邢　杰　謝　霆　吳朝光

(海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南　?？凇?70311)

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遠(yuǎn)隔缺血時處理對心臟瓣膜置換術(shù)心肌微小RNA表達及心肌細(xì)胞凋亡的影響

邢杰謝霆吳朝光

(海南省人民醫(yī)院心臟外科，海南?？?70311)

〔摘要〕目的探討遠(yuǎn)隔缺血時處理對心臟瓣膜置換術(shù)心肌微小RNA表達及心肌細(xì)胞凋亡的作用。方法心胸外科擇期行體外循環(huán)下心臟瓣膜置換手術(shù)的風(fēng)濕性心臟瓣膜病患者60例按照隨機數(shù)字表法分為遠(yuǎn)隔缺血時處理組和對照組，每組30例。兩組均給予心臟瓣膜置換手術(shù)，其中遠(yuǎn)隔缺血時處理組在阻斷主動脈后立即實施下肢缺血/再灌注處理。 對照組放置止血帶但不進行充氣。分別在體外循環(huán)開始前及主動脈阻斷鉗開放后5 min內(nèi)剪取右心耳組織作為檢測標(biāo)本。實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)檢測和驗證miR-1，miR-21，miR-24和miR-195的表達情況，并采用TUNEL法檢測心肌組織心肌細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果遠(yuǎn)隔缺血時處理組中miR-1和miR-195的表達較對照組降低明顯(P<0.05)，miR-24和miR-21的表達與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在翻譯水平，遠(yuǎn)隔缺血時處理組的Bcl-2的mRNA表達比對照組顯著上調(diào)(P<0.05)，而BAX，PDCD4的mRNA的表達則無明顯改變。心肌缺血前遠(yuǎn)隔缺血時處理組和對照組心肌凋亡細(xì)胞數(shù)目較少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔(4.3±0.3)% vs (4.1±0.2)%，P>0.05〕。心肌再灌注后兩組心肌凋亡細(xì)胞均較缺血前顯著增加，且遠(yuǎn)隔缺血時處理組心肌凋亡較對照組減輕明顯(P<0.05)。結(jié)論遠(yuǎn)隔缺血時處理可以調(diào)控體外循環(huán)心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌MicroRNAs的表達，使miRNA-1和miRNAs-195表達下調(diào)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達和減少促凋亡蛋白BAX表達，心肌細(xì)胞凋亡減少。

〔關(guān)鍵詞〕遠(yuǎn)隔缺血時處理；微小RNA；心肌細(xì)胞凋亡；心臟瓣膜置換術(shù)

心臟外科小樣本量臨床研究證實，遠(yuǎn)隔缺血時處理在 心臟和腎臟等器官保護中發(fā)揮作用，其能夠減少心臟瓣膜置換手術(shù)中心肌肌鈣蛋白(CTn)I釋放，以此來保護心肌〔1〕。但有報道指出，其對心肌等器官的保護效果不明顯〔2，3〕。因此，關(guān)于遠(yuǎn)隔缺血時處理在心臟手術(shù)中的作用目前沒有完全統(tǒng)一的說法，且關(guān)于遠(yuǎn)隔缺血時處理的較大樣本量的臨床研究尚缺乏。微小RNA(miRNAs )在缺血處理的組織及器官中的保護作用機制越來越受到重視〔4，5〕。 miRNAs是一類在進化上高度保守的小分子非編碼RNA，長度為19～25個核苷酸，可發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控蛋白質(zhì)編碼基因表達的作用。研究證實，當(dāng)發(fā)生心肌缺血性損傷時，miRNAs被不同程度地表達，參與心肌缺血再灌注過程并發(fā)揮重要的調(diào)控相應(yīng)基因的作用〔6，7〕。本文進一步明確遠(yuǎn)隔缺血時處理對心肌miRNAs表達及心肌細(xì)胞凋亡的影響。

1資料與方法

1.1一般資料2013年1月至2015年1月在我院心胸外科擇期行體外循環(huán)下心臟瓣膜置換手術(shù)的風(fēng)濕性心臟瓣膜病患者60例按照隨機數(shù)字表法分為遠(yuǎn)隔缺血時處理組和對照組，每組30例。其中遠(yuǎn)隔缺血時處理組男12例，女18例，年齡42～65歲，平均(52.1±10.5)歲；對照組男14例，女16例，年齡40～63歲，平均(53.9±8.4)歲。兩組年齡、性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。均經(jīng)冠脈造影排除冠心病，且術(shù)前常規(guī)行胸片，心電圖和超聲心動圖檢查，肝腎功能電解質(zhì)等測定。均知情同意，簽署同意書，并經(jīng)倫理委員會通過。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前診斷均符合風(fēng)濕性心臟瓣膜病的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②行人工機械瓣膜置換或生物瓣膜者。 排除標(biāo)準(zhǔn)：合并冠心病或高血壓、合并感染性心內(nèi)膜炎者；先天性心臟瓣膜疾??；合并周圍血管病；不愿意配合者。

