孫文學(xué)，張明慧，劉毅，蘇震（.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 3505；.東營(yíng)市勝利油田中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 東營(yíng) 57000）

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鎂對(duì)人血管平滑肌細(xì)胞鈣化的作用

孫文學(xué)1，張明慧2，劉毅1，蘇震1
（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.東營(yíng)市勝利油田中心醫(yī)院 腎內(nèi)科，山東 東營(yíng) 257000）

［摘 要］目的：研究鎂對(duì)高鈣高磷誘導(dǎo)的人血管平滑肌細(xì)胞（hVSMC）鈣化的影響。方法：無(wú)菌條件下提取胎兒臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，分為正常對(duì)照組（A組）、高鈣高磷組（B組）、高鈣高磷+硫酸鎂組（C組）。B組、C組培養(yǎng)3 d后，部分（B1組、C1組）繼續(xù)高鈣高磷培養(yǎng)液培養(yǎng)，部分（B2組、C2組）換用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)。于12 h、24 h、72 h、第4、第7、第10天測(cè)定細(xì)胞層鈣含量，并采用Western blot法測(cè)定核心結(jié)合因子1（cbfa1）、磷酸核糖焦磷酸合成酶2（Prps2）蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：B組鈣含量升高，C組較B組、C1組較B1組、C2組較B2組，鈣含量均明顯下降（P＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，12 h、24 h、72 h B組Cbfa1表達(dá)升高，C組表達(dá)降低（P＜0.05）；第4、第7、第10天，C1組較B1組、C2組較B2組，Prps2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：高鈣高磷促進(jìn)hVSMC鈣化，鎂抑制了hVSMC鈣化進(jìn)展，激活了Prps2蛋白表達(dá)，促進(jìn)了鈣化消退。

［關(guān)鍵詞］鎂；平滑肌細(xì)胞；成骨樣轉(zhuǎn)化；鈣化；核心結(jié)合因子1；磷酸核糖焦磷酸合成酶2

終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）即尿毒癥已成為重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）是尿毒癥患者的首位死亡原因。研究顯示，血管鈣化尤其是中膜鈣化是導(dǎo)致尿毒癥患者CVD病死率升高的主要原因之一，同時(shí)，也是CVD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素及預(yù)測(cè)因素［1］。目前研究已證實(shí)血管鈣化是一個(gè)受多因素調(diào)控的、與骨發(fā)生類似的、主動(dòng)的可調(diào)節(jié)過(guò)程，其中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞，表達(dá)骨化及礦化相關(guān)蛋白及發(fā)生凋亡的過(guò)程［2］。而核心結(jié)合因子a1（core-binding factor a1，Cbfa1）是VSMC轉(zhuǎn)分化為成骨樣細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，且已證實(shí)停止鈣化干預(yù)措施后血管鈣化是可以主動(dòng)消退的［3-4］。鎂除了參與許多酶的活化外，在骨骼、礦物質(zhì)代謝、血管鈣化方面也起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)鎂可以減輕牛VSMC的鈣化［5］，對(duì)人VSMC（hVSMC）的鈣化也有抑制作用［6-8］，但具體機(jī)制尚不清楚。本課題組前期研究［9-10］發(fā)現(xiàn)磷酸核糖焦磷酸合成酶2（phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2，Prps2）是促進(jìn)大鼠血管鈣化消退的焦磷酸合成相關(guān)基因，而Prps2激活劑絕對(duì)需要Mg2+，故本研究觀察鎂對(duì)高鈣高磷條件下hVSMC成骨樣轉(zhuǎn)化的作用及其可能機(jī)制。

