張艷麗，陳還珍，劉　帥，劉子源，魏　霞

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

?

阿托伐他汀對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子和血管內(nèi)皮的影響

張艷麗1，陳還珍2，劉帥1，劉子源1，魏霞1

1.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(太原 030001)；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院

摘要：目的觀察阿托伐他汀對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子表達(dá)水平的影響。方法 將27只清潔級(jí)C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組，模型組和干預(yù)組飲用2%葡聚糖硫酸鈉(DSS)溶液，干預(yù)組在造模前1周給予阿托伐他汀灌胃，持續(xù)42 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。比較各組小鼠的一般情況和結(jié)腸組織病理學(xué)，ELISA法檢測(cè)血清白介素-8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的水平，免疫組化法檢測(cè)主動(dòng)脈核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)和VEGF的表達(dá)。 結(jié)果與對(duì)照組相比，模型組小鼠腸道黏膜的炎癥表現(xiàn)明顯，血清IL-8和VEGF的水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，干預(yù)組血清IL-8和VEGF的水平顯著降低(P<0.05)，免疫組化法提示小鼠主動(dòng)脈NF-κB和VEGF的表達(dá)減少(P<0.05)。 結(jié)論 阿托伐他汀可能通過降低炎癥因子的表達(dá)水平而發(fā)揮血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：潰瘍性結(jié)腸炎；阿托伐他??；白介素-8；血管內(nèi)皮生長因子；核轉(zhuǎn)錄因子

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是以腸道炎癥為主要表現(xiàn)的慢性復(fù)發(fā)性自身免疫性疾病，屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的范疇，引起腸道炎癥持續(xù)存在的重要原因和特征是黏膜組織中炎細(xì)胞聚集和釋放各種炎癥因子。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是血管壁的慢性炎性疾病，機(jī)體慢性持續(xù)性炎癥狀態(tài)與動(dòng)脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)炎癥性腸病病人患動(dòng)脈粥樣硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加[1]，并提出持久的或活動(dòng)的IBD可能是早期動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。阿托伐他汀是3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑，除了調(diào)脂和穩(wěn)定斑塊的作用，還有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用[2-3]。本研究通過觀察阿托伐他汀對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠炎癥因子表達(dá)水平的影響，探討其是否通過降低炎癥因子的表達(dá)水平而發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物8周齡，體重20 g±2 g，清潔級(jí)C57BL/6小鼠27只，雄性，購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)分子量36 000～50 000，購自MP Biomedicals；白介素-8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)ELISA試劑盒購自Bio-Swamp Life Science；核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)-p65多克隆抗體和VEGF-A多克隆抗體購自Bioworld Technology；免疫組化Ⅱ抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1潰瘍性結(jié)腸炎小鼠模型的建立及分組27只雄性清潔級(jí)C57BL/6小鼠普通飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成3組，每組9只。對(duì)照組：正常飲用滅菌蒸餾水。模型組：自由飲用2%DSS溶液1周，停止飲用DSS溶液改用滅菌蒸餾水1周，如此循環(huán)2.5次，并給予等體積生理鹽水灌胃。干預(yù)組：建模的小鼠提前1周給予阿托伐他汀混懸液10 mg/(kg·d)灌胃，每天1次，持續(xù)42 d至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過程中，每3 d稱重1次，觀察記錄小鼠血便、稀便、腹瀉等腸炎表現(xiàn)。

1.3.2取材給予腹腔注射水合氯醛麻醉后眼眶采血，采血結(jié)束后用脫頸法處死小鼠，游離主動(dòng)脈、結(jié)腸和直腸，切取主動(dòng)脈和肛門至回盲部的整個(gè)結(jié)直腸段，用生理鹽水將主動(dòng)脈和腸管沖洗干凈并將標(biāo)本分為幾段，一部分迅速放入10%中性甲醛中，用于HE染色和免疫組化染色；另一部分迅速置于液氮中，過夜后于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3HE染色將標(biāo)本置于甲醛中固定24 h～48 h，經(jīng)石蠟包埋、切片、常規(guī)脫蠟、HE染色及脫水封片后，比較小鼠腸管病理學(xué)改變。

1.3.4ELISA法測(cè)定血清IL-8和VEGF將血液置于肝素化的EP 管中，靜置后離心(3 500 r/min、10 min)，取血清于-20 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按照試劑盒說明書測(cè)定IL-8和VEGF濃度。

