葉開和， 王小康， 呂艷青， 魏崧丞， 李秀存， 張曉琦， 葉春玲*

（1.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州510632；2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632）

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番石榴葉總?cè)聘纳铺悄虿≈車窠?jīng)病變

葉開和1， 王小康1， 呂艷青1， 魏崧丞1， 李秀存1， 張曉琦2， 葉春玲1*

（1.暨南大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣東廣州510632；2.暨南大學(xué)中藥及天然藥物研究所，廣東廣州510632）

摘要：目的 觀察番石榴葉總?cè)疲═TPGL）對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變（DPN）的改善作用，并探討其作用機制。方法 采用高脂飲食加腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）建立糖尿病大鼠模型。將糖尿病大鼠隨機分為6組，石榴葉總?cè)频?、中、高劑量組［30、60、120 mg/（kg·d）］，正常組，模型組和羅格列酮組。測定坐骨神經(jīng)運動傳導(dǎo)速度（MCV）并對組織HE染色；利用RT-PCR檢測坐骨神經(jīng)組織腫瘤壞死因子-α（Tnfa），白細胞介素-6（Il6）和一氧化氮合酶（iNOS）mRNA的表達量；印跡法檢測蛋白激酶B（AKT）、核轉(zhuǎn)錄因子κB激酶抑制因子IKKα、p65及其各自磷酸化蛋白表達。結(jié)果 與模型組比較，石榴葉總?cè)疲?20 mg/kg）組顯著地改善了坐骨神經(jīng)的神經(jīng)病變（p<0.05）；石榴葉總?cè)骑@著性抑制各炎癥因子mRNA的表達（p<0.05），并顯著下調(diào)p-AKT/AKT、p-IKKα/ IKKα、p-p65/p65的表達（p<0.01或p<0.05）。結(jié)論 石榴葉總?cè)凭哂酗@著改善DPN的作用，其機制可能通過下調(diào)NF-κB介導(dǎo)的信號通路，從而減少炎癥介質(zhì)產(chǎn)生。

關(guān)鍵詞：番石榴葉總?cè)?；糖尿病周圍神?jīng)病變；炎性介質(zhì)；NF-κB通路

KEY WORDS：total triterpenoids from psidium guajava leaves；diabetic peripheral neuropathy；inflammatory mediator；NF-κB pathway

糖尿病周圍神經(jīng)病變（DPN）是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一［1］?，F(xiàn)如今，炎癥對神經(jīng)退行性變化的研究已為人們熟知，其導(dǎo)致周圍神經(jīng)的損傷性病理生理過程源于炎癥介質(zhì)產(chǎn)生的復(fù)雜路徑［2-3］。番石榴葉提取物（主要包含總?cè)疲鳛椤跋式堤悄z囊”的原料藥，在前期研究中發(fā)現(xiàn)其具有一定的抗血糖和腎臟保護作用［4-5］，也有之前的文獻報道了其抗炎作用［6-7］。為進一步探究TTPGL對糖尿病周圍神經(jīng)病變的作用，本實驗建立了糖尿病大鼠模型，觀察其對糖尿病大鼠周圍神經(jīng)病變的影響并探討其作用機制。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠，體質(zhì)量120～130 g，廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SCXK2012-0002。

1.2 藥物與試劑 番石榴葉總?cè)疲═TPGL）提取自番石榴葉（psidium guajava L.）。番石榴葉產(chǎn)地為廣東化州，經(jīng)《中國植物志》特征對比后確定其種屬為桃金娘科番石榴。番石榴葉總?cè)平?jīng)過95％乙醇滲漉提取，過柱，再經(jīng)過50％、80％和95％乙醇溶液梯度洗脫，浸膏用甲醇溶解，過硅膠柱，氯仿-甲醇梯度洗脫，除色素后經(jīng)過制備型高效液相（HPLC）反復(fù)純化為淡黃色粉末，溶劑法純化工藝提取，收率4.0％，由暨南大學(xué)天然藥物化學(xué)研究所提供。高脂飼料：豬油10％，蔗糖15％，蛋黃5％，基礎(chǔ)飼料70％，由廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供；STZ（98％，批號8110047）、羅格列酮（批號13245247）均購于美國Sigma公司；游離脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TCH）試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒購自溫州東甌津瑪生物科技有限公司；多聚甲醛（批號20120522）購自天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；Trizol（批號15596-026）購自美國加州Invitrogen Life Technologies公司；DNA引物由美國Invitrogen Biotechnology中國公司合成；逆轉(zhuǎn)錄酶RT-PCR試劑盒（批號K1622）購自美國Thermo公司；熒光定量qPCR試劑盒（批號04913914001）購自美國Roche公司；β-Actin antibody、Anti-IKKα antibody、NF-κB-p65 antibody、Anti-AKT（phospho S473）antibody均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器 One touch穩(wěn)豪型血糖儀配套試紙（批號PWE005007P，美國強生公司）；Model 680酶標儀（美國BIO-RAD公司）；低溫離心機購自美國Sigma公司；LAC-110.4型電子分析天平購自賽多利斯公司；BL-410生物機能換能系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司研制）；光學(xué)顯微鏡（奧林巴斯BX51，日本）；WO-9413B型凝膠成像系統(tǒng)，購自北京六一儀器廠；POWER BC數(shù)控電泳儀，購自上海申能博彩生物科技有限公司。

