李曉倩，曹廣如，王英全，王 苗，敖 駿，蔡玉強(qiáng)，岳昌武,3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省微生物資源及藥物開發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 脊柱外科，貴州 遵義 563099; 3.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563002)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

抗結(jié)核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重組質(zhì)粒DNA疫苗的構(gòu)建與表達(dá)

李曉倩1，曹廣如2，王英全1，王 苗1，敖 駿2，蔡玉強(qiáng)2，岳昌武1,3

(1.遵義醫(yī)學(xué)院 貴州省微生物資源及藥物開發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 脊柱外科，貴州 遵義 563099; 3.遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563002)

目的 構(gòu)建抗結(jié)核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重組質(zhì)粒DNA疫苗。方法 利用DNA重組技術(shù)，將激活細(xì)胞免疫和體液免疫的MPT64/Ag85B優(yōu)勢(shì)抗原基因和野生型katG基因編碼區(qū)以及穿孔素/顆粒溶素整合進(jìn)串聯(lián)真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中，構(gòu)建抗結(jié)核重組質(zhì)粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1；電轉(zhuǎn)化方法將質(zhì)粒重組恥垢分枝桿菌制備菌苗；通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000介導(dǎo)將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。應(yīng)用qRT-PCR 技術(shù)在mRNA水平檢測(cè)靶基因體外表達(dá)效果并用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否表達(dá)目的蛋白。結(jié)果 PCR證實(shí)重組質(zhì)粒MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1構(gòu)建成功并制備重組恥垢分枝桿菌菌苗；qRT-PCR分析表明重組質(zhì)粒的靶基因MPT64/Ag85B、katG、GNLY/PRF1基因轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后均有表達(dá)，免疫印跡分析重組質(zhì)粒的融合蛋白MPT64/Ag85B在相對(duì)分子質(zhì)量72 kDa處有明顯蛋白表達(dá)條帶，且融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表達(dá)；融合蛋白GNLY/PRF在相對(duì)分子質(zhì)量75 kDa處有明顯蛋白表達(dá)條帶。結(jié)論 成功構(gòu)建抗結(jié)核MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1重組質(zhì)粒DNA疫苗，為進(jìn)一步研究該疫苗的免疫作用提供依據(jù)。