1.3.5免疫組化法檢測(cè)主動(dòng)脈NF-κB和VEGF標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋及切片等，免疫組化操作過程采用SABC法，加入1抗(兔抗鼠NF-κB濃度1∶200、兔抗鼠VEGF濃度1∶200) 和生物素化山羊抗兔IgG，經(jīng)DAB顯色、蘇木素復(fù)染等，在顯微鏡下獲取圖片并分析數(shù)據(jù)。

2結(jié)果

2.1一般情況整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，對(duì)照組小鼠反應(yīng)靈敏、毛色有光澤，糞便呈暗褐色、質(zhì)地較硬，體重均有不同程度的增加；模型組小鼠反應(yīng)遲緩、倦怠懶動(dòng)、食欲減退，稀便或血便，體重均有不同程度的下降，阿托伐他汀干預(yù)后小鼠上述表現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)。

2.2結(jié)腸組織病理損害鏡下可見對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜無充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤；模型組小鼠結(jié)腸組織炎癥明顯，黏膜充血水腫、糜爛，甚至典型潰瘍形成，伴炎細(xì)胞浸潤，腺體排列紊亂甚至消失；干預(yù)組腸道炎癥較模型組明顯減輕，黏膜和腺體逐漸被修復(fù)，黏膜充血水腫、糜爛好轉(zhuǎn)。詳見圖1。

對(duì)照組模型組干預(yù)組

圖1各組小鼠結(jié)腸組織HE染色結(jié)果(×40 倍)

2.3血清IL-8和VEGF的水平比較與對(duì)照組相比，模型組小鼠血清IL-8和VEGF的水平顯著升高；與模型組相比，干預(yù)組血清IL-8和VEGF的水平顯著降低。3組間血清IL-8和VEGF比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1　各組血清IL-8、VEGF水平比較(±s) 　pg/mL

2.4主動(dòng)脈NF-κB和VEGF的水平比較與對(duì)照組相比，模型組和干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈NF-κB和VEGF表達(dá)增加(P<0.05)，主要見于血管內(nèi)皮細(xì)胞(鏡下可見活化的NF-κB主要位于細(xì)胞核；VEGF染色主要位于細(xì)胞質(zhì))，呈棕褐色；與模型組相比，干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈NF-κB和VEGF表達(dá)減少(P<0.05)。詳見表2。

表2　各組主動(dòng)脈NF-κB、VEGF OD值比較(±s)

3討論

潰瘍性結(jié)腸炎的病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子在UC腸黏膜免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。Ross于1999年在損傷反應(yīng)學(xué)說的基礎(chǔ)上，提出動(dòng)脈粥樣硬化是一種炎性疾病，具有慢性炎癥特征的病理過程，其發(fā)生發(fā)展始終伴隨著炎癥反應(yīng)。研究評(píng)估了IBD病人動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)測(cè)因素，發(fā)現(xiàn)IBD存在早期動(dòng)脈粥樣硬化[4]。研究認(rèn)為IL-8在UC發(fā)病過程中不可缺少，能激活并趨化中性粒細(xì)胞，釋放一系列活性產(chǎn)物，引起機(jī)體局部炎癥反應(yīng)。潰瘍性結(jié)腸炎病人腸黏膜高表達(dá)NF-κB-p65，且IL-8表達(dá)水平升高與NF-κB呈正相關(guān)[5]。他汀類除了調(diào)脂和穩(wěn)定斑塊的作用，還有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)等作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清IL-8水平顯著升高，阿托伐他汀干預(yù)后結(jié)腸炎癥明顯減輕，血清IL-8顯著降低，表明阿托伐他汀可降低UC小鼠炎癥因子的表達(dá)。

NF-κB信號(hào)通路是主要的炎癥通路之一，其異常激活與AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[6]。研究顯示活化的NF-κB存在于人類動(dòng)脈粥樣硬化斑塊上。AS小鼠主動(dòng)脈NF-κB mRNA表達(dá)顯著增加，抗AS藥物可降低NF-κB表達(dá)[7]。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠主動(dòng)脈NF-κB表達(dá)增加，阿托伐他汀干預(yù)后小鼠NF-κB表達(dá)減少，與上述研究結(jié)果一致。