2 方法

2.1 動物建模及分組 雄性SD大鼠90只，分為正常組動物12只和糖尿病建模動物78只，正常組動物給予基礎(chǔ)飼料，建模動物給予高脂飼料。喂養(yǎng)4周后，禁食12 h，腹腔注射2％STZ溶液45 mg/kg，1周后測大鼠2 h糖耐量（禁食12 h，灌胃2 g/kg的葡萄糖，測2 h的血糖），篩選血糖值大于11.1 mmol/L的大鼠確定為糖尿病大鼠。模型穩(wěn)定1周后，將成模的糖尿病大鼠60只按照血糖分層隨機分為5組，即番石榴葉總?cè)频停?0 mg/kg）、中（60 mg/kg）、高（120 mg/kg）劑量組，羅格列酮組（3 mg/kg），模型組，每組各12只。

2.2 給藥方式 給藥組每天灌胃給予不同劑量的番石榴葉總?cè)苹蛄_格列酮，模型組和正常組則灌胃給予同體積的生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥8周。每周末稱量大鼠體質(zhì)量，各組飼料給予同“2.1”項。

2.3 觀測指標及方法

2.3.1 血糖血脂測定 給藥8周結(jié)束后取大鼠血清，按試劑盒說明書進行操作，采用葡萄糖氧化酶法測定空腹血糖值（FBG），GPO-PAP法測定TG，酶聯(lián)免疫吸附法測定NEFA、TCH。

2.3.2 坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度的測定 采用BL-410生物機能換能系統(tǒng)測定。運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度（MCV）測定是在坐骨神經(jīng)干兩個不同端點刺激神經(jīng)，在其支配肌肉記錄運動反應(yīng)，測定兩個刺激點引出的運動反應(yīng)潛伏期差與通過該兩點間的距離之比即為MCV。

2.3.3 炎癥介質(zhì)基因表達測定 取各組大鼠的右腿坐骨神經(jīng)，研磨組織樣品成膠凍狀后，用Trizol提取組織的RNA，溶于無核糖核酸酶（RNase）水中。然后開始在RT-PCR儀上進行目的基因（Tnfa，Il6和iNOS）的定量分析。RT-PCR儀進行逆轉(zhuǎn)錄構(gòu)建cDNA模板，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件參照試劑盒說明。Tnfa正向引物為5'-TCAAGGGACAA-3'，反向引物為5'-GGTATGAAATGGCAAATCGGCT-3'，PCR產(chǎn)物為80 bp；Il6正向引物為5'-CCAGGTTCTCTTTGCCTTCTTGGGACTGATGT-3'，反向引物為5'-TACTGGTCTGTTGTGGGTGGT-3'，PCR產(chǎn)物為101 bp；iNOS正向引物為5'-TCAGCACAGAGGGCTCAAAG-3'，反向引物為5'-ACATCGCCACAAACATAAAGGT-3'，PCR產(chǎn)物為255 bp；β-actin正向引物為5'-TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG-3'，反向引物為5'-GTTGGCATAG AGGTCTTTACGG-3'，PCR產(chǎn)物為240 bp。實時熒光定量PCR儀擴增條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，40個循環(huán)。每只動物檢測一式3份，以β-actin為管家基因，采用2-ΔΔCt法計算基因表達的相對變化，其中ΔΔCt=（Ct未知樣品-Ct未知樣品內(nèi)參）-（Ct基準樣品-Ct基準樣品內(nèi)參）。

