陳全利，胡 莉，魏 瑋，李三華

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

杜仲總黃酮對(duì)大鼠神經(jīng)源性肌萎縮的影響

陳全利1，胡 莉2，魏 瑋1，李三華3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 針灸科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 病理科，貴州 遵義 563099；3.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心，貴州 遵義 563099)

目的 觀察杜仲總黃酮對(duì)大鼠神經(jīng)源性肌萎縮的治療效果。方法 以30只1月齡雌性SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)選取24只大鼠夾傷右后肢坐骨神經(jīng)制作神經(jīng)源性肌萎縮模型，并分為4組：模型組、杜仲總黃酮低、中、高劑量組；不做坐骨神經(jīng)夾傷處理的剩余6只大鼠作為對(duì)照組。在自由飲食狀態(tài)下，模型組和對(duì)照組不予以灌胃處理，杜仲總黃酮低、中、高劑量組采用灌胃方式分別喂飼TFE 50、100、200 mg/kg/d，共4周。實(shí)驗(yàn)處理結(jié)束后，各組大鼠麻醉處死取右后肢腓腸肌稱重并制作HE染色切片測(cè)量肌細(xì)胞橫截面積，Western blot方法檢測(cè)肌肉組織中肌肉抑制素(MSTN)蛋白和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax的表達(dá)。結(jié)果 與對(duì)照組相比，模型組的腓腸肌重量和肌細(xì)胞的橫截面積明顯減少；給予杜仲總黃酮的各組中腓腸肌重量和肌細(xì)胞的橫截面積也減少，但其減少程度較模型組降低，且與劑量呈正相關(guān)。與對(duì)照組相比，模型組中MSTN蛋白的表達(dá)量明顯增多；杜仲總黃酮各組中MSTN蛋白與對(duì)照組相近，且各組間的表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與對(duì)照組相比，模型組中促凋亡蛋白Bax表達(dá)量明顯增加，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯下降；杜仲總黃酮的各組中，當(dāng)給予劑量達(dá)到100 mg/kg/d及以上時(shí)可明顯抑制Bax的表達(dá)量和促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)量(P<0.05)。結(jié)論 杜仲總黃酮能改善神經(jīng)損傷后SD大鼠的肌萎縮癥狀，可以通過(guò)調(diào)節(jié)MSTN蛋白、凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)量而減少其肌肉重量和肌細(xì)胞大小的損失。

神經(jīng)源性肌萎縮；杜仲；黃酮；腓腸??；MSTN蛋白；Bax；Bcl-2

肌萎縮是指由于肌肉營(yíng)養(yǎng)不良所導(dǎo)致的骨骼肌體積縮小、肌纖維變細(xì)甚至消失的一種疾病。其中由于神經(jīng)肌肉接頭之前的神經(jīng)結(jié)構(gòu)病變所引起的肌萎縮稱之為神經(jīng)源性肌萎縮，在臨床上極為常見(jiàn)，其癥狀與祖國(guó)醫(yī)學(xué)的經(jīng)絡(luò)受損相符，屬“痿癥”范疇。杜仲作為傳統(tǒng)中藥，主要有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨的功效，常用于治療腎陽(yáng)虛之腰腿痛或酸軟無(wú)力等；現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，杜仲有多種活性成分(如木脂素類、萜婁、黃酮類、酚酸類等)和藥理作用(如降低血壓、抗氧化、抗骨質(zhì)疏松和提高免疫力等)[1-3]；關(guān)于杜仲對(duì)神經(jīng)源性肌萎縮是否有明確療效的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究觀察杜仲總黃酮(total flavones of cortex eucommia,TFE)對(duì)神經(jīng)源性肌萎縮大鼠的作用效果，為肌萎縮的治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 1月齡雌性SD大鼠購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；杜仲購(gòu)自遵義市中藥材市場(chǎng)，經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院張玉金副教授鑒定為杜仲(Eucommiaulmoides)。

