狀態(tài)，當(dāng)MOI為0.5、1.0、5.0、10.0時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)較好，無細(xì)胞死亡，當(dāng)MOI為50.0、100.0時(shí)，可見部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞活性降低(見圖4)。不同MOI下轉(zhuǎn)染效率比較比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中MOI為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為0.5時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MOI為5.0、10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為1.0時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MOI為10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為5.0時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MOI為50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為10.0時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。綜合ICC生長狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率，確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳MOI為10.0。

2.4GFP表達(dá)強(qiáng)度比較正常對照組、空白質(zhì)粒對照組ICC中無GFP表達(dá)；慢病毒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染3d時(shí)ICC中GFP表達(dá)強(qiáng)度高于轉(zhuǎn)染2d、轉(zhuǎn)染5d時(shí)(見圖5)，確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為3d。

2.5SCLmRNA表達(dá)情況慢病毒轉(zhuǎn)染組中擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段大小1 036bp一致，而正常對照組及空白質(zhì)粒對照組均未見特異性條帶表達(dá)，表明SCL基因成功導(dǎo)入ICC(見圖6)。

圖1細(xì)胞接種24h后，倒置顯微鏡下可見梭形細(xì)胞，其兩側(cè)有顯著外凸分枝(×200)

Figure 124 h after cellinoculation，pindle cells were observed under inverted microscope,both sides had significant convex branches

圖2平滑肌細(xì)胞胞體多為橢圓形，細(xì)胞兩極無突起，整體形狀扁平(×200)

Figure 2The soma of smooth muscle cells was oval,two polar of the cell had no protuberance,overall shape was flat

圖3　c-kit受體免疫熒光實(shí)驗(yàn)陽性(×200)

注：A為MOI=0.5，B為MOI=1.0，C為MOI=5.0，D為MOI=10.0，E為MOI=50.0，F(xiàn)為MOI=100.0

圖4不同MOI下ICC生長狀態(tài)(×200)

Figure 4The growth state of ICC at different MOI values

注：A為轉(zhuǎn)染2 d，B為轉(zhuǎn)染3 d，C為轉(zhuǎn)染5 d

圖5慢病毒轉(zhuǎn)染組GFP表達(dá)強(qiáng)度

Figure 5Expression intensity of GFP in lentivirus transfection group

注：1為正常對照組，2為空白質(zhì)粒對照組，3、4為慢病毒轉(zhuǎn)染組，M為Marker

圖6　瓊脂糖凝膠電泳圖

注：MOI=感染復(fù)數(shù)；與MOI=0.5比較，aP<0.05；與MOI=1.0比較，bP<0.05；與MOI=5.0比較，cP<0.05；與MOI=10.0比較，dP<0.05

3討論

研究發(fā)現(xiàn)，ICC可以控制膀胱逼尿肌的自發(fā)性興奮與收縮，運(yùn)用膜片鉗方法檢測到膀胱ICC可自發(fā)性產(chǎn)生動(dòng)作電位，阻斷ICC動(dòng)作電位后，逼尿肌細(xì)胞的收縮明顯被抑制[14]。有學(xué)者認(rèn)為，ICC具有起搏膀胱活動(dòng)和傳導(dǎo)神經(jīng)信息的功能[14-16]。而在糖尿病患者膀胱逼尿肌中，ICC水平較低，并出現(xiàn)不正常分布或自發(fā)興奮減弱，進(jìn)而促進(jìn)DCP形成[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ICC的表達(dá)與其特異性酪氨酸激酶受體c-kit密切相關(guān)，成功激活SCF/c-kit信號通路之后，該信號通路能夠維持ICC的外形和生理特性[18]。SCL屬于一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)節(jié)c-kit的表達(dá)及其功能，并不會(huì)和DNA進(jìn)行對接[19]。鑒于SCL在ICC發(fā)育中的關(guān)鍵作用，本研究組設(shè)想，可通過基因技術(shù)構(gòu)建含人SCL基因慢病毒載體，然后轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的ICC，增加SCL的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)ICC表型和功能的恢復(fù)，為進(jìn)一步探究DCP的基因治療提供相關(guān)資料。