2.3.4 坐骨神經(jīng)HE染色 收集處死后大鼠左腿的坐骨神經(jīng)，利用多聚甲醛固定并保持神經(jīng)條平直，經(jīng)常規(guī)脫水、包埋，按實驗室標準將組織切成厚度為4～5 μm，組織切片再經(jīng)脫蠟、蘇木素-伊紅染色、脫水、透明、封固，即得HE染色切片。最后用光學(xué)顯微鏡檢測各組織切片中組織形態(tài)學(xué)的變化。每個標本隨機分析15個視角。

2.3.5 Western blot檢測 利用研磨器研磨組織后，取樣加入1％Triton X-100、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）、2.5 mmol/L焦磷酸鈉、1 mmol/L β-甘油磷酸酯、1 mmol/L Na3VO4、1 μg/mL亮肽素、1 μg/mL抑肽酶和20 mmol/L Tris（pH 7.5），得蛋白裂解液，用Lowry法測定蛋白質(zhì)含有量。以牛血清白蛋白（BSA）為標準品，將蛋白濃度調(diào)為一致，用10％ 的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，每個泳道蛋白上樣量為40 μg［SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜，TBS沖洗、封閉，TBST沖洗，將膜放入Ⅰ抗中4℃過夜，TBST沖洗，加辣根過氧化物酶（HRP）（1∶1 000）標記的抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗孵育1 h，前后分別TBST洗3次，ECL發(fā)光液A 和B 1∶1混合后泡膜，暗室中感光］。Quantity One軟件分析條帶，得出光密度（D）值。

2.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以p<0.05為差異有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 TTPGL對糖尿病大鼠體質(zhì)量及生化指標的影響 給藥前，各建模組體質(zhì)量與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05），而空腹血糖明顯升高（p<0.01）。正常組體質(zhì)量為（490.62± 10.98）g，且空腹血糖穩(wěn)定在正常水平，低于7.0 mmol/L（表中FBG值由血糖儀測得值乘以18而得）；模型組大鼠體質(zhì)量和正常組比較顯著降低，且血糖顯著高于正常組（p<0.01），并一直維持在高于15.0 mmol/L的高血糖狀態(tài)。與模型組比較，番石榴葉總?cè)平o藥組以及羅格列酮組大鼠的NEFA、TG及TCH顯著降低（p<0.05）。詳見表1。

表1　TTPGL對糖尿病大鼠體質(zhì)量及生化指標的影響（±s，n=12）Tab.1 Effects of TTPGL on body weight and biochem ical indices in diabetic rats（±s，n=12）

表1　TTPGL對糖尿病大鼠體質(zhì)量及生化指標的影響（±s，n=12）Tab.1 Effects of TTPGL on body weight and biochem ical indices in diabetic rats（±s，n=12）

注：與正常組比較，##p<0.01；與模型組比較，*p<0.05

組別　　劑量/ （mg·kg-1）給藥前（建模后1周）（n =15）　給藥8周后（n =10）體質(zhì)量/g　 FBG/（mg·dL-1）　體質(zhì)量/g　 FBG/（mg·dL-1）NEFA/ （μmol·L-1）TG/ （mmol·L-1）TCH/ （mmol·L-1）正常組　　—　325.35±10.98　 82.16±18.17　 490.62±10.98　 108.95±18.98　 183.16±18.17　 0.74±0.08　 1.86±0.13模型組　　—　322.25±14.36　 396.72±28.64##323.00±16.86##399.03±21.18##454.31±44.26##　5.00±0.48##　6.32±0.61##TTPGL低劑量組　30　 320.83±11.67　 379.98±28.34##390.11±28.86　 369.74±11.67　 283.01±15.71　 3.94±0.41　 4.70±0.53 TTPGL中劑量組　60　 327.05±22.41　 390.96±27.46##314.10±16.85　 286.28±19.21*237.73±13.29*　2.54±0.18*　3.58±0.17*TTPGL高劑量組　120　 329.53±20.25　 390.60±27.69##455.71±16.37*287.02±14.72*229.88±12.69*　2.69±0.34*　3.02±0.32*羅格列酮組　3　 319.58±26.07　 374.58±25.44##451.00±17.13*260.81±26.39*198.36±18.43*　2.43±0.37*　2.60±0.47*

3.2 TTPGL對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)MCV的影響

本次實驗，分別在第4周和第8周對各組大鼠的坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度進行了測定。如表2，與正常組比較，經(jīng)過STZ誘導(dǎo)的持續(xù)性高血糖影響，模型組大鼠坐骨神經(jīng)在第8周的傳導(dǎo)速度減慢明顯（p<0.01）；和模型組傳導(dǎo)速度相比，TTPGL （120 mg/kg）、羅格列酮組在第8周速度測定值中出現(xiàn)顯著性改善作用（p<0.05）。

