戢開麗 郭江華 梁輝洪 關(guān)藝青 婁 娟江門市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學中心（廣東江門 529030）

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精子形態(tài)可否預測精子其他參數(shù)和受精結(jié)局

戢開麗 郭江華 梁輝洪 關(guān)藝青 婁 娟
江門市中心醫(yī)院生殖醫(yī)學中心（廣東江門 529030）

摘要目的 探討精子形態(tài)在輔助生殖治療中對選擇授精方法時有否預測價值和意義。方法 回顧性分析2012年6月至2015年2月接受輔助生殖治療的1 951周期患者精液資料，根據(jù)《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第五版）精子正常形態(tài)率參考值下限為4%，將患者的精子正常形態(tài)率分成3組：A組＜1.0% 470周期，B組1%～4% 562周期，C組≥4% 919周期，分別采用常規(guī)體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）以及IVF受精失敗后補救ICSI（RICSI）授精方式，比較3組精子正常形態(tài)與其他精液參數(shù)相關(guān)性，與授精方式、受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率的關(guān)系。結(jié)果 除了頂體酶外，精子濃度、活力、前向運動率、DNA完整率在3組形態(tài)間都差異極顯著（P＜0.01），而且它們與精子正常形態(tài)呈顯著的正相關(guān)；授精方式上3組的IVF比例分別是72.3%、86.7%、96.8%，ICSI組27.7%、13.3%、3.2%，3組間授精方式差異極顯著（P＜0.01），RICSI比例也隨著精子正常形態(tài)率升高而降低；受精結(jié)局上，只有IVF組3組形態(tài)間受精率（67.0%、70.0%和79.6%）差異極顯著（P＜0.01），且和精子正常形態(tài)率趨勢一致；胚胎質(zhì)量反映在不同授精方式上趨勢各有不同。結(jié)論 精子正常形態(tài)與其他大部分的精液參數(shù)有正相關(guān)性，影響IVF的受精率，故在輔助生殖治療中對授精方式選擇有一定指導意義。

關(guān)鍵詞受精,體外;精子形態(tài);DNA完整率;受精率

Key woorrddss Fertilization In Vitro;sperm morphology;DNA integrity;fertilization rate

近年來受環(huán)境和社會壓力等影響男性的生殖健康呈下降趨勢，據(jù)統(tǒng)計全球約有10%～15%的不孕不育夫婦，其中近一半是男性因素導致不育，需要尋求輔助生殖技術(shù)幫助。在輔助生殖治療的過程中，精子與卵子結(jié)合是一個復雜的過程，影響因素很多，其中精子形態(tài)對受精率的影響一直存在著爭議。2010年《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）》[1]（以下簡稱WHO第五版）將精子正常形態(tài)率的參考值下限從第四版的15%下調(diào)至4%，這個重大的變化讓我們重新審視精子正常形態(tài)對生育力的預測。精子正常形態(tài)率低是否影響體外受精（In vitro fertilization，IVF）受精率呢？是否需要把精子正常形態(tài)作為卵胞漿內(nèi)單精子注射（Intracytoplasmic Sperm Injection，ICSI）的指征？目前有關(guān)精子形態(tài)相關(guān)的報道[2-7]大部分是遵循WHO第四版手冊的分類標準。本文根據(jù)WHO第五版精子正常形態(tài)率4%的參考值下限，將精子正常形態(tài)率分為3組：＜1.0%， 1%～4%和≥4%，以探索精子形態(tài)是否可預測精子功能和輔助生殖技術(shù)（ART）治療的受精結(jié)局。

材料與方法

一、對象與分組

選擇江門市中心醫(yī)院生殖中心2012年6月至2015 年2月接受ART治療1951周期，其中IVF治療的夫婦1 717 周期，ICSI治療的夫婦234周期，入選條件女方≤35歲，并排除全卵不熟和透明帶異常的周期。女方平均年齡（30.3±3.1）歲，男方平均年齡（32.9±4.1）歲。平均不育年限（4.1±2.7）年，其中原發(fā)不孕1173周期，繼發(fā)不孕778周期。按患者的精子正常形態(tài)率分成3組：A組 ＜1.0% 470周期，B組1%～4% 562周期，C組≥4% 919周期，分別采用常規(guī)IVF或ICSI授精方式。

