劉偉 代應貴 袁振興 范家佑

摘要：【目的】研究分析貴州都柳江鲇、斑鳠種群細胞色素b基因（Cyt b）的遺傳多樣性，為都柳江鲇形目經(jīng)濟魚類資源的保護和開發(fā)利用提供參考依據(jù)?！痉椒ā恳訮CR擴增都柳江鲇、斑鳠種群的Cyt b基因序列，經(jīng)雙向測序、拼接后采用相關在線軟件進行序列變異及遺傳多樣性分析?！窘Y(jié)果】都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因序列均為1122 bp，分別檢測到46和15個變異位點，對應定義為11個單倍型（NHap1～NHap11）和10個單倍型（BHap1～BHap10）。都柳江鲇、斑鳠種群的單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.646、0.00899和0.610、0.00101。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因序列均編碼374個氨基酸，包含20種氨基酸，以亮氨酸平均含量最高（17.65%和16.58%）、半胱氨酸平均含量最低（0.80%和0.78%）。4種堿基在這兩種魚類Cyt b基因密碼子第1位點上出現(xiàn)頻率約等，在第2、3位點上的出現(xiàn)頻率則存在明顯差異。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因密碼子第3位點上的變異頻率顯著高于第1和第2位點，但第3位點上的變異多為同義突變?！窘Y(jié)論】都柳江鲇種群大小穩(wěn)定，具有較豐富的遺傳多樣性；都柳江斑鳠種群遺傳多樣性較匱乏，可能經(jīng)歷過瓶頸效應和種群擴張事件，急需開展種群保護和恢復工作。

關鍵詞： 鲇；斑鳠；Cyt b基因；遺傳多樣性；都柳江

中圖分類號： S917；Q959.4 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）10-1766-06

0 引言

【研究意義】鲇（Silurus asotus）、斑鳠（Hemibagrus guttatus）為我國重要淡水經(jīng)濟魚類，分別隸屬于鲇形目（Siluriformes）的鲇科（Siluridae）和鲿科（Bagridae）。鲇在我國各大水系均有分布（除新疆和西藏外）；斑鳠主要分布于錢塘江、九龍江和珠江等水系（褚新洛等，1999），因其肉質(zhì)細嫩、味道鮮美、無肌間刺等優(yōu)點，被視為珠江四大名魚之一（陳焜慈等，1999）。都柳江位于貴州境內(nèi)，為珠江水系西江中游支流——柳江的源流。近年來，因鲇和斑鳠的市場需求量不斷增大，在都柳江受到高強度捕撈，其野生資源遭受嚴重破壞。因此，深入研究都柳江鲇、斑鳠種群遺傳多樣性及其分布現(xiàn)狀，對開展這兩種魚類野生種群資源的利用與保護具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】DNA分子標記是魚類遺傳多樣性研究的有效手段（Liu and Cordes，2004），可為制定魚類種質(zhì)資源的利用與保護策略提供參考依據(jù)。線粒體DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）為核外基因，具有母系遺傳的特點，因其復制過程中缺乏修復機制而導致其序列的累積變異速率遠高于核基因組的變異速率，現(xiàn)已成為群體遺傳學研究中的理想分子標記（Saccone et al.，1991）。細胞色素b基因（Cyt b）是mtDNA中結(jié)構(gòu)和功能研究較清楚的編碼基因之一，其進化速度適中，適用于種群遺傳多樣性檢測，現(xiàn)已在魚類種群遺傳多樣性研究中得到廣泛應用（Meyer and Wilson，1990；徐宇等，2015）。杜民等（2009）基于Cyt b基因序列探討我國南海裸胸鱔屬（Gymnothorax）魚類系統(tǒng)發(fā)育關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除蠕紋裸胸鱔（Gymnothorax kidako）來源于日本海外，其余5種裸胸鱔均來源于我國南海，但彼此間并無明顯的地域差異。肖明松等（2013）對淮河鲇的7個野生種群Cyt b基因進行測定，結(jié)果表明，淮河鲇野生種群的遺傳多樣性較高，且各種群間未發(fā)生明顯的地理分化。鐘立強等（2013）對長江中下游5個湖泊的黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）種群Cyt b基因進行分析，結(jié)果表明，5個群體間遺傳分化系數(shù)Fst為0.0684，幾乎所有變異均來自群體內(nèi)，群體間遺傳分化極小，即長江中下游不同黃顙魚種群尚未分化成不同的分支譜系，種群間存在廣泛的基因交流。徐丹丹（2013）對鲇的長江、珠江、遼河及東南沿海等8個不同地理種群Cyt b基因進行分析，結(jié)果顯示這8個地理種群尚保存著較豐富的遺傳多樣性。李大命等（2015）以Cyt b為分子標記對太湖大銀魚（Protosalanx chinensis）野生群體進行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明太湖大銀魚種群穩(wěn)定，尚未經(jīng)歷種群擴張?！颈狙芯壳腥朦c】目前，貴州都柳江鲇、斑鳠野生資源正遭受過度捕撈，開展其野生種群保護及種質(zhì)資源遺傳多樣性評估十分迫切，但至今鮮見有關貴州都柳江鲇、斑鳠野生種群遺傳多樣性的研究報道?！緮M解決的關鍵問題】通過對貴州都柳江鲇、斑鳠的Cyt b基因序列進行測定分析，研究其種群的遺傳多樣性，為都柳江鲇形目經(jīng)濟魚類的資源保護和開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