1.2方法所有患者術(shù)前準(zhǔn)備，全身麻醉后氣管插管，右頸內(nèi)靜脈及橈動脈分別置管，連續(xù)監(jiān)測體溫、心率、動脈血壓、中心靜脈壓等。全部手術(shù)均由同一外科醫(yī)生操作完成。術(shù)中肝素5 mg/kg，心臟停搏期間維持中度低溫(肛溫在28～31 ℃)，灌注流量約為25 L·min-1·體表面積-1。根據(jù)血氣調(diào)整pH為7.35，動脈血CO2濃度(PaCO2)為35 mmHg左右，動脈血氧濃度(PaO2)維持不低于200 mmHg。阻斷升主動脈后，以220～250 ml/min的流速從主動脈根部灌注，對于有明顯主動脈瓣關(guān)閉不全的患者，可直接切開升主動脈，給予冠狀動脈開口直接灌注。后進行正中胸骨切口，升主動脈遠(yuǎn)端插動脈灌注管，建立常規(guī)的體外循環(huán)。視具體情況給予連續(xù)或間斷縫合。心內(nèi)操作完畢后，開放主動脈阻斷鉗，主動脈根部吸引排氣。檢測血流動力學(xué)相關(guān)指標(biāo)，一旦正常穩(wěn)定，即可停機。常規(guī)關(guān)胸。其中遠(yuǎn)隔缺血時處理組在阻斷主動脈后立即實施下肢缺血/再灌注處理。術(shù)中利用10 cm寬的止血帶包縛于患者右側(cè)下肢近心端，袖帶充氣并加壓至600 mmHg左右維持5 min，之后完全放氣維持5 min，重復(fù)3次。對照組放置止血帶但不進行充氣。術(shù)后均給予常規(guī)監(jiān)護 。

1.3標(biāo)本的采集分別在體外循環(huán)開始前及主動脈阻斷鉗開放后5 min內(nèi)剪取右心耳組織作為檢測標(biāo)本。 標(biāo)本采集后立刻用冰生理鹽水進行快速漂洗，紗布去血后，直接存入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4指標(biāo)檢測①實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)(RT-PCR)檢測和驗證miR-1，miR-21，miR-24和miR-195的表達情況：其中雙向引物序列：Bcl-2為正義：3′GACCTGTAGAGCCGCTTCA5′，反義：3′CCACTTGACCCCCTCCTAA5′；BAX：正義：3′TGAGCCTTTTTCTGGAGAGCC5′，反義：3′GTTTGACCACGAGTTCCGAC5′；PDCD4 ：正義：3′AAGAGTTTACGGGAAAGTAGG′，反義：3′TCATAGGAATCGTAACCTCCCC′；Caspase3為正義：3′CAGAGTTACGGTGTCAGGTCAAG5′，反義：3′CCAAGTAGGTGAGCCGAAACAC5′；GAPDH：正義：3′TAGTGCGGTGTCAAAGGG5′，反義：3′AGTTGTCGCTGTGGGTGAG5′。②TUNEL法檢測心肌組織心肌細(xì)胞凋亡情況：采用TUNEL法對冰凍心肌組織標(biāo)本進行凋亡細(xì)胞檢測，主要實驗試劑配制及實驗操作按照試劑盒進行，主要步驟為組織切片處理→DNA缺口末端標(biāo)記→組織化學(xué)測定→對比染色→封片和顯微鏡檢。鏡檢TUNEL染色陽性細(xì)胞中有棕黃色顆粒者，即凋亡細(xì)胞 。顯微鏡下每張切片隨機選擇5個400倍視野，計算心肌細(xì)胞總數(shù)和陽性心肌細(xì)胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)，其中凋亡指數(shù)=發(fā)生凋亡的細(xì)胞核數(shù)/細(xì)胞核總數(shù)×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗，秩和檢驗。

2結(jié)果

2.1心肌miRNA表達實時熒光定量PCR驗證遠(yuǎn)隔缺血時處理組中miR-1和miR-195的表達較對照組降低明顯(P<0.05)，miR-24和miR-21的表達情況與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2凋亡相關(guān)基因的檢測結(jié)果比較在翻譯水平，遠(yuǎn)隔缺血時處理組Bcl-2 mRNA表達比對照組顯著上調(diào)(P<0.05 )，而BAX，PDCD4的mRNA的表達則無明顯改變。見表2。

表1　各組miRNA實時定量PCR測定結(jié)果比較

與對照組比較：1)P<0.05；下表同

表2　兩組心肌Bcl-2 mRNA、BAX mRNA、

2.3心肌組織凋亡情況的TUNEL檢測結(jié)果比較心肌缺血前遠(yuǎn)隔缺血時處理組和對照組心肌凋亡細(xì)胞數(shù)目較少，且兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義〔(4.3±0.3)% vs (4.1±0.2)%，P>0.05〕。心肌再灌注后兩組心肌凋亡細(xì)胞均較缺血前顯著增加，且遠(yuǎn)隔缺血時處理組心肌凋亡較對照組減輕明顯〔(8.1±2.0)% vs (16.9±2.6)%，P<0.05〕。