恥垢分枝桿菌；疫苗；耐藥結(jié)核分枝桿菌；多價(jià)疫苗；表達(dá)分析

結(jié)核病 (tuberculosis,TB)由結(jié)核分枝桿菌 (Mycobacteriumtuberculosis,MTB) 引起的慢性傳染病，是目前危害人類健康的主要疾病[1]。WHO估計(jì)全世界已有約20億人感染結(jié)核病，其中受耐藥菌株感染者可能達(dá)到5 000萬，每年新發(fā)患者約940萬， 每年死亡人數(shù)高達(dá)200萬，在所有傳染病中TB死亡率僅次于AIDS[2]。結(jié)核病的高耐藥率和耐藥結(jié)核分枝桿菌的不斷流行與傳播已成為全球結(jié)核病防控工作中最為棘手的問題[3-4]?？ń槊?Bacillus Calmette-Guerin,BCG)仍是預(yù)防結(jié)核病的有效疫苗，但其免疫保護(hù)效果從0至80%不等，尤其是對(duì)成年人的預(yù)防效果不佳[5-6]，因此，開發(fā)安全有效的新型疫苗勢(shì)在必行。結(jié)核分枝桿菌中有多種分泌蛋白，如Ag85復(fù)合物和MPT64分泌蛋白，尤其是Ag85B和MPT64蛋白能夠引起結(jié)核分枝桿菌感染者強(qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng)，具有較強(qiáng)的免疫原性。近年來Ag85A、Ag85B等優(yōu)勢(shì)抗原基因被用于DNA疫苗、重組 BCG 疫苗、納米疫苗等多種形式的結(jié)核病預(yù)防研究中，且被證實(shí)具有很好的免疫保護(hù)效果[7-8]。Ag85A、Ag85B、MPT64等抗原基因單獨(dú)或聯(lián)合免疫都具有一定的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫或細(xì)胞免疫的活性，且多基因聯(lián)合免疫則表現(xiàn)出更好的免疫效果[9]。顆粒溶素(granulysin,GNLY)是一種天然的抗菌肽，與穿孔素(perforin,PRF1)共同定位于人的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷細(xì)胞(NK)顆粒中，具有抗病原微生物、抗腫瘤等多種生物活性。而穿孔素可在靶細(xì)胞膜上形成多聚穿孔素管狀通道，導(dǎo)致靶細(xì)胞溶解破壞。穿孔素還可使一些顆粒分子如顆粒溶素進(jìn)入靶細(xì)胞內(nèi)，對(duì)胞內(nèi)感染發(fā)揮免疫作用。研究證實(shí)顆粒溶素在體外72 h內(nèi)可直接殺死90%以上的結(jié)核分枝桿菌[10]，兩者均對(duì)結(jié)核病具有保護(hù)性免疫作用[11-12]。本研究利用基因工程技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒MPT64/Ag85B:katG:GNLY/PRF1串聯(lián)真核表達(dá)質(zhì)粒，并在293T細(xì)胞檢測(cè)到目的基因和蛋白的表達(dá)，為后續(xù)用于小鼠結(jié)核病的治療實(shí)驗(yàn)提供理論和實(shí)踐依據(jù)，為新型抗結(jié)核疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株、菌株和載體 人源胚胎腎293T細(xì)胞由醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心口腔實(shí)驗(yàn)室劉建國教授課題組惠贈(zèng)、載體pIRES2-EGFP和pcDNA3.1(+)由本課題組保存、大腸桿菌基因工程菌JM109購自博邁德生物科技公司，恥垢分枝桿菌(CGMCC1.0562)購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.1.2 試劑與主要儀器 總RNA提取試劑盒(RNAiso Plus*)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶(寶生物大連公司)；DL2000 DNA maker、高純質(zhì)粒小量抽提試劑盒(博邁德北京生物科技公司)；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工生物工程上海有限公司)；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自(invitrogen美國公司)；Hyclone DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶消化液、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、TBS(索萊寶北京有限公司)；兔抗結(jié)核分枝桿菌Ag85B，兔抗結(jié)核分枝桿菌MPT64(abcam英國公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG(碧云天生物技術(shù)江蘇公司)。

Clinx Chemi Scope5000系列一體式化學(xué)發(fā)光儀器(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)。SYBR?PrimeScript TM RT PCR KitⅡ(Takara)；MINI Trans-Blot電轉(zhuǎn)化儀( Bio-Rad)，CFX96 熒光定量 PCR 儀(BIO-RAD)；超凈臺(tái)(SW-CJ-2FD)蘇州凈化設(shè)備有限公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)(SYNGENE)。采用 Primer Premier5 軟件設(shè)計(jì)引物，引物合成及目的基因測(cè)序由英濰捷基(廣州)有限公司完成，唯尚立德(北京)生物科技有限公司完成全基因合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 課題組前期以恥垢分枝桿菌基因組DNA為模板，克隆分枝桿菌復(fù)制起始點(diǎn)oriM，構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-OriM，以結(jié)核分枝桿菌基因組DNA為模板，克隆katG和MPT64、Ag85B基因，分別構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-katG、pcDNA3.1-MPT64/Ag85B；以人cDNA為模板，克隆GNLY、PRF1編碼基因，構(gòu)建質(zhì)粒pcDNA3.1-GNLY/PRF1。具體方法如下：①NotI、XbaI酶切pcDNA3.1-OriM和pIRES2-EGFP質(zhì)粒，分別出現(xiàn)2.1 kb、5.4 kb和5.2 kb條帶，切膠回收2.1 kb條帶與5.2 kb連接，構(gòu)建pIRES2-EGFP-OriM；②NheI、BglII酶切pcDNA3.1-katG和pIRES2 EGFP-OriM質(zhì)粒，分別出現(xiàn)2.2 kb、5.4 kb和7.4 kb條帶，切膠回收2.2 kb條帶與7.4 kb連接；構(gòu)建pIRES2-EGFP-OriM-katG；③XhoI、EcoRI酶切pcDNA3.1-MPT64/Ag85B和pIRES2 EGFP-OriM-katG質(zhì)粒，分別出現(xiàn)2.3 kb、5.4 kb和9.6 kb條帶，切膠回收2.3 kb條帶與9.6 kb連接，構(gòu)建pIEMKMA；④EcoRI、PstI酶切pcDNA3.1-GNLY/PRF1和pIEMKMA質(zhì)粒，分別出現(xiàn)2.5 kb、5.4 kb 和12 kb條帶，切膠回收2.5 kb與12 kb連接構(gòu)建定向表達(dá)的多基因串聯(lián)表達(dá)質(zhì)粒載體pIEMKMAGP。

