徐鴻毅鄧 鎧羅清炳張 鑫張昌軍**張衷源張櫻馨.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（十堰 44000）；.湖北醫(yī)藥學(xué)院

?

冷凍精液對IVF的胚胎質(zhì)量影響的研究

徐鴻毅1鄧 鎧1羅清炳1張 鑫1張昌軍1**張衷源1張櫻馨2
1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（十堰 442000）；
2.湖北醫(yī)藥學(xué)院

摘要目的 探討在體外受精胚胎移植（IVF-ET）中提前冷凍精液對胚胎質(zhì)量的影響。方法 回顧性分析2012 年1月至2014年12月進(jìn)入IVF周期取精困難男性患者75例，均采用提前冷凍精子，其中在取卵當(dāng)天重新獲取新鮮精液組45例（A組），使用冷凍精子組30例（B組），比較兩組受精率、平均卵裂球數(shù)、平均碎片率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和臨床妊娠率。 結(jié)果 A組與B組相比，正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、平均卵裂球數(shù)、平均碎片率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率和臨床妊娠率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。 結(jié)論 在IVF-ET中，預(yù)知取卵當(dāng)天男方取精困難采用提前冷凍精子，這可能不會影響胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能。

關(guān)鍵詞受精,體外;胚胎移植;精液保存;胚胎質(zhì)量

**通訊作者，E-mail:sycjzhang@sohu.com

Key woorrddss fertilization in vitro;embryo transfe;semen preservation;embryo quality

輔助生殖技術(shù)中女方在經(jīng)過促排卵治療后的適合時間進(jìn)行取卵手術(shù)（oocyte pick-up，OPU），在取卵當(dāng)天要求男方提供足夠數(shù)量和較好質(zhì)量的精子才能完成體外受精,一般情況下，在取卵當(dāng)天要求男方在有限的時間內(nèi)采用手淫法取精，一些患者取精時可能由于精神過度緊張等出現(xiàn)取精困難，以至于導(dǎo)致手術(shù)當(dāng)天失敗，這樣給患者帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失和心理負(fù)擔(dān)。本研究對IVF過程中可能出現(xiàn)取精困難的患者在預(yù)知OPU日之前進(jìn)行精子冷凍，并與在取卵當(dāng)天經(jīng)過輔助措施成功獲取精液的患者的胚胎質(zhì)量進(jìn)行比較，以評價提前冷凍精液對胚胎質(zhì)量的影響。

資料與方法

一、研究對象

2012年至2014年在我中心行IVF助孕治療的夫婦75對,其中男、女方年齡分別為（33.12±5.21）歲和（31.43±4.38）歲,不孕年限為（3.76±2.41）年,進(jìn)入周期前進(jìn)行至少有2次常規(guī)精液分析正常。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1） 生殖?？瞥Ｒ?guī)檢查未發(fā)現(xiàn)異常，無糖尿病、高血壓、生殖器官損傷病史；（2）醫(yī)院精液檢測取精至少發(fā)生取精時間超過1h視為取精困難； （3）女方月經(jīng)規(guī)律，卵巢功能、性激素均正常；（4）促排卵方案均采用降調(diào)節(jié)長方案。排除未行囊胚培養(yǎng)患者。夫婦雙方均簽署知情同意書。

二、促超排卵及卵泡監(jiān)測

所有患者均采用垂體降調(diào)節(jié)長方案，患者于前次月經(jīng)周期黃體期開始用達(dá)必佳針劑（德國輝凌公司生產(chǎn)，0.05mg/d），果那芬（FSH,瑞士雪蘭諾公司生產(chǎn)）或者果那芬聯(lián)合絕經(jīng)期促性腺素（HMG，珠海麗珠公司生產(chǎn)）超促排卵，當(dāng)B超監(jiān)測直徑達(dá)16～18mm卵泡超過3個時，停用FSH 或HMG，于當(dāng)晚肌肉注射人絨毛膜促性腺素（HCG，珠海麗珠公司生產(chǎn)）5 000～10 000 IU，36h后經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。

三、精液冷凍方法

室溫下操作，用巴斯德管按照等體積加入精子冷凍液，加入精子冷凍液（Sperm Freezing Medium,丹麥ORIGIO公司）時要逐滴加入，這樣使冷凍液濃度逐漸升高。邊加邊輕輕搖晃取精杯，使之充分混勻。5min內(nèi)加完精子冷凍液。加完后，準(zhǔn)備好精子冷凍管，一般規(guī)格為5mL，加入精液和精子冷凍液的混合液體。這個分裝過程和上一步混勻的過程總共時間不要超過15min。解凍方法：室溫下放置5min，然后37℃恒溫箱放置20min，最后按精液常規(guī)處理。