3討論

術(shù)后多器官的損傷一直是影響心臟外科患者術(shù)后效果及遠(yuǎn)期生存預(yù)后的重要因素。如何減輕體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)對器官的損傷一直是該領(lǐng)域較為熱門的研究話題。心臟瓣膜疾病是后天性心臟病發(fā)病中較為常見的一種，其中風(fēng)濕性心臟病作為導(dǎo)致心臟瓣膜病變的主要病因，能引起患者心肺肝腎等器官功能不同程度受損〔8～11〕。遠(yuǎn)隔肢體缺血時處理能夠減緩心臟瓣膜置換手術(shù)心肌cTnI的釋放〔12〕。 miRNA的主要作用是與mRNA 3′端非翻譯區(qū)完全或不完全性互補結(jié)合，利用對靶mRNA的抑制或降解，降低相應(yīng)蛋白表達水平〔13～15〕。 miRNA參與細(xì)胞凋亡、分化、能量代謝等多種細(xì)胞生理與病理過程，并與人類常見疾病如心肌梗死、心肌重構(gòu)、心力衰竭、心律失常、心肌肥厚等都有一定的聯(lián)系〔16，17〕。部分miRNA還能夠參與心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生和保護過程。miRNAs還可能參與體外循環(huán)心臟手術(shù)術(shù)后機體的全身炎癥反應(yīng)等過程，通過調(diào)控某些蛋白質(zhì)翻譯和表達，來影響機體多個重要信號傳導(dǎo)通路〔18～20〕。細(xì)胞凋亡途徑包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。Bcl-1，Bax，caspase9、Caspase3等為miRNA調(diào)節(jié)內(nèi)源性途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的主要相關(guān)蛋白〔21，22〕。通過測定miR-133a、miR-133b、miR-208a的表達能夠了解術(shù)后早期的心肌損害及恢復(fù)情況〔23〕。本研究提示遠(yuǎn)隔缺血時處理干預(yù)可以下調(diào)缺血再灌注心肌組織的miR-1和miR-195的表達。miR-1是高度表達于橫紋肌及成人心臟中的一種蛋白，miR-1在缺血再灌注損傷時表達有所增加，相對于健康成人，急性心肌梗死者的血漿miR-1水平升高顯著〔24〕；miR-195不僅可以調(diào)控細(xì)胞周期，并能夠加速細(xì)胞凋亡的進程〔25〕，有研究顯示，miR-195通過降低心肌細(xì)胞sirt1基因的表達來加速細(xì)胞的凋亡〔26〕?？梢妋iR-1及miR-195在心肌損傷級細(xì)胞凋亡中扮演重要作用。本研究提示遠(yuǎn)隔缺血時處理可能通過miR-1和miR-195的下調(diào)途徑使心肌細(xì)胞凋亡減輕。但確切的機制需要更加深入的研究。

Bcl-2基因是目前研究的最深入、最廣泛的凋亡調(diào)控基因之一。其表達和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵，參與細(xì)胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑 。 Bcl-2利用自身的BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2家族的促凋亡蛋白結(jié)合，進而來維持促凋亡成員在細(xì)胞內(nèi)的定位分布，屏蔽細(xì)胞不進入凋亡程序，以此來發(fā)揮抗凋亡功效〔27〕。 Bax作為Bcl-2基因家族的一個亞型，是極重要的促細(xì)胞凋亡基因的一種，與Bcl-2發(fā)揮著相反的作用，能夠加速細(xì)胞的凋亡；下調(diào)miR-1可以減輕H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，其機制可能是利用調(diào)控抗凋亡基因Bcl-2轉(zhuǎn)錄后的表達來發(fā)揮其自身的作用。PDCD4是最早在動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，能夠利用自身功能區(qū)與真核細(xì)胞的翻譯起始因子eIF4A結(jié)合，阻止核糖體復(fù)合物及蛋白質(zhì)的合成，加速細(xì)胞凋亡〔28〕。有學(xué)者指出，miR-21是通過作用于其靶基因PDCD4來發(fā)揮抗凋亡作用，進而發(fā)揮對抗缺血再灌注損傷的作用〔29〕。

綜上，遠(yuǎn)隔缺血時處理可以調(diào)控體外循環(huán)心臟瓣膜置換術(shù)患者心肌MicroRNAs的表達，使miRNA-1和miRNAs-195表達下調(diào)，增加抗凋亡蛋白Bcl-2表達和減少促凋亡蛋白BAX表達，心肌細(xì)胞凋亡減少。 推測遠(yuǎn)隔缺血時處理的心肌保護作用可能通過調(diào)控心肌miRNAs及其相應(yīng)的靶基因和蛋白質(zhì)表達而發(fā)揮作用。

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〔2015-02-19修回〕

(編輯苑云杰)

基金項目：海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項項目(No.ZDXM2015074)

〔中圖分類號〕R654.2

〔文獻標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)09-2105-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.09.024

第一作者：邢杰(1965-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事心臟病研究。