董亞茹 王照紅 杜建勛 陳傳杰 趙東曉

摘要：以矮牽牛‘漫波紅色無(wú)菌苗葉片為外植體，建立無(wú)菌再生體系，并在此基礎(chǔ)上建立其遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，誘導(dǎo)矮牽牛葉片分化的最佳培養(yǎng)基為Ms+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg/L NAA；最適出芽和生根的卡那霉素篩選壓分別為100 mg/L和20 mg/L；最適頭孢霉素抑菌濃度為200 mg/L。

關(guān)鍵詞：矮牽牛；漫波紅色；再生體系；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S681.603.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942（2016）03—0014—04

矮牽牛比較容易再生，組織與細(xì)胞操作技術(shù)簡(jiǎn)單，生活周期短，遺傳背景清晰，又是一種重要的園林花卉，因而其基因工程育種開展的較早，成為常見的轉(zhuǎn)基因花卉。并在植物基因工程育種、體細(xì)胞育種及單倍體育種方面均取得一定進(jìn)展，基因工程育種已創(chuàng)造出新的矮牽牛品種并加以應(yīng)用。國(guó)內(nèi)外對(duì)矮牽牛組織培養(yǎng)方面的研究已經(jīng)相當(dāng)深入，曾進(jìn)行過葉、莖、節(jié)間、葉肉原生質(zhì)體、花粉粒、根分生組織、莖分生組織、芽、花瓣等外植體類型的研究。常用作矮牽牛組織培養(yǎng)外植體的有種子、帶芽莖段、莖尖、葉片、花蕾、花瓣、花藥等。

利用生物技術(shù)手段改變觀賞植物的性狀，創(chuàng)造優(yōu)良新品種，是目前園林植物研究的一個(gè)熱點(diǎn)。本試驗(yàn)以矮牽?！t色為材料，建立其再生體系以及遺傳轉(zhuǎn)化體系，為下一步農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因研究做好準(zhǔn)備工作，也為其他觀賞植物的轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以矮牽?！t色無(wú)菌苗為材料，取生長(zhǎng)一致的無(wú)菌苗葉片做為外植體，接種在添加不同激素的MS基本培養(yǎng)基（附加蔗糖30g/L、瓊脂7.8g/L，pH 5.8～6.0）中，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照強(qiáng)度2 000～3 000 lX，光照時(shí)間16 h/d。

農(nóng)桿菌菌株：EHA105；質(zhì)粒：pROKⅡ，該表達(dá)載體含有NptⅡ基因，遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)可通過卡那霉素抗性篩選獲得轉(zhuǎn)基因植株。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1愈傷組織的誘導(dǎo)及芽的分化將無(wú)菌苗葉片切成5 mm×5 mm的方塊接種于添加不同濃度6-BA和不同濃度NAA的MS培養(yǎng)基上，遠(yuǎn)軸面朝下。6-BA的濃度設(shè)為0.5、1.0、1.5、2.0mg/L，NAA的濃度設(shè)為0.05、0.1、0.5 mg/L，做正交設(shè)計(jì)。每處理30個(gè)外植體，3次重復(fù)，10 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計(jì)葉片分化率及生長(zhǎng)情況，選擇最佳芽分化培養(yǎng)基。分化率（%）=分化外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100。

1.2.2生根培養(yǎng)切取生長(zhǎng)一致的無(wú)菌再生壯苗，將其接種在添加不同濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基上。NAA的濃度設(shè)為0、0.05、0.1、0.5、1.0mg/L，每處理30個(gè)外植體，重復(fù)3次，10 d繼代一次，30 d后統(tǒng)計(jì)生根率及再生不定根的生長(zhǎng)情況，選擇最佳生根培養(yǎng)基。生根率（%）=生根外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100。

1.2.3卡那霉素選擇壓的確定①卡那霉素對(duì)外植體分化的影響：取矮牽牛無(wú)菌苗葉片切成5mm×5 mm大小，分別接種于添加0、25、50、75、100、150 mg/L卡那霉素的MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)，每處理30個(gè)外植體，重復(fù)3次，10 d繼代一次，20 d后統(tǒng)計(jì)分

2.2生根培養(yǎng)

切取1.5 cm左右高的無(wú)菌再生苗接到添加不同濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基中，10 d左右時(shí)，化率。②卡那霉素對(duì)生根的影響：切取生長(zhǎng)一致的無(wú)菌再生壯苗，分別接種于添加0、5、10、15、20、30 mg/L卡那霉素的1/2MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，每處理30個(gè)外植體，3次重復(fù)，10 d繼代一次，20 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

1.2.4除菌劑頭孢霉素濃度的篩選 ①頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制情況：取適量農(nóng)桿菌EHA105菌液加入到含有不同濃度除菌劑的LB液體培養(yǎng)基中，設(shè)置0、100、200、300、400、500 mg/L頭孢霉素濃度梯度，28℃、180 r/min搖床暗培養(yǎng)48 h，測(cè)定OD值。②頭孢霉素對(duì)外植體分化的影響：將矮牽牛無(wú)菌葉片切成5 mm×5 mm大小，接種在分別添加0、100、200、300、400、500 mg/L頭孢霉素的MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上，每處理30個(gè)外植體，重復(fù)3次，10 d繼代一次，20 d后統(tǒng)計(jì)分化結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織的誘導(dǎo)及芽的分化