四、受精判斷，胚胎質(zhì)量評判

受精后16～18h觀察原核情況，若出現(xiàn)兩原核判斷為正常受精。受精后胚胎在體外培養(yǎng)24～48h，于取卵后的第3天根據(jù)Ziebe等[1]移植胚胎進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評分，Ⅱ級以上的胚胎均為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅲ級以上為可利用胚胎。優(yōu)質(zhì)胚胎率=（Ⅰ級+Ⅱ級）胚胎數(shù)量/胚胎總數(shù)；可利用胚胎率=（I級+Ⅱ級+Ⅲ級）/胚胎總數(shù)；囊胚形成率= 囊胚數(shù)量/可利用胚胎數(shù)量。妊娠的判斷是胚胎移植后14d為生化妊娠，第4周B超檢查有胎心搏動為臨床妊娠。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入和處理，結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）或率（%）表示，計量資料采用方差分析，計數(shù)資料采用x2檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

新鮮精液組和冷凍精液組的男女方年齡、不孕年限、平均獲卵數(shù)、成熟卵率之間無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。受精后比較正常受精率、卵裂率、平均碎片率、平均卵裂數(shù)目、優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚形成率、臨床妊娠率均無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 新鮮精液組和冷凍精液組胚胎質(zhì)量比較

討 論

取精困難在輔助生殖技術(shù)中是女方取卵當(dāng)天很常見的意外情況，一些患者因在醫(yī)院特定的環(huán)境和時間導(dǎo)致心理精神因素[2]短暫性引起勃起功能障礙導(dǎo)致取精失敗。一旦發(fā)生取精失敗，將會給患者帶來很大的精神壓力和取消周期的風(fēng)險，目前避免OPU當(dāng)天因取精失敗取消周期的方法有很多，如：冷凍卵子、附睪穿刺和提前冷凍精子。然而冷凍卵子對卵子造成的傷害不能達(dá)到較理想的效果[3,4]，附睪穿刺給患者帶來極大的痛苦和一系列并發(fā)癥[5]，而且也可能導(dǎo)致穿刺失敗。目前精子冷凍技術(shù)較為成熟，對患者生理和心理造成的損傷小，因此本中心把精子冷凍可作為優(yōu)選考慮的取精方式，其中預(yù)測OPU當(dāng)天可能取精失敗共75例進(jìn)行知情同意提前凍精，在取卵前交待患者嘗試取精，經(jīng)過心理疏導(dǎo)、音像刺激和器械輔助取精，45例成功取精，30例取精失敗使用了凍精進(jìn)行體外受精。

本研究中凍精組和新鮮精液組中IVF與ICSI受精方式比例沒有差別，所冷凍的精液標(biāo)本參數(shù)均符合常規(guī)體外受精標(biāo)準(zhǔn)，復(fù)蘇后均有活動精子，ICSI操作時均選取的形態(tài)正常和前向運(yùn)動的精子。結(jié)果顯示兩組受精后的受精率和卵裂率沒有差異性，說明冷凍精子可能并不影響其受精能力和胚胎卵裂。在胚胎卵裂過程中胚胎卵裂速度在傳統(tǒng)評判胚胎質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中是考慮的首位因素，卵子受精后16～20 h 為受精卵，44～48 h 發(fā)育至4 細(xì)胞期，64～72 h為6～8 細(xì)胞期。胚胎生長速度過快或過慢都會影響胚胎植入，本研究中兩者平均卵裂球數(shù)均在6細(xì)胞核8細(xì)胞之間，說明對胚胎卵裂速度影響不大。胚胎碎片的量也是衡量胚胎質(zhì)量的一個重要參數(shù)，碎片產(chǎn)生的原因可能與配子質(zhì)量有關(guān)。研究報道精子DNA碎片率高的精子所得到的優(yōu)質(zhì)胚胎率下降[6]，而冷凍精子復(fù)蘇后會增加精子的DNA損傷，影響精子的DNA完整性[7]，但精子DNA損傷不影響卵子受精和早期卵裂[8,9]。1979年Generoso研究報道DNA損傷的精子進(jìn)入卵子后，卵子對其修復(fù)作用，而Bukulmez等[10]認(rèn)為一旦受精完成后，胚胎的發(fā)育與精子的來源無關(guān)，而本文兩組平均碎片和優(yōu)質(zhì)胚胎率沒有明顯差異，也進(jìn)一步說明冷凍精子對早期胚胎的質(zhì)量影響不大。早期卵裂胚胎繼續(xù)培養(yǎng)第五天能夠發(fā)育為囊胚，說明胚胎具有一定的發(fā)育潛能，而其發(fā)育速度和碎片形成情況也是決定囊胚形成的關(guān)鍵因素[11]，本研究中精子冷凍組的囊胚形成率和妊娠率略低于新鮮精子組，但沒有差異性。說明精子冷凍也可能不會影響胚胎發(fā)育潛能，本研究需要進(jìn)一步增加樣本量來證實。