本研究組根據(jù)膀胱平滑肌細(xì)胞與膀胱ICC貼壁的時(shí)間不同，收獲目的細(xì)胞。接種24 h后，可以發(fā)現(xiàn)ICC已經(jīng)開始貼著培養(yǎng)板底壁，而在培養(yǎng)板底壁未發(fā)現(xiàn)膀胱平滑肌細(xì)胞，此時(shí)把未貼壁的平滑肌細(xì)胞過濾掉，可得到相對純化的膀胱ICC。倒置顯微鏡下發(fā)現(xiàn)一些特征性梭形細(xì)胞，其兩側(cè)有顯著外凸分枝，細(xì)胞核較大，其外形規(guī)則，有序地實(shí)現(xiàn)細(xì)胞貼壁，而其他未貼壁細(xì)胞胞體多為橢圓形，細(xì)胞兩極無突起，整體形狀扁平。激光共聚焦顯微鏡下可以發(fā)現(xiàn)c-kit受體成功表達(dá)，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞是膀胱ICC。采用差速貼壁法提取的膀胱ICC數(shù)量相對較多、純度較高，但仍可觀察到平滑肌細(xì)胞。此方法操作簡單，時(shí)間相對較短，能為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供足夠的細(xì)胞。

隨著基因工程的不斷發(fā)展，基因轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)工具日趨增多，如質(zhì)粒、脂質(zhì)體、慢病毒和腺病毒。慢病毒作為一種常用的基因載體，是經(jīng)人類免疫缺陷病毒-1(HIV- 1)改造而成，其生物活性仍然存在而其毒性已被滅活，且免疫原性低，生物安全性較好[20]。病毒載體經(jīng)基因重組技術(shù)能高效地整合目的基因于宿主細(xì)胞中，不易引起插入突變，目的基因能夠持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)，并對分裂期和非分裂期的細(xì)胞均有較高的感染率，是一種理想的基因工具，能夠用來開展體內(nèi)、外轉(zhuǎn)染相關(guān)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)慢病毒是通過三質(zhì)粒系統(tǒng)進(jìn)行包裝，此包裝系統(tǒng)含有編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其2種輔助包裝原件載體質(zhì)粒，對于編碼質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒而言，二者具有反正式互補(bǔ)的功能，同時(shí)輔助包裝質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)由pHelper1.0載體和pHelper2.0載體質(zhì)粒構(gòu)成。此操作方法相對簡單，慢病毒重組率、產(chǎn)率均不低，同時(shí)可以較高水平表達(dá)目的基因。經(jīng)測定，病毒滴度為5×108TU/ml，此滴度保證了本研究及后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求[21]。慢病毒雖已被剔除毒性基因，但其生物學(xué)危害并未完全喪失，屬于“自殺”性病毒，仍具有一定的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒轉(zhuǎn)染效果與MOI密切相關(guān)，MOI過高可導(dǎo)致部分細(xì)胞死亡[22]，因此適當(dāng)?shù)腗OI很重要。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)MOI為0.5、1.0、5.0、10.0時(shí)，細(xì)胞生長狀態(tài)較好，無細(xì)胞死亡，當(dāng)MOI為50.0、100.0時(shí)，可見部分細(xì)胞死亡，細(xì)胞活性降低；MOI為1.0、5.0、10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為0.5時(shí)，MOI為5.0、10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為1.0時(shí)，MOI為10.0、50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為5.0時(shí)，MOI為50.0、100.0時(shí)的轉(zhuǎn)染效率高于MOI為10.0時(shí)；綜合ICC生長狀態(tài)及轉(zhuǎn)染效率，確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳MOI為10.0。GFP是一種對細(xì)胞沒有生物毒性的熒光蛋白，能夠在激光共聚焦顯微鏡下受藍(lán)色激光激發(fā)而產(chǎn)生持續(xù)穩(wěn)定的綠色熒光，通常作為標(biāo)志物或報(bào)告基因來檢測細(xì)胞或者活體組織。本研究結(jié)果顯示，正常對照組、空白質(zhì)粒對照組ICC中無GFP表達(dá)；慢病毒轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染3 d時(shí)ICC中GFP表達(dá)強(qiáng)度高于轉(zhuǎn)染2 d、轉(zhuǎn)染5 d時(shí)，確定含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的最佳轉(zhuǎn)染時(shí)間為3 d。因此MOI為10.0、轉(zhuǎn)染72 h時(shí)，含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染ICC的轉(zhuǎn)染效率最高、生物活性最高、安全性最高。RT-PCR結(jié)果表明，慢病毒轉(zhuǎn)染組中擴(kuò)增產(chǎn)物大小與目的片段大小1 036 bp一致，而正常對照組及空白質(zhì)粒對照組均未見特異性條帶表達(dá)，表明SCL基因成功導(dǎo)入ICC。

本研究尚存在一定的局限性，本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞離體培養(yǎng)導(dǎo)致其脫離機(jī)體的內(nèi)環(huán)境，可能失去了細(xì)胞維持或輔助信號，或者失去了與其他細(xì)胞或者蛋白之間的聯(lián)系與反應(yīng)，體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可能不能完全解釋體內(nèi)的情況，所以利用含人SCL基因慢病毒載體轉(zhuǎn)染DCP豚鼠膀胱或者其他在體實(shí)驗(yàn)，能否取得相同的的結(jié)果，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，利用含人SCL基因慢病毒載體能高效轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的ICC，并成功介導(dǎo)SCL在ICC中的表達(dá)，為下一步研究利用SCL基因進(jìn)行體內(nèi)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