于都柳江干流上、中、下游的獨山、三都、榕江和從江分別收集野生鲇、斑鳠各39尾鮮活個體。每尾活魚取背部肌肉3.0～5.0 g，以無水乙醇固定后及時帶回實驗室，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2 DNA提取

采用北京天根生化科技有限公司提供的DNA提取試劑盒，參照其說明從肌肉樣品提取基因組DNA。DNA的質(zhì)量和純度用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 Cyt b基因擴增與測序

用于擴增鲇、斑鳠Cyt b基因片段的引物為通用引物L14724（5'-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3'）和H15915（5'-CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC-3'）（Xiao et al.，2001），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系25.0 μL，包括2×Ex Taq Bufffer 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板2.0 μL，用ddH2O補足至25.0 μL。擴增程序參照肖明松等（2013）的方法。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將電泳條帶清晰、明亮且單一的產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序、拼接，測序引物為擴增引物。

1. 4 數(shù)據(jù)處理

序列輸入ClustalX 2.1進行比對分析，輔以人工校對，獲取長度相同的同源序列用于種群遺傳多樣性分析。用DnsSP 5.10計算遺傳多樣性參數(shù)，采用MEGA 5.0分析序列堿基含量及Kimura 2-parameter遺傳距離，并將核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。分別以大口鲇（Silurus meridionalis）Cyt b基因的同源序列（登錄號JX087350.1）、大鰭鳠（Hemibagrus macropterus）Cyt b基因的同源序列（登錄號JF834542.1）為外類群，構(gòu)建鲇、斑鳠單倍型的系統(tǒng)發(fā)育進化樹。同時采用Arlequin Ver. 3.01進行都柳江鲇、斑鳠種群的Tajimas D中性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2. 1 都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因的序列組成及變異情況

PCR擴增獲得的都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因序列長度均為1122 bp，然后分別進行遺傳多樣性分析研究。從39個鲇樣本中共檢測出11個單倍型，即NHap1～ NHap11（表1）。其中，NHap2為優(yōu)勢單倍型，其個體數(shù)占總個體數(shù)的58.97%，其次是NHap4，占總個體數(shù)的10.26%。從39個斑鳠樣本中共檢測出10個單倍型，即BHap1～BHap10（表2），其中以BHap2和BHap1為優(yōu)勢單倍型，分別占總個體數(shù)的61.54%和12.82%。