表2　坐骨神經(jīng)MCV值（±s，n=12）Tab.2 Sciatic nerve's MCV values（±s，n=12）

表2　坐骨神經(jīng)MCV值（±s，n=12）Tab.2 Sciatic nerve's MCV values（±s，n=12）

注：與正常組比較，##p<0.01；與模型組比較，*p<0.05

組別　　劑量/ （mg·kg-1）運動神經(jīng)傳導(dǎo)速度/（m·s-1）第4周　　第8周正常組　　—61.18±1.01　 60.87±0.74模型組　　—　58.82±1.24　 52.07±1.19##TTPGL低劑量組　30　 58.13±1.25　 56.33±1.28 TTPGL中劑量組　60　 60.51±1.45　 54.88±0.74 TTPGL高劑量組　120　 59.81±2.27　 57.63±1.18*羅格列酮組　3　 61.78±1.65　 57.56±1.10*

3.3 TTPGL對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)炎癥基因表達的影響 如圖1，A、B和C分別是Tnfa，Il6和iNOS基因表達的柱狀圖。和正常組比較，模型組在各炎癥介質(zhì)基因的表達上均有顯著性的增加（p<0.05）。和模型組比較，TTPGL組和羅格列酮組在各炎癥介質(zhì)基因的表達上，有不同程度的改善作用（p<0.05）。

注：與正常組比較，#p<0.05；與模型組比較，*p<0.05圖1　Tnfa，Il6和iNOS基因表達（±s，n=12）Fig.1 Gene expressions of Tnfa，Il6 and iNOS（±s，n=12）

3.4 TTPGL對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)的影響 正常組大鼠坐骨神經(jīng)排列有序，髓鞘清晰，組織間致密無水腫且無游離細胞產(chǎn)生。模型組大鼠坐骨神經(jīng)結(jié)構(gòu)排列紊亂，髓鞘脫落，組織間水腫并游離細胞較多。和模型組相比，TTPGL對神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的影響，隨劑量增加，神經(jīng)結(jié)構(gòu)排列、組織細胞間的致密度得到不同程度的改善。詳見圖2。

注：粗箭頭表示髓鞘退化，箭頭表示水腫，細箭頭表示游離細胞圖2　TTPGL對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)組織形態(tài)學(xué)改變的影響（HE，×400，n=6），F(xiàn)ig.2 Effect of TTPGL on histological alteration in sciatic nerve in diabetic rats（HE，×400，n=6）

3.5 TTPGL對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)NF-κB介導(dǎo)的信號通路蛋白的影響 圖3為各蛋白表達條帶，圖4為定量分析各蛋白磷酸化與非磷酸化的比值圖。與正常組比較，模型組大鼠p-AKT/AKT，p-IKKα/ IKKα，p-p65/p65值顯著性增加（p<0.01），即NF-κB介導(dǎo)的信號通路蛋白磷酸化活性增強。給藥后，番石榴葉總?cè)坪土_格列酮可顯著降低各蛋白磷酸化活性在糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)組織中的表達，與模型組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05或p<0.01）。

圖3　信號通路蛋白表達Fig.3 Protein expressions of signal pathways

注：與正常組比較，##p<0.01；與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01圖4　p-AKT/AKT，p-IKKα/IKKα，p-p65/p65定量分析（±s，n=6）Fig.4 Quantitative analyses of p-AKT/AKT，p-IKKα/IKKαand p-p65/p65（±s，n=6）

4 討論

本課題組在前期研究中首次發(fā)現(xiàn)番石榴葉總?cè)剖欠袢~降血糖的有效部位，其富含特征性的高度氧化的五環(huán)三萜酸類化合物如：積雪草酸、烏蘇酸、番石榴酸以及齊墩果酸等［7-9］。糖尿病周圍神經(jīng)病變確定機制較為復(fù)雜，2005年美國神經(jīng)學(xué)研究會、電診斷醫(yī)學(xué)協(xié)會以及物理康復(fù)醫(yī)學(xué)協(xié)會將臨床上DPN的診斷主要包含有：神經(jīng)性癥狀、體征以及異常性電診斷［10］。本實驗?zāi)Ｐ徒M體質(zhì)量下降明顯，持續(xù)性的高血糖（表1）以及傳導(dǎo)速度的異常（表2）等，從而確定模型組動物被STZ誘導(dǎo)8周之后，產(chǎn)生了神經(jīng)性病變。