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津，UV-265-FW)，正置顯微鏡及組織細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)(德國(guó)徠卡，DM4000&Qwin)，凝膠成像儀(美國(guó)BIORAD，ChemiDocXRS)，全齒鉗(上海醫(yī)療器械股份有限公司，JZO7CR)。蘆丁(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)100080-200702)，肌肉抑制素(Myostatin，MSTN)兔多克隆抗體(19142-1-AP)、GAPDH兔多克隆抗體(10494-1-AP)、凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2兔多克隆抗體(12789-1-AP)和凋亡相關(guān)蛋白Bax兔多克隆抗體(50599-2-lg)均為武漢三鷹生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)研究所，A0208)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，P0018)。

1.2 方法

1.2.1 杜仲總黃酮的提取及含量測(cè)定 杜仲總黃酮的提取及含量測(cè)定參考文獻(xiàn)[4-5]進(jìn)行：杜仲樹(shù)皮粉碎成粉末后過(guò)60目篩，精密稱重1 000 g，加入60%乙醇12 000 mL，在微波功率200 W條件下加熱提取20 min，過(guò)濾，提取2次，合并濾液，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后減壓烘干至恒重，再經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂純化，采用70%乙醇洗脫、富集，濃縮干燥得到杜仲皮提取物，提取物和對(duì)照品蘆丁均用甲醇溶解，與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉混合后，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中400～700 nm下進(jìn)行掃描，提取物在510 nm有最大吸收峰，吸收光譜和蘆丁相似，故杜仲皮提取物含有黃酮類物質(zhì)。然后采用蘆丁作為標(biāo)準(zhǔn)品，在紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)中510 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線，得到蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品曲線的回歸方程A=11.568C+0.002 15，R2=0.999 1，測(cè)量杜仲提取物的吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算出杜仲皮中的杜仲總黃酮的含量為5.79 mg/g。最后杜仲總黃酮用雙蒸水配制成濃度為20 mg/mL的混懸液4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 神經(jīng)性肌萎縮大鼠模型的復(fù)制 30只1月齡雌性SD大鼠[體重(100±12) g]，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取24只大鼠，用10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉，右側(cè)臀部及股部剪毛備皮，俯臥固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，常規(guī)消毒，自右側(cè)臀部至股部連線，將皮膚斜行切開(kāi)約12 mm，鈍性分離皮下組織及肌肉，分離出右坐骨神經(jīng)干約10 mm，并使之充分暴露，用全齒鉗(JZO7CR)鉗夾傷右坐骨神經(jīng)干2次，每次5 s，間隔10 s，擠壓傷的寬度為5 mm，使神經(jīng)軸突斷裂，保持神經(jīng)外膜完整性，術(shù)畢傷口內(nèi)注射硫酸慶大霉素1萬(wàn)單位，縫合皮膚并常規(guī)消毒。所有手術(shù)操作均嚴(yán)格遵循無(wú)菌原則；為減小操作產(chǎn)生的誤差，手術(shù)操作均由同一人完成。剩余6只大鼠不做上述坐骨神經(jīng)損傷術(shù)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及處理 6只未手術(shù)的大鼠作為對(duì)照(CON)組；24只手術(shù)的大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組：模型(MOD)組、TFE低劑量(TFEL)組、TFE中劑量(TFEM)組、TFE高劑量(TFEH)組。從術(shù)后第2日開(kāi)始，在自由飲食條件下，分別做如下處理：CON組和MOD組不予以灌胃處理；TFEL組予以灌胃TFE 50 mg/kg/d；TFEM組予以灌胃TFE 100 mg/kg/d；TFEH組予以灌胃TFE 200 mg/kg/d；實(shí)驗(yàn)處理持續(xù)4周，每周灌胃時(shí)間為連續(xù)的5 d。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后完整取下每只大鼠的右后肢腓腸肌稱濕重量。取部分肌肉組織甲醛固定石蠟包埋后制作切片并進(jìn)行HE染色，徠卡正置顯微鏡200倍放大倍數(shù)下觀察，每組取12個(gè)固定面積視野內(nèi)的肌細(xì)胞采用徠卡組織細(xì)胞圖像分析系統(tǒng)測(cè)量細(xì)胞的平均橫截面積。取部分肌肉組織提取總蛋白質(zhì)，用Western blot方法檢測(cè)MSTN、Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況：取50 mg肌肉充分剪碎，加入RAPI裂解液250 μL和終濃度為1 mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF，組織勻漿器中充分研磨并超聲波粉碎，冰上裂解20 min，14 000 r/min離心20 min，取上清液，用BCA法測(cè)定蛋白濃度；采用SDS-PAGE電泳(濃縮膠濃度為4%，分離膠濃度為12%，電壓100 v，2 h)，每組加樣10 μg，總蛋白質(zhì)，電泳結(jié)束后用PVDF膜，200 mA恒流，電轉(zhuǎn)40 min；最后進(jìn)行如下操作：封閉液室溫封閉2 h→4 ℃一抗孵育過(guò)夜→室溫二抗孵育2 h→ECL試劑結(jié)合→凝膠成像儀曝光采集圖像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0中單因素方差分析LSD法進(jìn)行組間均數(shù)比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 腓腸肌重量和肌細(xì)胞面積比較 與CON組相比，MOD組右后肢腓腸肌的重量和肌細(xì)胞的橫截面積明顯減少。TFEL組、TFEM組、TFEH組右后肢腓腸肌的重量和肌細(xì)胞的橫截面積減少量較MOD組有所回升，但仍明顯低于CON組；在抑制腓腸肌的重量減少時(shí)，TFEH組的效果好于TFEL組和TFEM組；在抑制肌細(xì)胞橫截面積縮小時(shí)，TFEM組和TFEH組具有相近的效果且優(yōu)于TFEL組(P<0.05，見(jiàn)表1)。