1　材料和方法

1.1主要試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），胎牛血清（美國(guó)Hyclone公司），5%山羊封閉血清（北京Solarbio公司），二甲基亞砜、茜紅素S（美國(guó)Sigma公司），鈣離子檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司），引物（美國(guó)Invitrogen公司），SYBR Green real-time PCR MasterMix（Toyobo公司），蛋白Marker、BCA蛋白分析試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），抗GAPDH單抗、抗α-SMA單抗、抗Cbfa1單抗（美國(guó)Abcam公司），抗Prps2單抗（美國(guó)Abgent公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔和IgG辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（美國(guó)Bioworld公司），硫酸鎂（上海博蘊(yùn)生物科技有限公司）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞提取及培養(yǎng)：無(wú)菌條件下取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院產(chǎn)科胎兒（男嬰，足月）臍帶，長(zhǎng)約5 cm，于超凈工作臺(tái)上操作，將臍帶置于10 cm培養(yǎng)皿中，剝離臍動(dòng)脈（2條），眼科剪將剩余血管組織剪成1 mm×1 mm組織小塊，無(wú)菌吸管吸取組織塊至0.25%胰酶中消化離心，用1 mL移液器吸出上清液，用含20%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)沖懸離心管內(nèi)細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至5 mL培養(yǎng)瓶中；細(xì)胞培養(yǎng)于5% CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，3 d后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后予高糖DMEM培養(yǎng)液換液。

1.2.2細(xì)胞鑒定：細(xì)胞培養(yǎng)6 d后，采用SP法對(duì)hVSMC a肌動(dòng)蛋白（a-smooth muscle actin，a-SMA）進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，貼壁于血蓋片上的原代及第4代hVSMC依次作處理。a-SMA陽(yáng)性染色以胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色為準(zhǔn)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)分空白組（A組）、高鈣高磷組（B組）、高鈣高磷+硫酸鎂組（C組）3組。B組、C組hVSMC培養(yǎng)至細(xì)胞融合70%左右時(shí)換用含高鈣高磷（磷3.0 mmol/L，鈣2.5 mmol/L）培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)以誘導(dǎo)鈣化。培養(yǎng)3 d后，一部分（B1組、C1組）繼續(xù)培養(yǎng)于高鈣高磷培養(yǎng)液中，另一部分（B2組、C2組）換用普通培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。硫酸鎂溶液濃度為3.0 mmol/L。

1.2.4鈣化模型鑒定：倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，茜紅素S染色法觀察鈣沉積。

1.2.5鈣含量測(cè)定：六孔板培養(yǎng)細(xì)胞，分別于12、24、72 h及4、7、10 d后，收集各組細(xì)胞，吹打成懸浮狀態(tài)后，用無(wú)菌PBS液洗滌各組細(xì)胞3次，每次3 min，各孔加入0.6 mol/L鹽酸0.5 mL，37 ℃脫鈣24 h，收集鹽酸懸液，鹽酸懸液中鈣含量用甲氧-酚酞絡(luò)合酮方法測(cè)定。將脫鈣后的細(xì)胞用1×PBS洗滌3次后，用0.1 mmol/L氫氧化鈉0.1 mL與1% SDS（十二烷基硫酸鈉）溶解細(xì)胞，測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣含量，BCA法測(cè)蛋白含量，并以蛋白含量標(biāo)準(zhǔn)化鈣含量。

1.2.6Western blot法檢測(cè)Cbfa1、Prps2的表達(dá)：按照試劑盒要求，分別于12 h、24 h、72 h提取各組細(xì)胞總蛋白，置于-80 ℃保存，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每個(gè)樣本取30 μg蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉2 h，分別加入抗體，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜（10 min，3次），再加入山羊抗兔的二抗（1∶5 000稀釋），孵育2 h，TBST洗3次后，試劑盒顯色，底片經(jīng)掃描儀透掃后，Quantity One軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)得Cbfa1蛋白表達(dá)；第4、第7、第10天提取各組總蛋白，置于-80 ℃保存，BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)蛋白定量、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、化學(xué)發(fā)光、顯影、定量和圖像分析測(cè)得Prps2蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，C1與C2、B1與B2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1hVSMC的鑒定 原代培養(yǎng)獲得的細(xì)胞呈典型的hVSMC形態(tài)：細(xì)胞長(zhǎng)梭形或多邊形，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞核居中，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)呈典型的“峰谷樣”。免疫組織化學(xué)α-SMA染色見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)α-SMA表達(dá)豐富（見(jiàn)圖1）。α-SMA染色陽(yáng)性率超過(guò)95%，純度符合實(shí)驗(yàn)要求。