鲇Cyt b基因序列堿基T、C、A、G的平均含量分別為28.4%、29.9%、27.7%和14.0%，且A+T的平均含量（56.1%）明顯高于C+G的平均含量（43.9%），表現(xiàn)出較強的少G偏倚性。鲇Cyt b基因共編碼374個氨基酸，包含20種氨基酸。其中，亮氨酸的平均含量最高（17.65%），半胱氨酸的平均含量最低（0.80%）。4種堿基在氨基酸密碼子3個位點的出現(xiàn)頻率存在明顯差異（表3），其中，在密碼子第1位點上無明顯的堿基偏倚性，第2位點上存在明顯的T偏倚和反G偏倚，第3位點上存在反G偏倚且顯示明顯的A和C偏倚。鲇Cyt b基因序列中共檢測到46個變異位點（表1），變異位點數(shù)占總位點數(shù)（1122）的4.1%。其中，簡約信息位點38個，單一變異位點8個，未檢測到插入或缺失位點；轉(zhuǎn)換位點43個（C→T，26個；A→G，17個），顛換位點3個（T→G、C→A及T→A各1個），平均轉(zhuǎn)顛換比為14.33，轉(zhuǎn)換位點數(shù)明顯多于顛換位點數(shù)。變異位點主要發(fā)生在密碼子第3位點上（35/46），其次是第1位點（8/46）和第2位點（3/46）。

都柳江斑鳠種群Cyt b基因序列亦編碼374個氨基酸，包含20種氨基酸。20種氨基酸平均含量存在明顯差異，其中以亮氨酸平均含量最高（16.58%）、半胱氨酸平均含量最低（0.78%）。斑鳠Cyt b基因序列中堿基T、C、A、G的平均含量分別為31.8%、25.8%、29.3%和13.1%，A+T的平均含量（61.1%）也明顯高于C+G的平均含量（38.9%）。由表3可知，斑鳠4種堿基在其氨基酸密碼子第1、2位點上的分布特征與鲇相似，但在密碼子第3位點上的反G偏倚（2.7%）和A偏倚（42.8%）更明顯。斑鳠Cyt b基因序列存在15個變異位點（表2），變異位點數(shù)占總位點數(shù)（1122）的1.34%。其中，單一變異位點12個，簡約信息位點3個，未檢測到插入或缺失位點；轉(zhuǎn)換位點7個（C→T，2個；A→G，5個），顛換位點8個（C→G，4個；T→A，3個；T→G，1個），平均轉(zhuǎn)顛換比為0.86。變異位點數(shù)在密碼子第3位點上最多（9個），在第1和第2位點上分別有4和2個變異位點。

2. 2 都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因編碼氨基酸序列的變異情況

將都柳江鲇種群Cyt b基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)基于單倍型NHap2編碼的氨基酸序列共檢測到8個氨基酸變異位點。其中，由密碼子第1位點堿基突變引起的氨基酸變異位點有5個，分別是：第11位天冬酰胺突變?yōu)樘於彼幔ˋsn→Asp），第12位丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸（Ala→Thr），第93位纈氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔╒al→Ile），第253位脯氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Pro→Ser），第374位苯丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸（Phe→Val）。由密碼子第2位點堿基突變引起的氨基酸變異位點有3個，分別是：第19位脯氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚≒ro→Gln），第322位異亮氨酸突變?yōu)樘K氨酸（Ile→Thr），第343位纈氨酸突變?yōu)楸彼幔╒al→Ala）。由密碼子第1、2位堿基同時發(fā)生突變引起的氨基酸變異位點有1個，發(fā)生在第322位上，密碼子由ATC變?yōu)镚CC，引起異亮氨酸突變?yōu)楸彼幔↖le→Ala）。密碼子第3位點上的突變未引起氨基酸變異，屬同義突變。