CON組的腓腸肌中肌細(xì)胞分布均勻，排列整齊，而坐骨神經(jīng)損傷后的各組中結(jié)締組織增多，細(xì)胞排列紊亂，肌細(xì)胞橫截面積參差不齊(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明，杜仲總黃酮能緩解坐骨神經(jīng)損傷后SD大鼠腓腸肌的重量丟失和細(xì)胞大小的縮小。

表1 腓腸肌濕重及肌細(xì)胞橫截面積比較

組別腓腸肌濕重(g)肌細(xì)胞橫截面積(μm2)CON0592±0017106283±9474MOD0315±0032★63958±5291★TFEL0356±0031★▼73941±5493★▼TFEM0436±0028★▼△79803±5731★▼△TFEH0479±0027★▼△◆82233±6491★▼△

★表示與CON組比較，P<0.05；▼表示與MOD組比較，P<0.05；△表示與TFEL組比較，P<0.05；◆表示與TFEM組比較，P<0.05。

A：CON組；B：MOD組；C：TFEL組；D：TFEM組；E：TFEH組。圖1 腓腸肌HE染色切片

2.2 MSTN、Bax和 Bcl-2蛋白的檢測(cè) 從圖2B中可以看到，與CON組相比，MOD組的MSTN表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，TFEL組、TFEM組、TFEH組的MSTN表達(dá)量相近且均低于MOD組(P<0.05)。從圖2C中可以看到，與CON組相比，MOD組和TFEL組的Bax表達(dá)量明顯增加(P<0.05)；與MOD組相比，TFE組中Bax的表達(dá)量均明顯下降，且TFEM組和TFEH組的Bax表達(dá)量相近并低于TFEL組。從圖2D中可以看到，與CON組相比，MOD組、TFEL和TFEM組的Bcl-2表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；與MOD組相比，TFEM組和TFEH組的Bcl-2表達(dá)量增加(P<0.05)且兩組的表達(dá)量相近(見(jiàn)圖2)。結(jié)果表明，杜仲總黃酮在劑量為50 mg/kg/d時(shí)已能降低坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌中MSTN的表達(dá)，當(dāng)劑量達(dá)到100 mg/kg/d及以上時(shí)可顯著抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。