二、方法

（一）促排卵方案

促排卵采用長方案、短方案、拮抗劑方案等，卵泡發(fā)育成熟后，注射HCG 5 000～ 10 000IU，于35～36h在超聲引導下經(jīng)陰道穿刺取卵。

（二）精液分析及處理

禁欲3～7d，手淫法獲取精液，按照WHO第五版操作程序，對原始精液標本進行精子的濃度、活率、頂體酶、DNA完整率等常規(guī)檢查和改良巴氏染色法精子形態(tài)學檢查。正常形態(tài)的精子是頭部光滑呈橢圓形，頂體占40%～70%；中段細長規(guī)則，長度與頭部相等；主段比中段細，長約45μm[1]。精子正常形態(tài)率≥4%為形態(tài)正常的精子，2%～4%為輕度畸形精子，1～2%為中度畸形精子，＜1%重度畸形精子。

取卵日，精子濃度≤1×106/mL或活力＜10%行ICSI，否則行IVF授精。精液采用密度梯度離心+上游法處理，調(diào)整精子濃度為1×106/mL進行IVF授精。若處理后濃度低于0.2×106/mL，則改行ICSI。

（三）體外受精與胚胎移植

常規(guī)IVF：取卵后2～4h將卵冠丘復合體加入含精子的100μL受精滴中，3～4h后去除顆粒細胞，觀察卵子的第二極體排出情況以確定是否受精，如果疑似雙極體（2pb）≤25%，則行補救ICSI（Rescue ICSI，RICSI）。然后轉(zhuǎn)移到卵裂期胚胎培養(yǎng)液中，置于6%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，試劑采用Quinn’s Advantage序貫培養(yǎng)基（SAGE，美國）。

ICSI：取卵后4～5h將卵冠丘復合體放在80IU/mL透明質(zhì)酸酶（SAGE，美國）消化30～60s，然后用拆卵針去除顆粒細胞，在顯微操作儀中行ICSI操作。

授精后16～18h觀察原核，見雙原核（2PN）為正常受精，第二天、第三天觀察胚胎發(fā)育，根據(jù)發(fā)育速度、卵裂球大小均勻及碎片等情況評估胚胎質(zhì)量。第三天胚胎細胞數(shù)在6～9個，碎片≤25%且均一或相對均勻的為優(yōu)質(zhì)胚胎。選擇第三天細胞數(shù)多且碎片少的胚胎進行移植。

三、統(tǒng)計學方法

用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析、x2檢驗和相關(guān)性分析，P＜0.05表示差異具統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、我院精子正常形態(tài)率百分位數(shù)分布

從表1中可見，我院患者群體的精子正常形態(tài)率檢查結(jié)果低于WHO第五版的調(diào)查數(shù)據(jù)。

表1　 我院精子正常形態(tài)率百分位數(shù)與WWHHOO第五版比較

二、3組患者的基本情況比較

對A組、B組、C組的女方年齡、男方年齡、不孕年限、基礎(chǔ)FSH值、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)和獲卵數(shù)等基本情況進行比較，3組間均無顯著差異（P＞0.05）（表2）。

表2　 3組患者的基本情況比較

三、3組患者的精液常規(guī)比較和相關(guān)性分析

A組、B組、C組3組形態(tài)的精液常規(guī)比較， 各組間濃度、活力、前向運動率、頂體酶、DNA完整率均差異顯著（P＜0.01）；而且除了頂體酶外，隨著精子正常形態(tài)率的升高，其他精液參數(shù)都呈上升趨勢。精子正常形態(tài)與其他精液參數(shù)的相關(guān)性分析也發(fā)現(xiàn)，除了頂體酶外，都呈現(xiàn)正相關(guān)，（表3）。

四、3組患者的授精方式比較

3組間IVF和ICSI的授精方式差異顯著（P＜0.01），隨著精子正常形態(tài)率的升高，ICSI比例逐漸降低，A 組ICSI比例27.7%最高，C組極少部分行ICSI，只有3.2%。RICSI授精方式中，其比例也隨著正常形態(tài)率升高而降低，（表4）。