1.2.2 重組恥垢分枝桿菌菌苗的構(gòu)建

1.2.2.1 電轉(zhuǎn)化 取質(zhì)粒，溶于無菌水中，調(diào)整質(zhì)粒濃度為1 μg/μL；取5 μL質(zhì)粒DNA和400 μL恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)菌置于0.2 cm直徑的穿孔杯(預(yù)冷)中輕輕混勻；冰浴10 min后，電轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌(電穿孔參數(shù)為：電壓2.5 kV、電容25 μF、電阻1 000 Ω)；電穿孔后，立即冰浴10 min，將細(xì)胞迅速加入5 mL的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)3 h；將上述菌液(200 μL)涂布于含 300 μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選，室溫靜置至水分滲入培養(yǎng)基中，封口膜封閉平板，倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d后，可見白色干燥的單個(gè)菌落。

1.2.2.2 菌液PCR進(jìn)行基因型鑒定 挑取單菌落分別接種于5 mL含500 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)3～4 d；取1 mL菌液，離心棄上清，沉淀加入0.5 mL三蒸水，100 ℃加熱裂解8 min；取上清2 μL菌液進(jìn)行PCR，鑒定篩選陽性克隆；以轉(zhuǎn)化菌的單克隆為模板，通過特異性引物進(jìn)行PCR，將擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若PCR 產(chǎn)物片段大小與目的片段大小一致，則證明轉(zhuǎn)化成功。

1.2.2.3 制備菌苗 挑取LB固體培養(yǎng)基上陽性克隆重組菌落，以0.05%吐溫鹽水充分研磨后，接種LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)約3 d后，離心棄上清；以高壓滅菌的0.9%生理鹽水反復(fù)淘洗后自然沉淀3次，每次10 min，取上清，棄沉淀；分別以完全DMEM培養(yǎng)液重新調(diào)整細(xì)菌濃度2×107CFU/L，即得菌苗。

1.2.3 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)共分3組，C為空白對(duì)照組：用含10%的新生牛血清DMEM(高糖)培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞；B為載體對(duì)照組：載體PIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞；A為實(shí)驗(yàn)組：質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。各組細(xì)胞(細(xì)胞密度為1×105/mL)均接種于6孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞種板24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染步驟按照LipofectinTM2 000說明書要求進(jìn)行。

1.2.4 Real-Time RT-PCR 總RNA提取：按照RNAiso Plus*試劑說明書進(jìn)行總RNA的提取。取1 000 ng RNA利用寶生物PrimescriptTMRT reagent kit (DRR037A)，采用20 μL PCR體系反轉(zhuǎn)錄條件如下：37 ℃溫育15 min，然后 85 ℃加熱5 s (失活反轉(zhuǎn)錄酶)。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA品為模板，分別擴(kuò)增katG、Ag85B/MPT64和GAPDH基因。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；從55 ℃開始，每0.5 ℃采集1次熒光，每次10 s，共采集81次確定熔解曲線。熒光定量PCR引物序列(見表1)。