圖1　hVSMC的α-SMA鑒定（×200）

2.2hVSMC的鈣化鑒定 平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)至70%左右時(shí)換用鈣化培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)9 d，倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變?yōu)槎虠U狀或不規(guī)則形態(tài)。茜紅素S染色，可見(jiàn)鈣化的平滑肌細(xì)胞有橘紅色團(tuán)塊狀沉積（見(jiàn)圖2）。

圖2　茜紅素S染色（×200）

2.3各組平滑肌細(xì)胞鈣含量比較 培養(yǎng)12、24、72 h后，與A組比較，B組鈣含量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)12、24、72 h后C組與B組比較，鈣含量明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。培養(yǎng)4、7、10 d后C1組與B1組比較，C2組與B2組比較，鈣含量均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說(shuō)明硫酸鎂對(duì)VSMC鈣化的進(jìn)展及消退均有作用（見(jiàn)表1-2）。

表1　12、24、72 h各組平滑肌細(xì)胞鈣含量測(cè)定（n=3，±s，μg/mg）

表2　4、7、10 d各組平滑肌細(xì)胞鈣含量測(cè)定（n=3，±s，μg/ mg）

2.4各組鈣化相關(guān)蛋白的表達(dá) A組hVSMC中Cbfa1蛋白表達(dá)量較低，細(xì)胞培養(yǎng)24、72 h B組Cbfa1表達(dá)較A組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），培養(yǎng)12、24、72 h時(shí)C組較B組表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3　不同時(shí)間點(diǎn)平滑肌細(xì)胞Cbfa1蛋白的表達(dá)（n=3，±s）

表3　不同時(shí)間點(diǎn)平滑肌細(xì)胞Cbfa1蛋白的表達(dá)（n=3，±s）

與A組比：aP＜0.05；與B組比：bP＜0.05

細(xì)胞培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)12 h　24 h　72 h A　0.181±0.001ab　0.170±0.001ab　0.601±0.015abB　0.180±0.000ab　0.194±0.003ab　0.944±0.006abC　0.178±0.002ab　0.178±0.000ab0.646±0.008ab組別

各組細(xì)胞培養(yǎng)4、7、10 d，C1組Prps2表達(dá)較B1組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加明顯；C2組較B2組，在4、10 d時(shí)Prps2表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4　不同時(shí)間點(diǎn)平滑肌細(xì)胞Prps2蛋白的表達(dá)（n=3，±s）

表4　不同時(shí)間點(diǎn)平滑肌細(xì)胞Prps2蛋白的表達(dá)（n=3，±s）

與A組比：aP＜0.05；C1與B1組比：bP＜0.05；C2與B2組比；cP＜0.05

細(xì)胞培養(yǎng)各時(shí)間點(diǎn)4 d　7 d　10 d A　0.050±0.001ac　0.066±0.000ac　0.166±0.000acB1　 0.106±0.000ac　0.134±0.001ac　0.175±0.000acC1　 0.115±0.004ab　0.167±0.002ab　0.343±0.002abB2　 0.112±0.000ac　0.211±0.004ac　0.241±0.000acC2　 0.185±0.002ac　0.212±0.000ac　0.226±0.002ac組別

3　討論

血管鈣化是一種異位鈣化，在ESRD患者中十分常見(jiàn)，尤其是維持性血液透析后，血管鈣化發(fā)生早、發(fā)展迅速，導(dǎo)致CVD的病死率明顯增加。礦化的促進(jìn)力和礦化的抑制力之間是否維持著動(dòng)態(tài)平衡，決定著血管鈣化的產(chǎn)生和消退。因此聚焦礦化的抑制因素將有助于尋找防治血管鈣化的新途徑。