在斑鳠Cyt b基因編碼的氨基酸序列中，基于單倍型BHap2編碼的氨基酸序列僅檢出了6個氨基酸變異位點。其中，由密碼子第1位點堿基突變引起的氨基酸變異位點有3個，分別是：第364位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸（Gly→Ser），第366位和第371位均為亮氨酸突變?yōu)槔i氨酸（Leu→Val）。由密碼子第2位點堿基突變引起的氨基酸變異位點有2個，為第17位丙氨酸突變?yōu)楦拾彼幔ˋla→Gly）和第64位半胱氨酸突變?yōu)槔野彼幔–ys→Tyr）。由密碼子第3位點堿基突變引起的氨基酸變異僅1個，即第356位苯丙氨酸突變?yōu)榱涟彼幔≒he→Leu）。

2. 3 都柳江鲇、斑鳠種群的遺傳多樣性

由表4可看出，都柳江鲇種群的各項遺傳多樣性參數(shù)均高于斑鳠種群，表現(xiàn)出相對較豐富的遺傳多樣性。鲇種群11個單倍型間的遺傳距離為0.0009～ 0.0322，平均遺傳距離為0.0163。斑鳠10個單倍型間的遺傳距離為0.0009～0.0081，平均遺傳距離為0.0030。可見，斑鳠種群個體間的遺傳分化程度較鲇種群低。

根據(jù)遺傳距離構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹顯示，都柳江鲇11個單倍型可分為兩大分支（Gp1和Gp2）。其中，Gp2包括8個單倍型，代表34個個體，為優(yōu)勢分支，包含由NHap1、NHap3、NHap4聚成的小分支和由NHap2、NHap6、NHap9、NHap10、NHap11聚成的小分支；Gp1由3個單倍型組成，代表5個個體（圖1）。斑鳠的10個單倍型也分為兩大分支，其中一個分支由9個單倍型（BHap1～BHap8和BHap10）組成，代表38個個體，為優(yōu)勢分支；另一分支僅有1個單倍型（BHap9），代表1個個體（圖2）。

2. 4 都柳江鲇、斑鳠種群的Tajimas D中性檢驗結(jié)果

Tajimas D中性檢驗結(jié)果表明，都柳江鲇種群Tajimas D為-0.25965，未達顯著水平（P>0.05）；都柳江斑鳠種群Tajimas D為-2.18396，達極顯著水平（P<0.01）。

3 討論

Avise（2000）認為4種核苷酸在基因組中分布不均一是動物線粒體基因組的共性。都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因的1122 bp序列堿基組成相似，即4種堿基平均含量均存在差異，且A+T的平均含量高于G+C的平均含量，以G含量最低，符合鲇形目魚類Cyt b基因堿基組成的特點（彭作剛等，2005；徐丹丹，2013）。Cyt b基因為蛋白質(zhì)編碼基因，其基因序列可通過密碼子轉(zhuǎn)譯為蛋白質(zhì)氨基酸序列。本研究發(fā)現(xiàn)，在都柳江鲇、斑鳠Cyt b基因中，4種堿基在密碼子第1、2位點上的出現(xiàn)頻率相似，但在密碼子第3位點上，除了均存在反G偏倚外，鲇Cyt b基因存在明顯的A（38.5%）和C（38.2%）偏倚，斑鳠Cyt b基因則表現(xiàn)出更明顯的A偏倚（42.8%）。與之相似，竹莢魚Cyt b基因密碼子第3位點存在明顯的C偏倚和反G偏倚（牛素芳等，2011），滁州鯽Cyt b基因密碼子第3位點存在明顯的T偏倚和反G偏倚（胡玉婷等，2015）。但關于Cyt b基因密碼子第3位點上堿基出現(xiàn)頻率的種間差異究竟是源于功能需要還是自然選擇壓力尚無定論。