表1 熒光定量PCR引物及序列

基因引物名稱引物序列產(chǎn)物長度(bp)katGKatG-FP5＇-GATGGGGCTGATCTACGTGA-3＇151KatG-RP5＇-CTTACCGAAAGTGTGACCGC-3＇Ag85B/MPT64Ag85B/mpt64-FP5＇-CAATGATCTTGGCCGCCTAC-3＇211Ag85B/mpt64-RP5＇-CCCGCAATAAACCCATAGCC-3＇GNLY/PRF1GNLY/PRF1-FP5＇-CCCAGAAGGTACCCCATTGT-3＇232GNLY/PRF1-RP5＇-CACTTCTCTGGGTGGGCTTA-3＇GAPDHGAPDH-FP5＇-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3＇186GAPDH-RP5＇-TGATGACAAGCTTCCCGTTCTC-3＇

1.2.5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá) 培養(yǎng)293T細(xì)胞并于轉(zhuǎn)染48、60 h收集細(xì)胞，RIPA裂解液提取蛋白，并用丙酮沉淀的方法濃縮上清蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量，分裝冷凍保存。Western blot鑒定：上樣(20 μg)，10% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(350 mA，2 h)。封閉[5%(w/v)脫脂奶粉，2 h]，一抗(兔抗結(jié)核分枝桿菌Ag85B，1∶5 000、兔抗結(jié)核分枝桿菌MPT64，1∶1 000)4 ℃過夜，PVDF膜用TBST洗膜6次，5 min/次，二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG)室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑工作液進(jìn)行蛋白信號(hào)檢測(cè)，Clinx Chemi Scope 5000系列一體式化學(xué)發(fā)光儀器曝光拍照分析。

2 結(jié)果

2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 質(zhì)粒pcDNA3.1-oriM、pcDNA3.1-katG、pcDNA3.1-MPT64/Ag85B、pcDNA3.1-GNLY/PRF1前期構(gòu)建成功。NotI、XbaI酶切pcDNA3.1-oriM，出現(xiàn)2.1 kb和5.4 kb 大小的2個(gè)目的條帶(見圖1A)，切膠回收2.1 kb條帶；NotI和XbaI酶切pIRES2-EGFP質(zhì)粒出現(xiàn)唯一條帶5.2 Kb，與pcDNA3.1-oriM酶切產(chǎn)物2.1 Kb相連，命名pIRES2-EGFP-ORIM。NheI、BglII酶切pcDNA3.1-katG，出現(xiàn)2.2 kb和5.4 kb 2條帶(見圖1B)，切膠回收2.2 Kb條帶；NheI、BglII酶切pIRES2-EGFP-ORIM質(zhì)粒，出現(xiàn)唯一條帶7.4 Kb，與pcDNA3.1-katG酶切產(chǎn)物2.2 Kb相連，命名pIRES2-EGFP-ORIM-katG。XhoI、EcoR I酶切pcDNA3.1-MPT64/Ag85B，出現(xiàn)2.3 Kb和5.4 Kb 2條帶(見圖1C)，切膠回收2.3 Kb條帶；XhoI、EcoR I酶切pIRES2-EGFP-ORIM-katG，出現(xiàn)唯一條帶9.6 Kb，與pcDNA3.1-MPT64/Ag85B酶切產(chǎn)物2.3 kb相連，命名pIEMKMA，EcoRI、PstI酶切pIEMKMA質(zhì)粒，出現(xiàn)唯一的條帶12 Kb，與pcDNA3.1-GNLY/PRF1酶切產(chǎn)物2.5 kb相連(見圖1D)，并測(cè)序驗(yàn)證結(jié)果表明，成功構(gòu)建目標(biāo)質(zhì)粒pIEMKMAGP(見圖2)。