鎂為大約300種酶的輔助因子和天然鈣通道阻滯劑，在生理和病理生理方面，扮演重要角色。研究顯示，鎂缺乏與增加代謝綜合征和2型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)及慢性心力衰竭中致命性心臟事件以及血液透析患者動(dòng)脈粥樣硬化和血管鈣化有關(guān)［11］。低鎂血癥與腎臟病發(fā)生及血管鈣化關(guān)系密切［12］。研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)充鎂可延緩血液透析患者動(dòng)脈鈣化的進(jìn)展［13］。低劑量和高劑量硫酸鎂明顯緩解維生素D3加尼古丁誘導(dǎo)的SD大鼠心血管組織的鈣化，以劑量依賴性的方式降低血管鈣化和減少血管損傷［14］。鎂逆轉(zhuǎn)血管鈣化的可能機(jī)制有：①逆轉(zhuǎn)VSMC中鈣的沉積、羥磷灰石結(jié)晶的發(fā)生、生長(zhǎng)［15］；降低Cbfa1、堿性磷酸酶的表達(dá)，抑制并部分逆轉(zhuǎn)血管鈣化；②通過(guò)抑制鈣通道活性，抑制VSMC成骨樣轉(zhuǎn)分化［16］；③通過(guò)短暫受體潛能通道家族（transient receptor potential melastatin，TRPM）7抑制鈣轉(zhuǎn)移入細(xì)胞內(nèi)及基質(zhì)小泡中，從而下調(diào)Pit1，抑制磷進(jìn)入細(xì)胞，抑制Cbfa1介導(dǎo)的VSMC轉(zhuǎn)分化［17］。

本課題組前期研究［9-10］顯示，焦磷酸鹽合成相關(guān)基因Prps2等基因在大鼠血管鈣化消退過(guò)程中差異表達(dá)，在原組織中表達(dá)增高，促進(jìn)血管鈣化消退。Prps屬于激酶類，是催化從ATP和核糖-5-磷酸合成磷酸核糖焦磷酸的一個(gè)酶家族［18］。Prps2基因位于x染色體短臂p22.2-p22.3區(qū)［19］，Prps家族編碼的Prps蛋白是體內(nèi)嘌呤、嘧啶核苷酸從頭合成和補(bǔ)救合成的關(guān)鍵酶，是核苷酸代謝的重要調(diào)節(jié)因子，在細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用［19］。Prps2在增殖較快的組織（如胸腺、肺、胃、小腸等）中表達(dá)量高［20］。其中Prps2激活劑絕對(duì)需要Mg2+，包括與ATP形成Mg2+-ATP及游離的Mg2+。Mg2+與Prps的結(jié)合促進(jìn)Mg2+-ATP與Prps的結(jié)合。Ca2+對(duì)重組Prps2起抑制作用，無(wú)機(jī)磷為維持Prps活性所必需［21］。

本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)胎兒臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞作為觀察對(duì)象，采用高鈣高磷環(huán)境（鈣2.5 mmol/L，磷3.0 mmol/L）誘導(dǎo)hVSMC鈣化，結(jié)果顯示：12 h開(kāi)始B、 B1、B2組hVSMC的鈣含量開(kāi)始明顯增加，一直持續(xù)至第10天，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，鈣含量升高明顯，形成明顯的鈣鹽沉積，茜素紅S染色可見(jiàn)細(xì)胞團(tuán)塊處有橘紅色的鈣鹽沉積形成，說(shuō)明高鈣高磷誘導(dǎo)VSMC鈣化成功。加入硫酸鎂后（C、C1、C2組）在鈣化進(jìn)展及消退過(guò)程中hVSMC鈣含量明顯降低，說(shuō)明硫酸鎂抑制了hVSMC血管鈣化的進(jìn)展，且促進(jìn)了血管鈣化的消退。