A：western blot檢測(cè)結(jié)果；B：MSTN蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量；D：Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量?！锉硎九cCON組比較，P<0.05；▼表示與MOD組比較，P<0.05；△表示與TFEL組比較，P<0.05；◆表示與TFEM組比較，P<0.05。圖2 MSTN、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

3 討論

骨骼肌是周圍神經(jīng)系統(tǒng)的靶器官，其結(jié)構(gòu)的完整和功能的維持受到神經(jīng)元的支配和調(diào)節(jié)，一旦神經(jīng)元任何部位受到損傷時(shí)，肌肉則發(fā)生快速和嚴(yán)重的萎縮[6-7]，出現(xiàn)肢體筋脈弛緩、軟弱無(wú)力，日久不能隨意運(yùn)動(dòng)之“痿證”。

黃酮類化合物是一類多酚化合物，屬植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛存在于藥用植物、水果、蔬菜等中。有研究發(fā)現(xiàn)給健康大鼠喂飼大豆黃酮后，腓腸肌的肌纖維增大和肌肉重量增加[8]；日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)啤酒花中的異戊烯基黃酮類化合物可以抑制大鼠廢用性肌萎縮[9]，因此黃酮類物質(zhì)用來(lái)防治肌肉萎縮是有潛在可行性；而黃酮類物質(zhì)作為杜仲中常見(jiàn)的一種活性物質(zhì)，主要包括槲皮素、山奈酚、紫云英苷和蘆丁[10-11]等，具有抗骨質(zhì)疏松和抗氧化等作用[1-2]；在本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)其可以抑制神經(jīng)損傷后的肌肉萎縮，進(jìn)一步佐證了杜仲在中醫(yī)中常用來(lái)治療“痿癥”的功效。

肌肉生長(zhǎng)抑制素(MSTN)，又稱為生長(zhǎng)分化因子-8(GDF-8)，屬轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)家族成員，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種重要的肌細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控因子。MSTN在骨骼肌大量表達(dá)，對(duì)骨骼肌生長(zhǎng)具有強(qiáng)大的負(fù)調(diào)控能力。大量研究證實(shí)，不管是在MSTN表達(dá)缺失的動(dòng)物[12-13]，還是在MSTN突變的人群[14]，均出現(xiàn)了異常的肌肉肥大；MSTN過(guò)表達(dá)時(shí)則誘導(dǎo)小鼠骨骼肌萎縮[15-16]，并且在肌肉萎縮的動(dòng)物模型[17]和臨床患者[18-19]均出現(xiàn)骨骼肌中MSTN表達(dá)的顯著增強(qiáng)，提示MSTN參與了骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能的生理和病理生理調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)研究中，SD大鼠的坐骨神經(jīng)損傷后，腓腸肌MSTN蛋白的表達(dá)量升高，表明MSTN的確參與了失去神經(jīng)支配后的肌肉萎縮過(guò)程，而杜仲總黃酮?jiǎng)┝繛?0 mg/kg/d時(shí)已能有效降低它的表達(dá)。

