陳雪婷， 陳　卉， 王洛臨， 李智勇， 施之琪， 徐文杰

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

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星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選廣金錢草提取工藝

陳雪婷1， 陳卉2， 王洛臨1， 李智勇1， 施之琪1， 徐文杰1

（1.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州510095；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州510405）

摘要：目的 優(yōu)選廣金錢草中夏佛塔苷和異牡荊苷的提取工藝。方法 以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間和加液量為自變量，以夏佛塔苷和異牡荊苷含有量的總評“歸一值”為因變量，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選廣金錢草提取工藝。結(jié)果 最佳提取工藝為12倍量65％乙醇提取2次，每次1.2 h。結(jié)論 建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測精確度高。

關(guān)鍵詞：廣金錢草；提取工藝；夏佛塔苷；異牡荊苷；星點設(shè)計-效應(yīng)面法

廣金錢草為豆科植物廣金錢Desmodium styracifolium （Osb）Merr.的干燥地上部分，具有利濕退黃，利尿通淋等功效［1］，其主要含黃酮、生物堿、酚類、鞣質(zhì)、多糖等多種化學(xué)成分［1-3］。目前，國內(nèi)對廣金錢草提取工藝的研究多采用精確度較低的正交設(shè)計或均勻設(shè)計，而且大多以單一成分的定量分析為考察指標(biāo)，顯然不足以滿足日益發(fā)展的質(zhì)量控制要求。本實驗在單因素考察的基礎(chǔ)上，以夏佛塔苷和異牡荊苷含有量為考察指標(biāo)，采用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化廣金錢草提取工藝，旨在為該植物的進(jìn)一步合理研究及開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀，包括DAD檢測器、四元梯度泵（美國安捷倫公司）；Mettler XS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200 DE數(shù)控超聲波清洗器（上海楚定分析儀器有限公司）。

1.2 試藥 夏佛塔苷對照品（批號111912-201301），購自中國食品藥品檢定研究院；異牡荊苷對照品（批號Y-127-110705，純度≥98％），購自成都瑞芬思生物科技有限公司。廣金錢草藥材為廣東市售，經(jīng)廣東省中醫(yī)研究所劉法錦研究員鑒定為豆科植物廣金錢Desmodium styracifolium （Osb）Merr.的干燥地上部分。藥用乙醇（批號20140629，廣東順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 夏佛塔苷和異牡荊苷含有量測定方法［4-5］

2.1.1 色譜條件 Kromacil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（32∶68），等度洗脫；檢測波長272 nm；柱溫30℃；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量5 μL；理論塔板數(shù)按夏佛塔苷和異牡荊苷計算，均不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取夏佛塔苷和異牡荊苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含夏佛塔苷106.425 μg、異牡荊苷20.6 μg的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取廣金錢草提取液（按星點設(shè)計優(yōu)化試驗所得）適量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）對質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程分別為夏佛塔苷Y=2.129 7X+ 6.250 1（r=0.999 97）、異牡荊苷Y=4.302 5 X-1.032 7 （r=0.999 98），表明兩者分別在106.425～1 064.25 ng、20.6～206 ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，在“2.1.1”項色譜條件下測定。結(jié)果，夏佛塔苷、異牡荊苷峰面積RSD分別為0.27％、0.31％，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗 取同一樣品，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下測定。結(jié)果，夏佛塔苷、異牡荊苷含有量RSD分別為0.96％、1.02％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣，測定峰面積。結(jié)果，夏佛塔苷、異牡荊苷峰面積RSD分別為0.62％、0.58％，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密吸取含有量已知的廣金錢草提取液5 mL，置于10 mL量瓶中，分別精密加入“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，甲醇定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液分別進(jìn)樣，測定各成分的含有量，結(jié)果見表1。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.1.9 樣品測定 按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)行分析，結(jié)果見圖1。

1.夏佛塔苷 2.異牡荊苷圖1　高效液相色譜圖

2.2 廣金錢草提取工藝的優(yōu)化

2.2.1 試驗設(shè)計 根據(jù)單因素考察結(jié)果，選擇提取時間（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）及加液量（C）作為考察因素，因提取次數(shù)為非連續(xù)變量，無法進(jìn)行回歸處理，故結(jié)合工業(yè)生產(chǎn)實際暫定為2次。根據(jù)星點設(shè)計原理，每因素設(shè)5水平，用代碼值-α，-1，0，1，α表示，因素水平見表2。然后，以夏佛塔苷、異牡荊苷含有量為評價指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)各設(shè)定為0.5，采用效應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，試驗安排及結(jié)果見表3。

表2　因素水平

表3　星點設(shè)計與結(jié)果

2.2.2 模型擬合 采用Design-Expert8.0.6軟件對各因素進(jìn)行多元回歸分析，發(fā)現(xiàn)三次多項式模型擬合方程有顯著意義，回歸方程為Y=87.45 +5.98A-3.39B+3.96C-2.37AB+0.94AC+0.62BC-2.23A2-7.93B2-0.96C2-1.76A2C-6.05AB2-0.45BC2（r=0.974 3，p<0.05）。根據(jù)所確立的多項式模型，分別繪制因素A、B、C對綜合評分影響的效應(yīng)面圖，見圖2～4。由圖可知，綜合評分值隨提取時間增加，基本呈線性增加趨勢；加液量對綜合評分值的影響逐漸增加，當(dāng)達(dá)到12倍量左右時趨于平穩(wěn)；乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分值的影響基本呈二次關(guān)系，在65％～70％時達(dá)到最大。

