范振海,章 濤,余麗梅,魏在榮,彭笳宸,任明強,方 寧

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.貴州省細胞工程重點實驗室；2.燒傷整形外科；3.骨科；4.血液科；貴州 遵義 563099)

技術(shù)與方法

COM.TEC型血細胞分離機采集外周血單個核細胞效果分析

范振海1,章 濤1,余麗梅1,魏在榮2,彭笳宸3,任明強4,方 寧1

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，1.貴州省細胞工程重點實驗室；2.燒傷整形外科；3.骨科；4.血液科；貴州 遵義 563099)

目的 觀察費森尤斯COM.TEC型血細胞分離機autoMNC程序采集患者外周血單個核細胞的效果。方法 粒細胞集落刺激因子動員后，采用COM.TEC型血細胞分離機autoMNC程序采集患者外周血單個核細胞，流式細胞儀檢測CD34+細胞和單個核細胞百分比，血常規(guī)檢測白細胞計數(shù)。對外周血單個核細胞采集效率與單個核細胞采集參數(shù)及采集物質(zhì)量指標進行相關(guān)性分析。結(jié)果 28例患者平均處理血量2.34±1.75 L，采集物體積46.63±28.17 mL，白細胞計數(shù)(11.40±10.40)×1010個細胞/L，單個核細胞百分比(83.79%±21.77) %，CD34+細胞百分比(0.81±1.54) %。MNCs采集效率與外周血處理血量呈正相關(guān)(rs=0.538,P<0.05)，和采集前外周血MNCs計數(shù)呈負相關(guān)(rs=-0.379.P<0.05);MNCs采集效率與采集物白細胞和單個核細胞總數(shù)呈正相關(guān)(rs=0.866，rs=0.924，P<0.05)，與采集前外周血白細胞計數(shù)、采集物CD34+細胞和單個核細胞百分比之間無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論 外周血單個核細胞采集效率作為評價COM.TEC型血細胞分離機autoMNC程序采集效果的指標，可綜合反應(yīng)重要的采集參數(shù)與采集物質(zhì)量。

血細胞分離機；外周血；單個核細胞；CD34+細胞

經(jīng)粒細胞集落刺激因子動員，可顯著提高外周血中造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSCs)和間充質(zhì)干細胞的含量，通過血細胞分離機采集外周血單個核細胞(mononuclear cells，MNCs)可初步富集外周血干細胞，用于惡性血液病大劑量化療后，促進患者造血免疫功能恢復(fù)，或?qū)⒏患耐庵苎杉毎糜谔悄虿∽愕燃膊≈委焄1-2]，促進組織損傷修復(fù)，取得了明顯療效。與骨髓干細胞采集相比，血細胞分離機富集外周血干細胞具有自動化集成度高、無需麻醉、安全、無痛苦及自體粒細胞和血小板恢復(fù)快等優(yōu)勢。

外周血MNCs采集過程中，盡管所用廠家與機型不同，細胞自動化采集水平不相上下，但能否合理使用與科學(xué)設(shè)置采集參數(shù)，最終對采集物質(zhì)量會造成明顯影響，一定程度上決定著自體外周血干細胞移植治療效果[3-5]。COM.TEC是德國Fresenius Kabi公司推出的血細胞分離機，國內(nèi)外都是一款外周血MNCs采集、分離和HSCs富集的主流機型。本文重點分析了COM.TEC型血細胞分離機autoMNC程序的外周血MNCs的采集效率(collection efficiency,CE)與白細胞(white blood cell，WBC)計數(shù)、MNCs計數(shù)等主要采集參數(shù)和采集物質(zhì)量指標之間的相關(guān)性，為采集實施過程中合理設(shè)置參數(shù)，科學(xué)評價外周血MNCs采集物質(zhì)量提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2008年12月至2011年04月在我院進行外周血MNCs采集的患者28例，年齡21～72歲，平均41歲，男性19例，女性9例，急性髓系白血病2例，急性淋巴細胞白血病1例，血栓閉塞性脈管炎5例，糖尿病足1例，股骨頭壞死5例，骨折不愈合14例。采集前患者皮下注射粒細胞集落刺激因子5 μg/kg/d，動員期間監(jiān)測外周血WBC計數(shù)，動員3 d WBC計數(shù)>20×109個細胞/L后，行外周血MNCs采集。