VEGF可通過炎癥浸潤和新生血管形成等機(jī)制促進(jìn)AS的形成[8]。正常生理?xiàng)l件下，VEGF呈低表達(dá)或不表達(dá)，但氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、炎癥因子等動(dòng)脈粥樣硬化危險(xiǎn)因素可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，研究表明，人冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊標(biāo)本中VEGF高度表達(dá)，急性冠脈綜合征病人血清VEGF水平也顯著升高[9]。Wilson等[10]證實(shí)，他汀類可減少VEGF的表達(dá)，減少新生血管形成。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠血清和主動(dòng)脈VEGF的水平顯著升高，阿托伐他汀干預(yù)后小鼠血清和主動(dòng)脈VEGF表達(dá)降低。

他汀可抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性和DNA結(jié)合活性，通過抑制基因的表達(dá)和NF-κB的信號(hào)傳導(dǎo)而具有免疫調(diào)節(jié)和抗炎的作用[11]。他汀類藥物的抗炎機(jī)制可能與降低炎癥因子的表達(dá)、減少炎細(xì)胞的黏附和聚集、抑制平滑肌細(xì)胞的增生和遷移有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠炎癥因子表達(dá)水平升高，阿托伐他汀干預(yù)后血清IL-8水平顯著下降，且干預(yù)組小鼠主動(dòng)脈NF-κB和VEGF表達(dá)降低，表明阿托伐他汀可能通過抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，降低炎癥因子的水平，進(jìn)而干預(yù)炎癥反應(yīng)，減少VEGF的表達(dá)而發(fā)揮血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。阿托伐他汀因其多效性可能具有潛在的控制潰瘍性結(jié)腸炎和防治冠狀動(dòng)脈疾病的雙重作用，關(guān)于潰瘍性結(jié)腸炎早期動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及有效的防治策略需要更多大型的臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Papa A，Danese S，Urgesi R，et al.Early atherosclerosis in patients with infiammatory bowel disease[J]．Eur Rev Med Pharmacol Sci，2006，10(1)：7-11.

[2]Ikeda M，Takeshima F，Isomoto H，et al．Simvastatin attenuates trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis，but not oxazalone-induced colitis[J].Dig Dis Sci，2008，53(7)：1869-1875.

[3]Abe Y，Murano M，Murano N，et al.Simvastatin attenuates intestinal fibrosis independent of the anti-inflammatory effect by promoting fibroblast/myofibroblast apoptosis in the regeneration/healing process from TNBS-induced colitis[J].Dig Dis Sci，2012，57(2)：335-344.

[4]Dagli N，Poyrazoglu OK，Dagli AF，et al.Is inflammatory bowel disease a risk factor for early atherosclerosis?[J].Angiology，2010，61(2)：198-204.

[5]甘華田，歐陽欽，賈道全，等．潰瘍性結(jié)腸炎病人核因子-κB活化與細(xì)胞因子基因表達(dá)[J]．中華內(nèi)科雜志，2002，41(4)：252-255．

[6]Orr AW，Hahn C，Blackman BR，et al.p21-activated kinase signaling regulates oxidant-dependent NF-kappa B activation by flow[J].Circ Res，2008，103(6)：671-679.

[7]華先平，孔祥輝，杜令，等．氯吡格雷對(duì)兔動(dòng)脈粥樣硬化基質(zhì)金屬蛋白酶-9及血管壁核因子-κB表達(dá)的影響[J]．臨床心血管病雜志，2007，23(6)：464-467．

[8]Celletti FL，Waugh JM，Amabile PG，et al.Vascular endothelial growth factor enhances atherosclerotic plaque progression[J].Nat Med，2001，7(4)：425-429.

[9]王春彬，高大中．高脂血癥兔主動(dòng)脈NF-κB、VCAM-1和VEGF的表達(dá)及氟伐他汀的影響[J]．中國心血管病研究，2008，6(5)：379-382．

[10]Wilson SH，Herrmann J，Lerman LO，et al.Simvastatin preserves the structure of coronary adventitial vasa vasorum in experimental hypercholesterolemia independent of lipid lowering[J].Circulation，2002，105(4)：415-418.

[11]Zhu T，Wang DX，Zhang W，et al.Andrographolide protects against LPS-induced acute Lung injury by inactivation of NF-κB[J].PLoS One，2013，8(2)：e56407.

(本文編輯郭懷印)

(收稿日期：2015-10-25)

中圖分類號(hào)：R573.1R259

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

doi：10．3969/j．issn．1672-1349．2016．06．012

文章編號(hào)：1672-1349(2016)06-0597-03

通訊作者：陳還珍，E-mail：276085726@qq.com