2.2.3 工藝條件優(yōu)化與預(yù)測 結(jié)合回歸模型的分析結(jié)果，軟件系統(tǒng)給出綜合評分值大于92分的優(yōu)化方案有39個，各因素取值范圍分別為提取時間1.1～1.29 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)64.79％～69.90％、加液量11.59～12.75倍。綜合考慮生產(chǎn)周期及成本問題，最終確定優(yōu)化提取條件為12倍量65％乙醇提取2次，每次1.2 h。

2.2.4 驗證試驗 按優(yōu)選方案進(jìn)行驗證試驗，平行3次，測得夏佛塔苷和異牡荊苷平均提取率分別為67.23％和54.30％，再將測定結(jié)果與擬合方程預(yù)測值進(jìn)行比較，計算相對偏差［相對偏差=（預(yù)測值-實測值）/預(yù)測值× 100％］。結(jié)果，RSD為1.69％，表明所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測性良好，優(yōu)選工藝條件重復(fù)性理想。

3 討論

廣金錢草主要分布于兩廣地區(qū)，屬于廣東道地藥材，黃酮類化合物是其主要化學(xué)成分?，F(xiàn)代藥理研究顯示，其總黃酮能明顯增加小鼠心肌營養(yǎng)性血流量，增加在體狗冠脈及腦血流量，對小鼠常壓缺氧耐受力有也顯著的增加作用［6-10］，故在工藝優(yōu)選時，選擇黃酮類成分夏佛塔苷和異牡荊苷提取率的綜合評分作為評價指標(biāo)。先通過單因素試驗，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時間、溶劑量對兩者提取率的影響，再進(jìn)一步用星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選這3個參數(shù)，得到最佳提取條件為加入12倍量65％乙醇，提取2次，每次1.2 h。

圖2　提取時間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對綜合評分的影響

圖3　提取時間和加液量對綜合評分的影響

圖4　乙醇體積分?jǐn)?shù)和加液量對綜合評分的影響

在工藝研究中，常用的正交設(shè)計和均勻設(shè)計均基于線性模型，預(yù)測性較差，精確度不高，而星點設(shè)計-效應(yīng)面法很好地克服了這個缺點，通過非線性模型擬合來預(yù)測最佳實驗條件，最大程度上優(yōu)化工藝條件或篩選最優(yōu)處方。本實驗采用該方法對廣金錢草的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)預(yù)測值與實測值比較吻合，相對偏差較小，可為該植物的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)［11-14］。

參考文獻(xiàn)：

［1］ 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：41.

［2］ 高瑞英，郭璇華.廣金錢草化學(xué)成分的分離與鑒定［J］.中藥材，2001，24（10）：724-725.

［3］ 陳豐連，張文進(jìn)，徐鴻華.不同采收期及不同產(chǎn)地廣金錢草地上部分HPLC指紋圖譜研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2010，16（14）：96-98.

［4］ 周子力，肖 峰，楊 靜，等.RP-HPLC同時測定廣金錢草中的vicenin-1、夏佛塔苷和vicenin-3［J］.華西藥學(xué)雜志，2013，28（6）：609-611.

［5］ 蒲曉輝，趙 輝，袁 琦，等.RP-HPLC法同時測定廣金錢草中夏佛塔苷和異夏佛塔苷［J］.中成藥，2014，36（9）：1909-1912.

［6］ 劉 茁，董 焱，王 寧，等.廣金錢草的化學(xué)成分［J］.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2005，22（6）：26-28.

［7］ 李曉亮，汪 豪，劉 戈，等.廣金錢草的化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2007，30（7）：802-805.

［8］ 李 銳.廣金錢草化學(xué)成分及分析方法的研究進(jìn)展［J］.中國藥業(yè)，2009，18（16）：86-87.

［9］ 王緒江，李寶興，盧振權(quán)，等.廣金錢草顆粒對結(jié)石患者尿液的影響［J］.河南外科學(xué)雜志，2012，18（4）：11-12.

［10］ 張德珍，廖咸碩.廣金錢草排石湯對輸尿管結(jié)石ESWL術(shù)后的止痛及排石作用［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2012，18 （17）：289-291.

［11］ 劉穎新，劉利利，邱艷明，等.星點設(shè)計-響應(yīng)面分析法優(yōu)選香薷提取工藝［J］.中國藥房，2014，25（19）：1757-1760.

［12］ 何鳳蘭.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化白芍提取工藝［J］.海峽藥學(xué)，2014，26（8）：24-25.

［13］ 陶 利，曹學(xué)成，周金輝.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化飛揚草提取工藝研究［J］.中國生化藥物雜志，2014，34（4）：161-162.

［14］ 張建軍，付建武，徐 峻.星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選虎杖提取工藝［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32（6）：401-405.

網(wǎng)絡(luò)出版日期：2015-06-04

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/31.1368.R.20150604.1502.001.htm l

作者簡介：陳雪婷（1988—），女，碩士，中藥師，從事中藥質(zhì)量評價及中藥制劑研究開發(fā)。Tel：15920473276，E-mail：397095007@qq.com

收稿日期：2015-02-12

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.046

中圖分類號：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1001-1528（2016）05-1171-04