1.2 儀器 德國Fresenius Kabi公司生產(chǎn)的COM.TEC型血細胞分離機，F(xiàn)ACS Calibur流式細胞儀和ProCOUNTCD34+細胞計數(shù)試劑盒均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.3 方法 采集前行血常規(guī)檢測，采用autoMNC程序，依據(jù)患者身高、體重、紅細胞壓積、WBC、血小板計數(shù)、外周血MNCs計數(shù)等設(shè)置參數(shù)，程序?qū)⒏鶕?jù)輸入資料自動預(yù)測CD34+細胞采集數(shù)，也可根據(jù)患者自身情況稍作調(diào)整，處理血量1.24～8.96 L，平均2.34 L，抗凝劑枸櫞酸葡萄糖與全血的比例設(shè)置1∶9～1∶11。

1.4 采集物處理 采集物終體積因不同疾病治療需要設(shè)置在26～123 mL，平均體積為46 mL，并將采集物行血常規(guī)檢查，CD34+細胞百分比及MNCs百分比分別采用絕對計數(shù)微球與CD45+CD34+細胞計數(shù)、CD45+細胞標記，經(jīng)FACS Calibur流式細胞儀檢測、分析獲得。

1.5 MNCs采集效率計算[6-7]MNCs-CE的計算公式：MNCs的CE=(采集物MNCs總數(shù)×100)÷(采集前外周血MNCs計數(shù)×總循環(huán)血量)，采集前外周血MNCs計數(shù)=采前外周血WBC計數(shù)×采前外周血MNCs百分比；采集前外周血MNCs百分比=外周血淋巴細胞百分比+外周血單核細胞百分比，采集物MNCs總數(shù)=采集物WBC計數(shù)×采集物MNCs百分比×采集物體積，采集物中CD34+細胞總數(shù)=采集物WBC計數(shù)×采集物CD34+細胞百分率×采集物體積。

2 結(jié)果

2.1 采集參數(shù)和外周血MNCs的CE MNCs的CE是評價外周血HSCs采集質(zhì)量的重要指標，由MNCs的CE計算公式可知，采集物中MNCs總數(shù)越高，MNCs的CE越高，而采集前外周血MNCs計數(shù)和總循環(huán)血量越高，則MNCs的CE越低。 根據(jù)COM.TEC血細胞分離機采集參數(shù)(見表1)與采集物中重要細胞數(shù)量和比例檢測(見表2)，按照上述公式計算，采集物MNCs總數(shù)為(4.62±7.78)×109個細胞，MNCs的CE為(44.13±80.61)%。

2.2 采集物MNCs和CD34+細胞總數(shù) 采集物中CD45+細胞為MNCs的標志，CD45+細胞中CD34+細胞則是公認的HSCs表面標志，CD34+細胞含量的高低與CD34+細胞總數(shù)決定著采集物質(zhì)量的好壞和自體外周血干細胞移植的療效。根據(jù)公式計算，采集物CD34+細胞總數(shù)(5.26±11.8)×107個細胞。其中惡性血液病患者采集物中MNCs總數(shù)為(2.08±1.77)×1010個細胞，CD34+細胞總數(shù)(3.73±1.00)×108個細胞，每例患者所采CD34+細胞總數(shù)均大于2×106個細胞/kg，顯著高于HSCs移植的基本質(zhì)量要求。

供者血容量(L)處理血量(L)采集前外周血WBC計數(shù)(1010個細胞/L)紅細胞壓積(%)MNCs計數(shù)(×109個細胞/L)MNCs百分比(%)398±060234±175264±0963768±594367±2221375±005

指標采集物體積(mL)4663±2817WBC計數(shù)(1010個細胞/L)1140±1040紅細胞(1012個細胞/L)087±052MNCs(%)8379±2177CD34+細胞(%)083±154

2.3 外周血MNCs的CE與采集參數(shù)的相關(guān)性分析 MNCs的CE和采集前外周血MNCs計數(shù)呈非線性負相關(guān)，Spearmen’s相關(guān)系數(shù)(rs)=-0.379(P<0.05)，而與外周血處理血量呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)rs=0.538(P<0.05，見圖1)。但與采集前外周血WBC計數(shù)和MNCs百分比無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