表3　 3組形態(tài)患者的精液常規(guī)比較和相關(guān)性分析

表4　 3組患者的授精方式比較

五、3組形態(tài)患者受精結(jié)局和胚胎質(zhì)量比較

在IVF組中，3組間受精率差異極顯著（P＜0.01），隨著精子正常形態(tài)率的升高，受精率也逐漸提高，卵裂率差異不顯著，優(yōu)質(zhì)胚胎率差異極顯著（P＜0.01），但其趨勢與精子正常形態(tài)相反。在ICSI組中，3組間受精率差異顯著（P＜0.05），但受精率與精子正常形態(tài)率的趨勢不一致，卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率都差異不顯著（P＞0.05）。在RICSI組中，3組間的受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率都差異不顯著（P＞0.05），（表5）。

表5　 3組患者受精結(jié)局和胚胎質(zhì)量比較

討 論

受精過程中精卵結(jié)合是一個復雜的過程，包括卵母細胞成熟、精子成熟、精子獲能、精子穿過透明帶、配子融合、卵子激活等等，任何一個環(huán)節(jié)出錯都可能導致受精失敗。在許多受精失敗的案例里，有時我們很難判定是卵子還是精子的原因。Ombelet等[8]認為精子形態(tài)對精卵結(jié)合很重要，但一旦精子到達卵胞質(zhì)就失去預測的價值了，他還建議精確和嚴格的精子形態(tài)檢查對受精潛能是有預測價值的。這符合WHO第五版對精子形態(tài)正常率的修訂。但迄今為止，精子形態(tài)的預測作用仍存在爭議，許多研究[2-4,9-11]表明精子形態(tài)是影響IVF結(jié)局的一個重要指標，而有些研究[7,12-13]又認為精子形態(tài)既不影響受精率也不影響妊娠結(jié)局。

本研究結(jié)果顯示精子形態(tài)影響其他大部分精液常規(guī)的參數(shù)，如精子濃度、活力、前向運動率、DNA完整率等，精子正常形態(tài)率與它們都呈顯著的正相關(guān)。Gandini 等[14]也認為形態(tài)缺陷伴有DNA碎片的增加。正因為如此，3組精子形態(tài)的ICSI比例、RICSI比例也隨著精子正常形態(tài)率升高而逐漸下降。IVF組中，3組間受精率差異顯著（P＜0.01），并且隨著精子正常形態(tài)率的升高而上升，說明精子形態(tài)一定程度上影響IVF的受精（其結(jié)果與大部分報道[2-5,11]一致）。而在ICSI組中，3組間受精率雖然差異顯著（P＜0.05），但與精子正常形態(tài)率的趨勢不一致，這可能是3組間ICSI的樣本量差異有關(guān)，在C組中，ICSI比例只有3.2%（29周期），而A組ICSI比例是27.7%（130周期）。另外Li等[11]認為胚胎學家在顯微鏡下盡可能選擇看起來形態(tài)正常的精子進行ICSI操作，故受精的精子不能代表精子樣本總體形態(tài)情況，也可能是ICSI受精率與精子正常形態(tài)率不是一個規(guī)律性的變化。

與精子形態(tài)對IVF沒有預測作用的報道比較發(fā)現(xiàn)，第一個原因，可能跟IVF和ICSI的比例不同有關(guān)，有些國家使用ICSI不到總周期的30%，有些超過50%甚至高達到90%以上，如美國2013年ICSI比例是67%[15]，英國是52.6%[16]。ICSI比例的加大，IVF受精率受精子形態(tài)影響就弱化了。本文ICSI和RICSI的總比例是23.6%，不到30%。第二個原因，可能精子形態(tài)分組不一樣，王晟等[7]把精子正常形態(tài)率分為5%～10%、10%～15%和≥15% 3組，甚至沒有≤5%的數(shù)據(jù)，故得出的結(jié)論是當正常形態(tài)精子百分率＞5%時，精子形態(tài)對常規(guī)IVF的治療結(jié)局沒有影響。本文按照WHO第五版的標準和趨勢，把精子形態(tài)分組細化，分節(jié)點為1%、4%，在極低的精子正常形態(tài)率中，對IVF受精的影響就凸顯出來了。