A圖中，M：Marker(DL10 000)；1：pcDNA3.1-oriM 酶切片段(NotI/XbaI)。B圖中，M：DNA Marker DL5 000；2：pcDNA3.1-katG 酶切片段(NheI/BglII)。C圖中，M：DNA Marker DL5 000；3：pcDNA3.1-MPT64/Ag85B 酶切片段(XhoI/EcoRI)。D圖中，M：Marker (DL10 000)；4：pcDNA3.1-GNLY/PRF1 酶切片段(EcoRI/PstI)。圖1 pIRES2-EGFP-ORIM-katG-MPT64/Ag85B:GNLY/PRF1(pIEMKMAGP)質(zhì)粒酶切結(jié)果

圖2 pIRES2-EGFP-ORIM-katG-MPT64/Ag85B:GNLY/PRF1(pIEMKMAGP)質(zhì)粒圖譜

2.2 重組恥垢分枝桿菌菌苗的構(gòu)建 制備恥垢分枝桿菌感受態(tài)細(xì)菌，通過電轉(zhuǎn)化將構(gòu)建的DNA疫苗pIEMKMAGP轉(zhuǎn)化恥垢分枝桿菌，通過抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒pIEMKMAGP成功電轉(zhuǎn)化重組恥垢分枝桿菌，菌落PCR擴(kuò)增結(jié)果：分別用引物對(duì)oriM、katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1編碼基因擴(kuò)增，分別在1 500 bp、1 500 bp、1 800 bp、1 800 bp處見到特異性目標(biāo)條帶，與理論值大小相符(見圖3)，引物序列見表2。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果效果分析 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞48 h后在熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光產(chǎn)生(見圖4)，空白對(duì)照組均未見熒光蛋白表達(dá)，表明目標(biāo)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，且插入基因系統(tǒng)可以成功表達(dá)。

M：DNA DL2 000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1：orim PCR的擴(kuò)增片段；2：katG PCR的擴(kuò)增片段；3：mpt64-ag85b PCR的擴(kuò)增片段；4：顆粒溶素-穿孔素 PCR的擴(kuò)增片段；5：orim的陰性對(duì)照；6：katG的陰性對(duì)照；7：mpt64-ag85b的陰性對(duì)照；8：顆粒溶素-穿孔素的陰性對(duì)照。 圖3 質(zhì)粒pIEMKMAGP電轉(zhuǎn)化重組恥垢分枝桿菌菌落PCR鑒定

表2 PCR引物及序列

基因引物名稱引物序列產(chǎn)物長度(bp)oriMF5＇-GCACCCAGTCCGCCCTGAGC-3＇1500R5＇-CAAACCTGCTGGTCGTGGAC-3＇katGF5＇-GAACGGCAACCCGGACCCCAT-3＇1500R5＇-AACGCACACCGGCCTTATTC-3＇Ag85B/MPT64F5＇-GGCGCTTGTCGAGGTCTATG-3＇1800R5＇-ACTATCGACAGTCCCGACTG-3＇IRES/GNLY/PRF1F5＇-TCCCGCCCAACGGCACGCAC-3＇1800R5＇-GAGGTGTGATGGCCGCCAAC-3＇

A、B分別是PIRES2-EGFP載體、質(zhì)粒pIEMKMAGP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞自然光視野圖，D、E分別是 PIRES2-EGFP載體、質(zhì)粒pIEMKMAGP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞熒光視野圖，C、F均為空白細(xì)胞對(duì)照。圖4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞結(jié)果(×200)

2.4 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人源胚腎293T細(xì)胞中靶基因在mRNA水平上表達(dá) 利用定量PCR分析技術(shù)對(duì)質(zhì)粒pIEMKMAGP成功轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中靶基因katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)(見表3和圖5)，結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組和載體組分別比較，靶基因katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1融合基因在293T細(xì)胞內(nèi)在mRNA水平上成功表達(dá)。