總之，對于取卵日男性患者可能取精失敗采用提前冷凍精子是一種有效的辦法，并且不影響卵子受精、卵裂、胚胎質(zhì)量和發(fā)育潛能。由于配子在冷凍過程中遭遇冷凍損傷和死亡，以及冷凍和受精方式可能對子代造成的遺傳學(xué)風(fēng)險和出生缺陷還未明確，并且冷凍精子本身存在解凍不復(fù)蘇的風(fēng)險或因不可抗拒的外力因素造成精子損毀。因此還是盡可能使用新鮮精液是最安全的保障，故術(shù)前評估男性患者取精情況對于避免發(fā)生取精失敗非常重要。而對既往發(fā)生過獲卵日取精失敗的患者，則應(yīng)當(dāng)提前取精冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻(xiàn)

1 Ziebe S,Petersen K,Lindenberg S,et al.Embryo morphology or cleavage state:how to select the best embryos for transfer after in vitro fertilization.Hum Reprod 1997;12(7):1545-1549

2 Ojha K,Nargund V,Nargund G.Emergency sperm extraction for transient erectile dysfunction prior to assisted conception.J Assist Reprod Genet 2001;18(1):34-35

3 朱偉杰,李菁.冷凍保存對人類卵子結(jié)構(gòu)與功能的影響.生殖與避孕 2005;25(7):418-420

4 Gook DA,Edgar DH.Human oocyte cryopreservation.Hum Reprod Update 2007;13(6):591-605

5 DonosoP,Tournaye H,Devroey P,et al.Which is the best sperm retrieval technique for non-obstructive azoospermia? A systematic review.Hum Reprod Update 2007;13(6):539-549

6 徐步芳,孫貽娟,陸小激.精子DNA碎片率對常規(guī)體外受精-胚胎移植結(jié)局的影響.中國男科學(xué)雜志2011;25(8):23-26

7 Di Santo M,Tarozzi N,Nadalini M,et al.Human sperm cryopreservation:update on techniques,effect on DNA integrity,and implications for ART.Adv Urol 2012;2012:854837

8 Fatehi AN,Berets MM,Sehoevers E.DNA damage in bovine sperm does not block fertilization and early embryonic developmentbut induces apoptosis after the fl int cleavages.J Androl 2006;27(2):176-188

9 Hnida C,Engenheiro E,Ziebe S.Computer-controlled,multilevel,morphometric analysis of blastomem size as biomarker of fragmentation and multinuclearity in human embryos.Hum Reprod 2004;19(2):288-293

10 Bukulmez O,Yucel A,Yarali H,et al.The origin of spermatozoa does not affect intracytoplasmic sperm injection outcome.Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 2001;94(2):250-255

11 Stoop D,Van den L,Vanden Abbeel E,et al.Should a single blastocyst transfer policy be a clinical decision or should it depend on the embryological evaluation on day 3.Reprod Biol Endocrinol 2011;9:60

（2015-09-17收稿）

*基金項目資助：國家青年科學(xué)基金項目（81401200）

Analysis of embryo quality of sperm cryopreservation from these patients who were hard to procure semen on the day of oocyte retrieval＊

Xu Hongyi1,Deng Kai1,Luo Qingbing1,Zhang Xin1,Zhang Changjun1**,Zhang Zhongyuan1,Zhang Yingxin2
1.Departmen of Reproductive Medicine Center,People Hospital,Hubei Medical College,Shiyan 442000,Hubei,China;
2.Hubei Medical College
Corresponding author:Zhang Changjun,E-mail:sycjzhang@sohu.com

AbstractObjective To explore the effects of frozen sperm for insemination on the day of oocyte pick-up (OPU) on embryo quality in vitro fertilization-embryo transplantation.Metthhooddss Seventy-fi ve male patients with sperm cryopreservation ahead of time who were retrospectively analyzed from January 2012 to December 2014,were divided into group A (45 cases,fresh semen,group B(30 cases,frozen semen).The rates of fertilization,cleavage,high quality embryo were comparatively analyzed between two groups.Ressuullttss there were no statistical differences between group A and group B in the oocyte numbers,the maturing oocytes rate,the normal fertilization rate,the cell number of embryothe,the fragment rate,good-quality embryo rate and blastocyst formation rate(P>0.05).Concluussiioonn This study suggests that frozen semen in advance do not affect the embryo quality and potentiality development for the patients who were hard to procure semen on the day of oocyte retrieval.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.002

中圖分類號R 321-3