圖1 外周血MNCs的CE與采集物關(guān)鍵指標的相關(guān)性分析。

2.4 外周血MNCs的CE與采集物質(zhì)量指標的相關(guān)性分析 外周血MNCs的CE與采集物WBC和MNCs總數(shù)呈正相關(guān)，rs分別為0.866和0.924(P<0.05)，而與采集物中CD34+細胞總數(shù)、CD34+細胞百分比和MNCs百分比無明顯相關(guān)性(P>0.05，見圖2)。

圖2 外周血MNCs的CE與采集物質(zhì)量指標的相關(guān)性分析

2.5 外周血MNCs采集中的不良反應(yīng) 28例患者采集過程中有9人出現(xiàn)輕度口唇或手足麻木的低血鈣癥狀，該不良反應(yīng)發(fā)生率為32.14%，給予口服或緩慢靜脈推注10%葡萄糖酸鈣對癥處理后癥狀消失，未見其它明顯不良反應(yīng)。

3 討論

自體外周血干細胞移植已逐漸成為常用的臨床治療技術(shù)[8]，但外周血干細胞含量很少，約占MNCs的0.01%～0.1%，相當(dāng)于骨髓干細胞含量的1%～10%，因此能否采集、富集到足夠的外周血干細胞是移植治療成功的前提和關(guān)鍵[9]。

除安全、有效的干細胞動員劑使用外，血細胞分離機的合理使用對干細胞的采集能力是保障短時間高效率獲取HSCs的重要因素之一。盡管目前臨床上常以計算CD34+HSCs采集量占流經(jīng)血細胞分離機的CD34+細胞總數(shù)的比例來進行HSCs采集效果的評價，CD34+細胞總數(shù)則由采集前CD34+細胞的比例與總循環(huán)血量的乘積表示[6,10-11]。采集的外周血MNCs中，富集了CD34+的HSCs，因此采集物中MNCs總數(shù)很大程度上影響了CD34+細胞總數(shù)，而采集物中的WBC計數(shù)則是決定采集物中MNCs總數(shù)的關(guān)鍵因素。

盡管因所用血細胞分離機廠家、型號存在差異，外周血MNCs或HSCs采集性能也不盡相同[12-15]，但CE仍是常用的外周血細胞采集效果的重要評價指標。與文獻報道的其他型號血細胞分離機相比[16-17]，本研究所選COM.TEC血細胞分離機autoMNC程序采集外周血MNCs的采集參數(shù)及采集物質(zhì)量指標的結(jié)果來看，在采集前外周血的一定WBC計數(shù)和MNCs計數(shù)范圍內(nèi)，采集所需處理血量較少，采集物體積也較小，而采集物中WBC計數(shù)、MNCs百分比、CD34+細胞百分比及CD34+細胞總數(shù)均較高，不但可以滿足研究所涉及病種對自體干細胞移植所需的要求，且外周血MNCs的CE也較高。