持續(xù)性的高血糖將會導(dǎo)致核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)作用［11］。炎性因子TNF-α，介質(zhì)IL-6以及炎性酶iNOS都能被NF-κB調(diào)控且相互間引起神經(jīng)炎癥的惡性循環(huán)［12］，其中iNOS調(diào)控的NO是產(chǎn)生神經(jīng)髓鞘退化的直接原因。而以上由NF-κB介導(dǎo)的炎癥因子在雪旺細胞或者神經(jīng)元中可表現(xiàn)出對巨噬細胞的募集作用，并能最終導(dǎo)致神經(jīng)再生性損傷［13］。因此，將高血糖誘發(fā)的神經(jīng)炎癥機制歸結(jié)于對NF-κB介導(dǎo)的信號通路探究。本實驗結(jié)果中的模型組，提示炎性因子表達對神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)的損傷性變化；給藥后，各組炎癥因子對神經(jīng)的損傷情況隨著給藥劑量增加而得到緩解。證實了之前文獻報道中番石榴葉提取物所具有的抗炎功效［14］。

TNF作為在T1DM和T2DM兩型糖尿病中作用最普遍的炎性因子［15-16］，在本次試驗中，我們將其引起的PI3K酪氨酸磷酸化，激活PI3K/Akt介導(dǎo)的路徑［17-18］作為探究對象。在活性體內(nèi)，Akt是一種60 kD的絲/蘇氨酸蛋白激酶，為PI3K重要的下游組成部分，IKKα（Thr23）磷酸化的募集激活NF-κB RelA（p65）［19］，并最終導(dǎo)致炎性介質(zhì)產(chǎn)生、神經(jīng)組織損傷的惡性循環(huán)。實驗結(jié)果可知，番石榴葉總?cè)仆ㄟ^下調(diào)p-AKT/AKT、p-IKKα/ IKKα、p-p65/p65值，減少了由NF-κB-p-p65介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，并進一步緩解神經(jīng)組織損傷，達到改善周圍神經(jīng)病變的效果。

綜上所述，本實驗探究番石榴葉提取物TTPGL對DPN的作用及其機制，其結(jié)果顯示，TTPGL改善坐骨神經(jīng)的傳導(dǎo)速度、減少坐骨神經(jīng)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和神經(jīng)結(jié)構(gòu)的損傷，并可能通過抑制NF-κB產(chǎn)生的信號通路蛋白磷酸化活性而達到減少炎癥產(chǎn)生的效果。

參考文獻：

［1］ 侯瑞芳，湯正義，寧 光.糖尿病周圍神經(jīng)病變的檢查方法及其診斷效率［J］.國際內(nèi)分泌代謝雜志，2006，26（4）：270-272.

［2］ Edwards JL，Vincent A M，Cheng H T，et al.Diabetic neuropathy：mechanisms to management［J］.pharmacol Ther，2008，120（1）：1-34.

［3］ Cameron N E，Cotter M A.Pro-inflammatorymechanisms in diabetic neuropathy：focus on the nuclear factor kappa B pathway ［J］.Curr Drug Targets，2008，9（1）：60-67.

［4］ 王婧茹，趙晶晶，葉春玲，等.番石榴葉總?cè)茖?型糖尿病大鼠的降血糖和血脂作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28（6）：1109-1113.

［5］ 匡喬婷，趙晶晶，葉春玲，等.番石榴葉總?cè)茖?型糖尿病大鼠腎損傷的保護作用［J］.中藥材，2012，35（1）：74-97.

［6］ Kawakami Y，Nakamura T，Hosokawa T，et al.Antiproliferative activity of guava leaf extract via inhibition of prostaglandin endoperoxide H synthase isoforms［J］.p rostaglandins LeuKot Essent Fatty Acids，2009，80（5-6）：239-245.

［7］ Shao M，Wang Y，Huang X J，et al.Four new triterpenoids from the leaves of psidium guajava［J］.JAsian Nat p rod Res，2012，14（4）：348-354.

［8］ Begum S，Hassan S I，Siddiqui B S，et al.Triterpenoids from the leaves of psidium guajava［J］.phytochemistry，2002，61 （4）：399-403.

［9］ 郭翔宇，劉銅華，朱寅荻，等.番石榴葉化學(xué)成分及其治療2型糖尿病研究進展［J］.世界科學(xué)技術(shù)：中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014，16（5）：619-628.