基因組別Ct△Ct△△Ct2-△△CtMPT64/Ag85BA1545±070-089±017?#-497±0515780±084B2033±042397±096-045±021460±070C2127±043400±038——katGA1622±043-012±009?#-564±0674870±160B2212±070580±071068±041081±020C2185±076550±064——GNLY/PRFA1581±024-054±027?#-477±0353890±201B1978±015343±079-057±079250±281C2035±032400±041——GAPDH1661±021———

與空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與載體對(duì)照組相比，#P<0.05。

與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；與載體對(duì)照組比較，#P<0.05。 圖5 質(zhì)粒pIEMKMAGP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測(cè)katG、MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1基因在mRNA水平上表達(dá)情況

2.5 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后蛋白表達(dá)情況 Western blot鑒定結(jié)果顯示，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的總蛋白和上清蛋白Western blot 鑒定均可見到融合蛋白MPT64/Ag85B大小為72 kDa左右的條帶(見圖6B、C)，并可見融合蛋白GNLY/PRF1大小為75 kDa左右的條帶(見圖6D)，表明融合基因MPT64/Ag85B、GNLY/PRF1在293T細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，且檢測(cè)到融合蛋白MPT64/Ag85B可分泌表達(dá)。

A：β-actin; B：胞漿蛋白MPT64/Ag85B檢測(cè)；C：分泌蛋白MPT64/Ag85B檢測(cè)；D:胞漿蛋白GNLY/PRF1檢測(cè)；1：轉(zhuǎn)染48 h；2：空載體對(duì)照；3：轉(zhuǎn)染60 h；4：空載體對(duì)照；5:空白對(duì)照。 圖6 質(zhì)粒pIEMKMAGP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測(cè)MPT64/Ag85B和GNLY/PRF1基因在蛋白水平上表達(dá)情況

3 討論

近年來，隨著感染多重耐藥結(jié)核菌的患者大量出現(xiàn)，國內(nèi)外的新型疫苗和增強(qiáng)卡介苗研究工作日益受到重視，候選疫苗篩選和新型抗結(jié)核疫苗的研究迫在眉睫[13-14]。目前，臨床上尚缺乏對(duì)耐藥結(jié)核及肺癌同時(shí)具有預(yù)防和治療作用的藥物或多價(jià)基因工程菌苗?；蚬こ桃呙缁蚓缈赡苁墙窈竽退幗Y(jié)核疫苗研究的一個(gè)重要方向，如何做到對(duì)絕大部分耐藥結(jié)核都具有預(yù)防和治療作用，是新型疫苗創(chuàng)制過程中應(yīng)關(guān)注的關(guān)鍵問題之一。機(jī)體對(duì)結(jié)核桿菌雖能產(chǎn)生抗體，但無保護(hù)作用，其抗感染主要依賴細(xì)胞免疫。Ag85B是Ag85復(fù)合體的組成部分，Ag85b和mpt64可誘導(dǎo)TH1型免疫應(yīng)答，是結(jié)核分支桿菌的保護(hù)性抗原[15]。穿孔素與對(duì)結(jié)核桿菌的拮抗能力有著密切聯(lián)系，主要機(jī)制是由于CD8+T細(xì)胞促使穿孔素等具有溶解感染細(xì)胞進(jìn)而使得內(nèi)源性的DNA內(nèi)切酶被激活使得細(xì)胞凋亡增強(qiáng)。研究證實(shí)顆粒溶解具有很強(qiáng)的抗結(jié)核桿菌活性，顆粒溶素是一種天然的抗菌肽，它是評(píng)價(jià)機(jī)體細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的新指標(biāo)，結(jié)核病患者體內(nèi)顆粒溶素的產(chǎn)生受到選擇性抑制，成功治療后則持續(xù)回升[16]。顆粒溶素不僅可以直接殺傷胞外結(jié)核桿菌，而且在穿孔素的協(xié)同作用下也可殺傷胞內(nèi)結(jié)核菌。有研究表明，穿孔素和顆粒溶素在肺結(jié)核患者發(fā)生病變部位的表達(dá)水平明顯低于正常組織[17-18]。穿孔素和顆粒溶素對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷作用表明穿孔素、顆粒溶素可以用作人結(jié)核免疫性保護(hù)的標(biāo)記，并可用來研究更多有效的結(jié)核疫苗[19]。