進一步分析外周血MNCs的CE與采集參數(shù)及采集物質(zhì)量指標的相關(guān)性，結(jié)果顯示，外周血MNCs的CE與采集前外周血MNCs計數(shù)呈負相關(guān)，與文獻報道一致[4,18]，即血細胞分離機梯度離心過程中，外周血MNCs所形成的白膜層是主要采集目標，當(dāng)外周血MNCs過高時，白膜層過厚，可導(dǎo)致采集不完全，而降低CE，這可能是在影響外周血MNCs的CE因素中，COM.TEC血細胞分離機與Cobe Spectra、Fenwal CS 3000 Plus血細胞分離機明顯的不同[2]。但外周血MNCs的CE與處理血量成正相關(guān)，因此采集時，應(yīng)根據(jù)外周血MNCs計數(shù)，即采集前外周血WBC計數(shù)、外周血淋巴細胞百分比和單核細胞百分比，適當(dāng)調(diào)整每循環(huán)周期白膜采集體積的大小，從而提高CE。此外，本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)外周血MNCs的CE與采集物WBC計數(shù)和MNCs總數(shù)呈正相關(guān)，而與采集物的CD34+細胞總數(shù)、CD34+細胞百分比和MNCs百分比無明顯相關(guān)性，表明采集物WBC計數(shù)、MNCs總數(shù)是評價采集物質(zhì)量和采集CE的重要指標，而不能只是簡單地以采集物中MNCs和CD34+細胞百分比來進行判斷。反之，根據(jù)臨床疾病治療對CD34+HSCs數(shù)量的需要，也可根據(jù)采集前外周血WBC計數(shù)、MNCs計數(shù)及淋巴細胞和單核細胞百分比推算需處理血量及每循環(huán)中白膜采集體積。由此可見，外周血MNCs的CE作為COM.TEC血細胞分離機autoMNC程序采集MNCs的評價指標，不但受采集前多個采集參數(shù)的影響，即可通過提高處理血量和采集前有效的升高患者外周血WBC數(shù)，及調(diào)整適宜的白膜采集體積來提高CE，也能很好地提高采集物質(zhì)量。外周血MNCs的CE與采集物MNCs總數(shù)的正相關(guān)，也提示CE的上述影響因素及有關(guān)采集參數(shù)的調(diào)整，可能對免疫細胞治療中的外周血MNCs采集也具有重要指導(dǎo)意義。

此外，需引起注意的是外周血MNCs采集中抗凝劑枸櫞酸鹽與血液中鈣離子螯合，可引起口唇或手足麻木等低血鈣癥狀[19]，這一較高的不良反應(yīng)發(fā)生率仍需采取積極措施，在不影響外周血MNC的CE基礎(chǔ)上，適當(dāng)減低抗凝劑枸櫞酸葡萄糖的用量和比例，不失為一種可以考慮的防治策略。

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收稿2016-09-10;修回2016-11-12〗

(編輯：譚秀榮)

Efficiency of collecting peripheral blood mononuclear cells by COM.TEC blood cell separator

FanZhenhai1,ZhangTao1,YuLimei1,WeiZairong2,PengJiachen3,RenMingqiang4,FangNing1

(1.Key Laboratory of Cell Engineering in Guizhou Province; 2.Department of Burn and Plastic Surgery; 3.Department of Orthopaedics; 4.Hematology department;Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the efficiency of Fresenius COM.TEC blood cell separator autoMNC program on collection of peripheral blood mononuclear cells (MNCs).Methods After mobilization with granulocyte colony-stimulating factor,the peripheral blood MNCs were collected by autoMNC program of Fresenius COM.TEC blood cell separator.The percentage of MNCs and CD34+cells were detected by flow cytometry.The white blood cells (WBC) were counted by blood routine.The correlation analysis were performed between collection efficiency (CE) of MNCs and the count of MNCs and WBC in peripheral blood,total WBC,the percentage of MNCs and CD34+cells in collection.Results The processed mean blood volumes were 2.34 ± 1.75 L in 28 patients.Collection volume was 46.63 ± 28.17 ml.The count of WBC was (11.40±10.40) ×1010cells/L in collection.The percentage of MNCs and CD34+cell were (83.79±21.77)% and (0.81±1.54)% in collection,respectively.There was a positive correlation between the CE of MNCs and prcessed blood volume (rs=0.538,P<0.05).ButanegativecorrelationbetweentheCEofMNCsandthecountofMNCsinperipheralbloodbeforecollection(rs=-0.379,P<0.05).A positive correlation between the CE of MNCs and the count of WBC and MNCs in collection (rswas 0.866 and 0.924,P<0.05).TherewerenocorrelationsbetweentheCEofMNCsandcountofWBCinperipheralbloodbeforecollection,percentageofCD34+cellsandMNCsincollection(P>0.05).Conclusion Collection efficacy of peripheral blood MNCs using COM.TE blood cell separator autoMNC program could reflect the important collection parameters and the quality of the collection.

blood cell separator; peripheral blood; mononuclear cell; CD34+cell

貴州省省長資金臨床應(yīng)用課題專項(NO：黔省專合字[2012]107)；貴州省科技廳資助項目(NO：黔科合J字[2010]2182)。

余麗梅，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥理學(xué)，E-mail:ylm720@sina.com。

R457.2

A

1000-2715(2016)06-0627-04