胚胎質(zhì)量上無論IVF組還是ICSI組，優(yōu)質(zhì)胚胎率趨勢與精子正常形態(tài)率不相同，說明精子形態(tài)可能不影響胚胎質(zhì)量。但是即使本研究顯示精子形態(tài)對IVF受精率有影響，但是在A組（＜1%）中受精率是67.0%，仍然較衛(wèi)生部規(guī)定的65%高[17]。故建議，精子形態(tài)在指導授精方式選擇的時候，還要結(jié)合精液常規(guī)的其他參數(shù)，如DNA完整性，以及精子染色質(zhì)凝聚性、精子凋亡等等。

另外，高洋等[2]提出雖然精子形態(tài)可以預測IVF受精率，但受實驗條件、技術(shù)人員主觀差異的影響，各生殖中心應(yīng)建立自己的正常形態(tài)cut-off值作為常規(guī)IVF選擇。與WHO第五版比較，本中心精子正常形態(tài)率的百分位數(shù)分布顯示，整體精子正常形態(tài)率低很多，WHO第五版第50個百分位是15.0%，我們是3.86%，這都提示在精子正常形態(tài)的診斷中技術(shù)人員主觀性可能起了非常大的影響。印度為了降低技術(shù)人員的主觀差異專門組織174名實驗工作人員進行精子形態(tài)培訓[18]，這是非常必要的。此外，精子形態(tài)檢查還具有多態(tài)性，Nikolettos等[19]指出用光學顯微鏡行精子檢查只能提供有限的信息，精子的超微結(jié)構(gòu)更能說明形態(tài)對精子的影響。因此，胞質(zhì)內(nèi)形態(tài)學選擇精子注射（IMSI）和活動精子細胞器形態(tài)學檢查（MSOME）技術(shù)的應(yīng)運而生，希望能改善ICSI的臨床結(jié)局。

總之，精子形態(tài)一定程度上預示著精子的功能，影響輔助生殖治療中IVF的受精結(jié)局。但在選擇IVF還是ICSI的授精方式時，最好結(jié)合其他精液常規(guī)，如精子濃度、活力和DNA完整率等，防止IVF完全不受精或ICSI的過度使用。

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（2015-06-15收稿）

·臨床經(jīng)驗·

Effects of sperm morphology on sperm function and fertilization outcomes

Ji Kaili,Guo Jianghua,Liang Huihong,Guan Yiqing,Lou Juan
Center for Assisted Reproduction,Jiangmen Central Hospital,Jiangmen 529030,Guangdong,China

AbstractObjectivee To investigate the infl uence of sperm morphology on sperm function and fertilization outcomes of in vitro fertilization (IVF),and explore its prediction value in choosing treatment methods on assisted reproductive technology(ART).Metthhooddss This study retrospectively analyzed 1951 cycles of infertile couples treated with conventional IVF,ICSI or rescue ICSI(RICSI) from June 2012 to February 2015,and according to 4% as the lower reference limits of sperm normal morphology provided by WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (5th Edition),the cycles were divided into three groups:470 cycles with values<1.0% in A group;562 cycles with values ≥1.0% and <4% in B group;and 919 cycles with values ≥4.0% in C group.Ressuullttss There were extremely signifi cant differences in sperm concentration,total motility,progressive motility and DNA integrity among three groups (P<0.01),but no signifi cant difference in acrosin activity.There were positive correlations between sperm normal morphology and other parameters.Meanwhile,the percentage of IVF was 72.3%,86.7% and 96.8%,and the percentage of ICSI was 27.7%,13.3% and 3.2%,respectively,there were statistically signifi cant differences in treatment methods (P<0.01).the percentage of RICSI decreased by sperm normal morphology.Fertilization rate (67.0%,70.0% and 79.6%) had extremely signifi cant difference only in conventional IVF group(P<0.01),and with the increase in sperm normal morphology,fertilization rate increased;there was no consistent trend in embryo quality among different insemination ways.Concluussiioonn There is positive correlation between sperm normal morphology and most semen parameters,and sperm morphology infl uences IVF fertilization rate,which is some valuable indicatior to select IVF or ICSI on ART treatment.

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2016.01.09

中圖分類號R 321-33