本研究選取能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的結(jié)核分枝桿菌優(yōu)勢(shì)抗原Ag85B和MPT64編碼基因、對(duì)結(jié)核分枝桿菌有殺傷作用的穿孔素與顆粒溶素編碼基因，以及katG編碼基因整合到改造后的適合多基因串聯(lián)表達(dá)的真核表達(dá)質(zhì)粒載體中，并成功轉(zhuǎn)化和結(jié)核分枝桿菌具有相同屬特異性抗原的人正常菌株恥垢分枝桿菌體內(nèi)制成菌苗，成功構(gòu)建了可能在細(xì)胞、體液免疫水平、和顆粒溶素與穿孔素生物治療作用及katG輔助異煙肼化療的多效DNA疫苗。本研究所用的靶基因均為功能已知基因，其功能已經(jīng)確證。且DNA疫苗涉及的各個(gè)片段除katG未做成基因疫苗外，其他片段分別前人做成單獨(dú)或組合DNA疫苗并被證明有功能。本課題結(jié)合靶向結(jié)核分枝桿菌穿孔素、表面抗原決定簇抗體、顆粒溶素融合蛋白、異煙肼活化酶真核表達(dá)等多個(gè)層次綜合殺滅耐藥結(jié)核分枝桿菌，利用恥垢分枝桿菌等減毒生物體載體開發(fā)費(fèi)用低廉、靶向性好、實(shí)用性強(qiáng)的新型治療性活疫苗。并且重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞檢測(cè)融合蛋白MPT64/Ag85B和GNLY/PRF1成功表達(dá)，為進(jìn)一步研究該疫苗的免疫效果奠定基礎(chǔ)。

[1] Manjelievskaia J,Erck D,Piracha S,et al.Drug-resistant TB:deadly,costly and in need of a vaccine[J].Trans R Soc Trop Med Hyg,2016,110(3):186-191.

[2] Kaufmann S H.Novel tuberculosis vaccination strategies based on understanding the immune response[J].Journal of Internal Medicine,2010,267(4):337-353.

[3] Vandepittel W P,Rattanasataporn R,Treeratweeraphong V.Drug-resistant tuberculosis among urban thai children:A 10-year review[J].Southeast Asian J Trop Med Public Health,2015,46(5):892-900.

[4] Nusrath U A,Hanna L E,Swaminathan S.A note on derivatives of isoniazid,rifampicin,and pyrazinamide showing activity against resistant mycobacterium tuberculosis[J].Chem Biol Drug Des,2016,87(4):537-50.

[5] Wiker H G,Mustafa T,Mlen H,et al.Vaccine approaches to prevent Tuberculosis[J].Scand J Immunol,2006,64(3):243-250.

[6] Tyagi A K,Nangpal P,Satchidanandam V.Development of vaccines against tuberculosis[J].Tuberculosis (Edinb),2011,91(5):469-478.

[7] Lu Y,Xu Y,Yang E,et al.Novel recombinant BCG coexpressing Ag85B,ESAT-6 and Rv2608 elicits significantly enhanced cellular immune and antibody responses in C57BL/6 mice[J].Scand J Immunol,2012,76(3):271-277.

[8] Yu F,Wang J,Dou J,et al.Nanoparticle-based adjuvant for enhanced protective efficacy of DNA vaccine Ag85A-ESAT-6-IL-21 against Mycobacterium tuberculosis infection[J].Nanomedicine,2012,8(8):1337-1344.

[9] Evans T G,Schrager L,Thole J.Status of vaccine research and development of vaccines for tuberculosis[J].Vaccine,2016,34(26):2911-2914.

[10] Stenger S,Hanson D A,Teitelbaum R,et al.An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by granulysin[J].Science,1998,282(5386):121-125.