［10］ Albers JW，Pop-Busui R.Diabetic neuropathy：mechanisms，emerging treatments，and subtypes［J］.Curr Neurol Neurosci ReP，2014，14（8）：473.

［11］ Brownlee M.Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complication［J］.Nature，2001，414（6865）：813-820.

［12］ Kim YW，Zhao R J，Park S J，etal.Anti-inflammatory effects of liquiritigenin as a consequence of the inhibition of NF-kappa B-dependent iNOS and proinflammatory cytokines production ［J］.Br J pharmacol，2008，154（1）：165-173.

［13］ Conti G，Scarpini E，Baron P，et al.Macrophage infiltration and death in the nerve during the early phases of experimental diabetic neuropathy：a process concomitantwith endoneurial induction of IL-beta and p75NTR［J］.J Neurol Sci，2002，195 （1）：35-40.

［14］ Gutierrez R M P，Mitchell S，Solis R V.psidium guajava：a review of its traditional uses，phytochemistry and pharmacology ［J］.JEthnoPharmacol，2008，117（1）：1-27.

［15］ Gomes M B，Piccirillo L J，Nogueira V G，et al.Acute-phase proteins among patients with type 1 diabetes［J］.Diabetes Metab，2003，29（4）：405-411.

［16］ Gonzalez-Clemente JM，Mauricio D，Richart C，etal.Diabetic neuropathy is associated with activation of the TNF-alpha system in subjects with type 1 diabetes mellitus［J］.Clin Endocrinol （Oxf），2005，63（5）：525-529.

［17］ Romashkova JA，Makarov S S.NF-kappaB is a target of AKT in anti-apoptotic PDGF signalling［J］.Nature，1999，401 （6748）：86-90.

［18］ Kane L P，Shapiro V S，Stokoe D，et al.Induction of NF-kappaB by the Akt/PKB kinase［J］.Curr Biol，1999，9（11）：601-604.

［19］ Ozes O N，Mayo L D，Gustin JA，etal.NF-kappaB activation by tumour necrosis factor requires the Akt serine-threonine kinase［J］.Nature，1999，401（6748）：82-85.

Ameliorative effect of total triterpenoids from psidium guajava leaves on diabetic peripheral neuropathy

YE Kai-he1， WANG Xiao-kang1， LüYan-qing1， WEISong-cheng1， LIXiu-cun1， ZHANG Xiaoqi2， YE Chun-ling1*
（1.DePartment of pharmacology，pharmacy College of Jinan University，Guangzhou 510632，China；2.Institute of Traditional ChineseMedicine and Natural Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

ABSTRACT：AIM To investigate the ameliorative effect of total triterpenoids from psidium guajava leaves （TTPGL）on diabetic peripheral neuropathy（DPN）in rats and to explore the underlying mechanism. M ETHODS Rats models for diabetic were induced by high-fat feeding and STZ injection.These rats were randomized into six groups，TTPGL-30，60 and 120 groups［30，60 and 120 mg/（kg·d）］，control group，model group and positive control rosiglitazone group［3 mg/（kg·d）］.Nerve conduction velocity（MCV）and histopathological staining were performed on sciatic nerves.mRNA expressions of pro-inflammatory molecules （Tnfa，Il6 and iNOS）and tissue proteins（AKT，IKKαand p65）were also estimated by RT-PCR and Western blot，respectively.RESULTS Compared with themodel group，TTPGL（120 mg/kg）group significantly ameliorated DPN nerve deficits（p<0.05）.It significantly inhibited Tnfa，Il6 and iNOS mRNA expressions （p<0.05），and significantly down-regulated p-AKT/AKT，p-IKKα/IKKαand p-p65/p65（p<0.01 or p< 0.05）.CONCLUSION TTPGL can markedly improve DPN symptom，whosemechanism may be related to the down-regulation of NF-κB-mediated signal pathway，and then decrease the expressions of inflammatorymediators.

*通信作者：葉春玲（1963—），女，博士，教授，從事神經(jīng)內(nèi)分泌方向研究。Tel：（020）85223843，E-mail：yechunling2005@163.com

作者簡介：葉開和（1970—），男，碩士，講師，研究方向為內(nèi)分泌藥理學(xué)。Tel：（020）85220261，E-mail：rightye33@163.com

基金項目：廣東省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新重點項目（cxzd1111）；國家自然科學(xué)基金（81373935）；廣東省重大科技專項（2013A022100028）

收稿日期：2015-10-29

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.05.001

中圖分類號：R285.5

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1528（2016）05-0961-06