作者貢獻(xiàn)：于建超進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；王江平、錢彪、李應(yīng)龍、王新敏、倪釗、李強(qiáng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評估、資料收集；王勤章進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔麗紅)

Effect of Transfecting Human SCL Gene Lentiviral Vectors Into Cajal-like Cells

YUJian-chao,WANGQin-zhang,WANGJiang-ping,etal.

DepartmentofSurgicalUrology,theFirstAffiliatedHospitaloftheMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832000,China

【Abstract】ObjectiveTo transfect the lentiviral vector containing human stem cell leukemia(SCL) gene and enhanced green fluorescent protein(GFP) into Cajal-like cells cultured in vitro.MethodsDuring October 2014 to August 2015,16 CV adult healthy guinea pigs were selected as study subjects.To construct human SCL gene lentiviral expression vectors and determine virus titers,4 healthy guinea pigs were selected by random number table method and killed by cervical dislocation method,Cajal-like cells were cultured in vitro by differential adherence method.Different MOI(0.5,1.0,5.0,10.0,50.0,100.0) was set,the lentiviral vector containing human SCL gene was used to transfect into Cajal-like cells in vitro,the growth state of the Cajal-like cells was observed under laser scanning confocal microscope,and transfection efficiency was calculated,so as to determine the best MOI.The Cajal-like cells were divided into normal control group,empty plasmid control group and lentivirus transfection group by random number table method,cells in normal control group were treated with 1% phosphate buffered saline(PBS),cells in empty plasmid control group were treated with blank lentivirus,cells in lentivirus transfection group were treated with lentiviral vector containing the human SCL gene according to the best MOI,the transfection efficiency of each group was calculated respectively,the optimal transfection time was determined.The expression of SCL mRNA was measured by RT-PCR method.The above experiment was independently repeated 4 times.ResultsIt was examined that virus titers was 5×108 TU/ml.Some characteristic spindle cells were found under inverted microscope,both sides of the cells have significant convex branches,the cell nucleus was large and had regular shape,the cultured cells grew against the wall well,and other non-adherent cells presented some different shapes compared with Cajal-like cells,the overall shape of most cells was oval and flat,the two polar of cells had no protuberance.The c-kit receptor successfully expressed under laser scanning confocal microscope,it confirmed that the cultured cells were bladder Cajal-like cells.The growth state of cells in each group was observed,when MOI reached 0.5,1.0,5.0 or 10.0,the growth state was good,no cell died,when MOI reached 50.0 or 100.0,some cells died and cell activity decreased.The transfection efficiency when MOI reached 1.0,5.0,10.0,50.0 or 100.0 was higher than that when MOI reached 0.5(P<0.05).The transfection efficiency when MOI reached 5.0,10.0,50.0 or 100.0 was higher than that when MOI reached 1.0(P<0.05).The transfection efficiency when MOI reached 10.0,50.0 or 100.0 was higher than that when MOI reached 5.0(P<0.05).The transfection efficiency when MOI reached 50.0 or 100.0 was higher than that when MOI reached 10.0(P<0.05).According to Cajal-like cells growth state and transfection efficiency,to transfect lentiviral vector containing human SCL gene into Cajal-like cells,the best MOI was 10.0.No GFP expression was found in cells in normal control group and empty plasmid group.The GFP expression intensity in Cajal-like cells in lentivirus transfection group 3 days after transfection was higher than that 2 days and 5 days after transfection,respectively,thus it was determined that to transfect lentiviral vector containing human SCL gene into Cajal-like cells,the optimal transfection time was 3 days.The amplified product size was 1 036 bp,and it was consistent with the size of target fragments in lentivirus transfection group,while the normal control group and empty plasmid control group showed no expression of specific bands,which showed SCL gene was successfully transmited into Cajal-like cells.ConclusionThe lentivirus vector containing human SCL gene can efficiently transfect into Cajal-like cells in vitro,and can successfully mediated the expression of SCL gene in Cajal-like cells,the findings laid the foundations for transfection experiments using SCL gene in vivo.

【Key words】Transfection; Stem cell leukemia gene; Lentiviral vector; Cajal-like interstitial cells

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360120)

通信作者：王勤章，832000 新疆石河子市，石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科；E-mail：wqz1969@sina.com

【中圖分類號】R 37

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.15.012

(收稿日期：2015-10-19；修回日期：2016-03-16)