[11] Ribeiro S P,Milush J M,Cunha-Neto E,et al.The CD8+ memory stem T cell subset is associated with improved prognosis inchronic HIV-1 infection[J].J Virol,2014,88(23):13836-13844.

[12] Sousa A O,Mazzaccaro R J,Russell R G,et al.Relative contributions of distinct MHC class I-dependent cell populationsin protection to tuberculosis infection in mice[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2000,97(8):4204-4208.

[13] Chiang C Y,Van Weezenbeek C,Mori T,et al.Challenges to the global control of tuberculosis[J].Respirology,2013,18(4):596-640.

[14] Yu X,Li C,Hong W,et al.Autophagy duringMycobacteriumtuberculosisinfection and implications for future tuberculosis medications[J].Cell Signal,2013,25(5):1272-1278.

[15] Baldwin S L,D'Souza C D,Orme I M,et al.Immunogenicity and protective efficacy of DNA vaccines encoding secreted and non -se-creted forms ofMycobacteriumTuberculosisAg85A[J].Tubercle and Lung Disease,1999,79(4):251-259.

[16] Dieli F,Sireci G,Caccamo N,et al.Selective depression of interferon-gamma and granulysin production with increase of proliferative response by Vgamma9/Vdelta2 T cells in children with tuberculosis[J].J Infect Dis,2002,186(12):1835-1839.

[17] Andersson J,Samarina A,Fink J,et al.Impaired expression of perforine and granulysin in CD8+T cell at the site of nifection in human chronic polmonary ruberculosis[J].Infect Immun,2007,75(11):5210-5222.

[18] Stegelmann F,Bastian M,Swlboda K,et al.Coordinate expression of chemokine ligand 5,granulysin,and perforin in CD8+T cells provides a host defense mechanism againstMycobacteriumtuberculosis[J].J Immunol,2005,175(11):7474-7484.

[19] 萬引，雷建平.穿孔素及顆粒溶素在肺結(jié)核免疫治療中的作用[J].江西醫(yī)藥，2008,43(12):1436-1438.

[收稿2016-09-12;修回2016-11-02]

(編輯：王靜)

Construction and expression of a plasmid DNA vaccine MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1 againstMycobacteriumtuberculosis

LiXiaoqian1,CaoGuangru2,WangYingquan1,WangMiao1,AoJun2,CaiYuqiang2,YueChangwu1,3

(1.Guizhou Key Laboratory of Microbial Resources & Drug Development,Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Department of Spinal Surgery,Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Key Laboratory,Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563002,China)

Objective Construction and expression of a plasmid DNA vaccine MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1 againstMycobacteriumtuberculosis.Methods A polyvalent DNA vaccine was constructed by integrated the artificially fused gene with the coding regions of Ag85B/MPT64,GNLY/PRF1 and the coding region of kat G into pIRES2-EGFP.After the vaccine was transfected into 293T cells mediated with lipofectamine 2000 for 48 h,the protein was examined by Western blotting techniques.ResultsMPT64/Ag85B,GNLY/PRF1andkatGgenesweresuccessfullyamplifiedbyPCR.TheresultsofWesternblottingdemonstratedthattheproteinwasexpressedin293TcellsandfusionproteinMPT64/AG85Bwasexpressed.Conclusion MPT64-Ag85B/katG/GNLY-PRF1 vaccine ofMycobacteriumtuberculosiswas constructed,which may the provide basis for development of new anti-tuberculosis vaccine.

Mycobacteriumsmegmatis; vaccine; drug-resistantMycobacteriumtuberculosis; multipartial vaccine; expression analysis

貴州省科技廳社發(fā)攻關(guān)項(xiàng)目(NO：黔科合SY字2015[3036])；遵義醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)-臨床合作項(xiàng)目(NO：F-688)。

岳昌武，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與新藥創(chuàng)制，E-mail:changwuyue@126.com。

R186

A

1000-2715(2016)06-0577-07