正常情況下，hVSMC中Cbfa1蛋白表達(dá)量較低，高鈣高磷誘導(dǎo)后，B組12、24、72 h均表達(dá)增高（P＜0.05），且隨著時(shí)間延長(zhǎng)增加明顯，與B組比較，C組Cbfa1蛋白表達(dá)量降低，說(shuō)明高鈣高磷誘導(dǎo)hVSMC鈣化成功，硫酸鎂抑制了hVSMC鈣化進(jìn)展早期Cbfa1蛋白表達(dá)，抑制了血管鈣化。第4天開(kāi)始各組Prps2蛋白表達(dá)均增高；C1較B1，C2較B2組Prps2蛋白表達(dá)增高明顯，說(shuō)明硫酸鎂在hVSMC鈣化進(jìn)展及消退過(guò)程中激活了Prps2蛋白表達(dá)，抑制了hVSMC成骨樣轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了hVSMC鈣化的消退。

綜上所述，ESRD患者的高鈣高磷環(huán)境對(duì)hVSMC有主動(dòng)調(diào)節(jié)骨轉(zhuǎn)化的作用，而外源性硫酸鎂可能通過(guò)激活Prps2蛋白表達(dá)，抑制hVSMC鈣化進(jìn)展，促進(jìn)鈣化消退。

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（本文編輯：丁敏嬌）

Effect of magnesium on calcification of human vascular smooth muscle cells

SUN Wenxue1，ZHANG Minghui2，LIU Yi1，SU Zhen1. 1.Departmant of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou，325015； 2.Departmant of Nephrology，the Central Hospital，Shengli Oil Field，Dongying，257000

Abstract:Objective: To investigate the effect of magnesium on calcification of vascular smooth muscle cells （VSMCs） induced by elevated calcium （Ca++） and phosphate （P） culture. Methods: The fetus’s umbilical artery VSMCs were extracted under aseptic conditions and cultured in vitro. Cells were divided into three groups: normal control group （normal concentration of Ca++and P，group A），positive control group （high calcium and phosphate，group B），treatment groups （high calcium and phosphate + magnesium sulfate，group C）. The cells were cultured for 3 days，then Part （B1，C1） were continued to develop in high calcium and phosphate culture medium，Part （B2，C2） were changed to develop in ordinary solution. Respectively the calcium content of cell layer were determinated in calcium content test in the 4，7，10 days. Meanwhile，the protein expression of Cbfa1 and Prps2 were observed by Western bloting. Results: The primary cells were identified，purity of cultures was assessed by positive immunostaining for α-SMA. Compared with negative control group，the sedimentary on the cells layer of experimental group （B） was observed. The calcium content in calcium content test showed that the high calcium and high phosphorus group （B，B1 and B2） increased significantly （P＜0.05），compared with the B，B1 and B2 group，magnesium sulfate group （C，C1 and C2） showed a lower intracellular calcium levels. Western blot test results confirmed that: compared with control group （A），the expression of Cbfa1 increased in B group in 24 hours，72 hours； compared with B group，the expression of Cbfa1 declined in C group in 12 hours，24 hours，72 hours. compared with B1，B2 group，the expression of Prps2 increased in C1，C2 group in 4 days，7 days，10 days，was statistically significant （P＜0.05）. Conclusion: High calcium and high phosphorus promote the VSMCs’calcification. While magnesium has a significant effect to inhibit the VSMCs calcification，activate the Prps2 protein expression，promote the calcification fade.

Key words:magnesium； smooth muscle cell； osteogenesis sample transdifferentiation； calcification； corebinding factor α1； phosphoribosyl pyrophosphate synthetase 2

作者簡(jiǎn)介：孫文學(xué)（1976-），女，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY15H270017）；溫州市科技局科研基金資助項(xiàng)目（Y20120020）。

收稿日期：2016-01-08

［中圖分類號(hào)］R453.9

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.009