編碼蛋白質(zhì)的基因常因蛋白質(zhì)功能的需要和氨基酸三聯(lián)密碼子結(jié)構(gòu)的限制，插入/缺失很少發(fā)生或發(fā)生后很容易被自然選擇所淘汰（單云晶等，2013）。本研究結(jié)果表明，都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因均未發(fā)現(xiàn)插入或缺失，其變異表現(xiàn)為堿基替換，且多發(fā)生在密碼子第3位點上，密碼子第1、2位點變異較少；但Cyt b基因核苷酸序列結(jié)合其編碼氨基酸序列分析結(jié)果顯示，都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因編碼氨基酸的變異主要源于其密碼子第1、2位點上的堿基變異，而密碼子第3位點上的堿基替換僅導致氨基酸序列中的1個位點氨基酸發(fā)生變異。說明都柳江鲇、斑鳠種群Cyt b基因密碼子第1、2位點變異率雖然較低，但其變異常導致其編碼蛋白質(zhì)的氨基酸變異；密碼子第3位點由于受自然選擇的壓力較小，其變異率較高，但多為同義突變，與張艷云等（2011）對閉殼龜類的研究結(jié)果一致。

衡量物種種群遺傳多樣性的兩個重要指標是單倍型多樣性和核苷酸多樣性，其中核苷酸多樣性比單倍型多樣性更可靠，主要是因為前者考慮了各種mtDNA單倍型在種群中的比例（李玉芳等，2014）。本研究中，都柳江鲇種群單倍型多樣性指數(shù)、核苷酸多樣性指數(shù)均高于斑鳠種群，說明都柳江鲇種群的遺傳多樣性較斑鳠種群更豐富。Grant和Bowen（1998）根據(jù)單倍型多樣性和核苷酸多樣性，將魚類種群分為4種類型：（1）較低的單倍型多樣性和低的核苷酸多樣性，表明種群近期發(fā)生了瓶頸效應或由單一、少數(shù)系群發(fā)生了奠基者效應；（2）較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，顯示種群經(jīng)歷瓶頸效應后發(fā)生了快速擴張，但累積的核苷酸突變尚少；（3）較低的單倍型多樣性和較高的核苷酸多樣性，意味著種群來源于兩個獨立的地理群體發(fā)生第二次接觸或由一個之前大而穩(wěn)定的種群發(fā)生了嚴重的瓶頸效應所致；（4）較高的單倍型多樣性和高的核苷酸多樣性，說明種群可能由一個大而穩(wěn)定的種群經(jīng)歷較長的歷史演化或由兩個不同系群發(fā)生二次接觸所致。本研究中，都柳江鲇種群具有較高的單倍型多樣性和核苷酸多樣性，屬于第4種類型，推測該種群由一個大而穩(wěn)定的種群演化所產(chǎn)生； 都柳江斑鳠種群具有較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性，符合第二種類型，表明該種群可能在經(jīng)歷瓶頸效應后發(fā)生了快速擴張，其單倍型多樣性快速增加但累積的核苷酸多樣性仍較低（Avise，2000）。

Tajimas D中性檢驗常用于推測種群曾經(jīng)過的歷史事件，當Tajimas D為負值且統(tǒng)計學上達顯著性水平時，表明該種群在過去經(jīng)歷了擴張事件，反之則群體大小趨于穩(wěn)定（Meyer and Wilson，1990）。本研究中，都柳江鲇種群Tajimas D為-0.25965，但未達顯著水平（P>0.05），表明該種群大小趨于穩(wěn)定；都柳江斑鳠種群Tajimas D為-2.18396且達極顯著水平（P<0.01），即都柳江斑鳠種群可能經(jīng)歷過種群擴張事件。

4 結(jié)論

都柳江鲇種群大小穩(wěn)定，具有較豐富的遺傳多樣性；都柳江斑鳠種群遺傳多樣性較匱乏，可能經(jīng)歷過瓶頸效應和種群擴張事件，急需開展種群保護和恢復工作。

致謝：感謝貴州大學動物科學學院動物分子生物學實驗室曾智勇教授對本研究中分子生物學實驗的指導和幫助。

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（責任編輯 蘭宗寶）