細(xì)胞凋亡是內(nèi)源性基因調(diào)控的主動(dòng)、有序的細(xì)胞自殺性死亡過(guò)程，研究證實(shí)細(xì)胞凋亡參與了肌萎縮。Schmalbruch[20]觀察到萎縮骨骼肌細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、核固縮、染色質(zhì)濃縮等與凋亡相似的形態(tài)改變，Yoshimura等[21]發(fā)現(xiàn)了失神經(jīng)支配后的骨骼肌在萎縮過(guò)程中的細(xì)胞凋亡。由于肌細(xì)胞是多核細(xì)胞，凋亡初期只累及少部分細(xì)胞核，其他細(xì)胞核保持完整性而使細(xì)胞存活相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間且具有一定功能；隨著凋亡持續(xù)發(fā)展，當(dāng)發(fā)生凋亡的細(xì)胞逐漸增加和正常的細(xì)胞核數(shù)量逐漸下降，肌肉也逐漸失去功能，這也是長(zhǎng)期失神經(jīng)支配骨骼肌功能恢復(fù)欠佳的主要原因之一。多種基因家族參與多種通路調(diào)控細(xì)胞凋亡，比如Bcl家族、caspase家族、癌基因C-myc家族等。Bcl家族蛋白在線粒體介導(dǎo)的凋亡通路中起重要調(diào)節(jié)作用，該家族蛋白可分為2類，分別具有抗凋亡和促凋亡的作用，其中Bcl-2和Bax這一對(duì)功能基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用，兩者水平的高低直接決定細(xì)胞的命運(yùn)：Bax表達(dá)增加時(shí)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2表達(dá)增加時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SD大鼠坐骨神經(jīng)損傷后腓腸肌中促凋亡的Bax蛋白表達(dá)增加了，而抑凋亡的Bcl-2蛋白表達(dá)下降了，表明Bcl-2和Bax確實(shí)參與了神經(jīng)損傷后肌肉的萎縮；杜仲總黃酮?jiǎng)┝窟_(dá)到100 mg/kg/d及以上時(shí)能顯著降低Bax的表達(dá)和提高Bcl-2的表達(dá)，其機(jī)理還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，SD大鼠骨骼肌失神經(jīng)支配后，肌肉逐漸萎縮；杜仲總黃酮可以通過(guò)調(diào)節(jié)MSTN蛋白和凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)，減少肌肉重量和肌細(xì)胞大小的損失，從而抑制神經(jīng)損傷后導(dǎo)致的肌肉萎縮。

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[收稿2016-10-05;修回2016-11-13]

(編輯：王靜)

Effect of total flavones of cortex eucommia on neurogenic muscular atrophy rat

ChenQuanli1,HuLi2,WeiWei1,LiSanhua3

(1.Department of Acupuncture,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Pathology,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Research Center for Medicine and Biology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To observe the effect of total flavones of Cortex Eucommia (TFE) on neurogenic muscular atrophy rats.Methods 30 one-month old female Sprague Dawley rats were used.24 rats were picked randomly to crush right sciatic nerves and divided into model group (MOD),group of low dose of TFE (TFEL),group of medial dose of TFE (TFEM) and group of high dose of TFE (TFEH).The rest rats without crush sciatic nerves were used as control group (CON).The rats of MOD and CON groups were fed food and water freely without extra administration.The rats of TFEL,TFEM and TFEH groups (TFE groups) were given TFE at 50,100 and 200 mg/kg/d,respectively via intragastric administration for 4 weeks.All rats were sacrificed after anaesthesia.Gastrocnemius muscles of right hind leg of rats was cut to measure the weight and size of muscle cells.In addition,Myostatin (MSTN) protein and apoptosis related protein Bax and Bcl-2 were examined by Western blot.Results Compared with control group,the muscle mass and cells’ size of model group were declined markedly.When TFE groups were administrated TFE,alleviative effects emerged and had a positive correlation with the concentration of TFE.Compared with control group,the expression of MSTN of model group was higher.The expressions of MSTN of three TFE groups were similar to control group and each TFE group had no difference.The expression of Bax of model group was higher while Bcl-2 was lower than control group.When the doses of TFE were greater than 100 mg/kg/d,the expression of Bax was lower and Bcl-2 was higher than those in model group (P<0.05).Conclusion TFE alleviates the muscular atrophy symptom of SD rats after their sciatic nerve crush,possibly mediated through regulating the expression of MSTN,Bax and Bcl-2 and ultimately resulting in less loss of muscle mass and cells’ size.

neurogenic muscular atrophy; cortex eucommia; flavones; musculus gastrocnemius; MSTN protein; Bax; Bcl-2

貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目(NO：QYZZ20)。

李三華，女，碩士，副教授，研究方向：老年疾病，E-mail:lshvera521@163.com。

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1000-2715(2016)06-0563-05