葉片接種5 d后，整體膨大，增厚，并發(fā)生卷曲（圖1）。一周后在葉片切口邊緣開始出現(xiàn)淺綠色的愈傷組織，葉脈處最為明顯。兩周后愈傷組織體積稍有變大，顏色變綠，在MS+0.5 mg/L6-BA+0.05 mg/L NAA培養(yǎng)基上最先有綠色芽點(diǎn)出現(xiàn)，主要集中在葉脈處。三周后大多數(shù)葉片變成黃色，同時(shí)一些芽體發(fā)育成幼苗。在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基上芽的分化率最高，達(dá)到86.7%，且芽簇生密集。在1/2MS+0.05 mg/L NAA和1/2MS+0.1 mg/LNAA培養(yǎng)基中最先有錐狀白色凸起。NAA在0～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)均能誘導(dǎo)生根，在不添加NAA的培養(yǎng)基中，生出大量的根，但根細(xì)、呈黃綠色，NAA濃度越高，生出的根越粗壯，但數(shù)量越來越少，且生根率達(dá)到一定值后出現(xiàn)下降。在

2.3卡那霉素選擇壓的確定

2.3.1卡那霉素對(duì)外植體分化的影響 卡那霉素在0～75 mg/L濃度范圍內(nèi)，外植體有愈傷組織產(chǎn)生，隨著濃度增加，葉盤的愈傷膨大率降低，分化出的芽數(shù)也逐漸減少，死亡率依次增加。當(dāng)卡那霉素濃度為75 mg/L時(shí)，外植體分化率為6.7%，而死亡率已達(dá)到63.3%；當(dāng)卡那霉素濃度為100～150 mg/L時(shí)，大部分葉片黃化死亡，分化率為零（圖3）。因此，將100 mg/L作為卡那霉素抑制假陽(yáng)性的臨界濃度。

2.3.2卡那霉素對(duì)生根的影響 在不添加卡那霉素的培養(yǎng)基中，再生苗植株生長(zhǎng)正常，生根率達(dá)100%；在5～15 mg/L范圍內(nèi)，隨著卡那霉素濃度的增加，生根率依次降低，且根系數(shù)量較不添加卡那霉素少，植株長(zhǎng)勢(shì)弱；當(dāng)卡那霉素濃度達(dá)到20mg/L時(shí)，生根率幾乎為零（圖4）。因此，在生根篩選時(shí)宜選擇卡那霉素濃度20 mg/L作為選擇壓。

2.4頭孢霉素濃度的篩選1/2MS+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中，生根率達(dá)100%，且根粗壯、數(shù)量多（圖2）。因此，1/2MS+0.1 mg/L NAA為矮牽牛生根的最適培養(yǎng)基。

2.4.1頭孢霉素對(duì)農(nóng)桿菌的抑制情況將農(nóng)桿菌菌液加入到含有不同濃度頭孢霉素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min暗培養(yǎng)48 h，菌的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制（圖5）。當(dāng)頭孢霉素濃度為100 mg/L時(shí)，農(nóng)桿菌繁殖受到一定抑制；當(dāng)頭孢霉素濃度為200～500 mg/L時(shí)，農(nóng)桿菌的OD值均小于0.5，且抑菌效果基本一致。考慮到高濃度的頭孢霉素會(huì)對(duì)外植體生長(zhǎng)造成一定影響，因此初步確定200 mg/L為最適的抑菌濃度。

2.4.2頭孢霉素對(duì)外植體分化的影響 在0～500 mg/L濃度范圍內(nèi)，隨著頭孢霉素濃度的升高，誘導(dǎo)出的愈傷組織量減少，外植體的分化率也逐漸降低（圖6），且分化出的芽生長(zhǎng)緩慢，葉片發(fā)黃。因此，在轉(zhuǎn)化過程中，在有效抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的前提下，頭孢霉素濃度應(yīng)采用一個(gè)較低值，以保證矮牽牛葉片能正常誘導(dǎo)分化。由于在200mg/L時(shí)頭孢霉素就能有效抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，所以在共培養(yǎng)結(jié)束后，第一次篩選時(shí)選用500 mg/L頭孢霉素，一周后，在后期培養(yǎng)中選用200 mg/L進(jìn)行抑菌篩選培養(yǎng)，既可抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)也不會(huì)影響外植體分化。3結(jié)論與討論

本研究以‘漫波紅色無(wú)菌植株葉片為外植體，成功建立了其無(wú)菌再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系。不同的矮牽牛品種其再生方式存在差異，馬方芳等的研究結(jié)果表明‘幻想矮牽牛在MS+2.0mg/L6-BA+2.0 mg/L NAA培養(yǎng)基中直接再生出芽率達(dá)94.7%，且無(wú)明顯愈傷。而本研究中‘漫波紅色在MS+2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA培養(yǎng)基中出芽率最高，且有大量愈傷產(chǎn)生，6-BA在0.5～2.0 mg/L范圍內(nèi)，濃度越高分化率越高，NAA濃度高于或者低于0.1 mg/L都不利于再生芽的產(chǎn)生。組織培養(yǎng)一般選用1/2MS培養(yǎng)基作為生根基礎(chǔ)培養(yǎng)基，再添加不同濃度的IBA或者NAA。張樹軍等在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L的NAA，幾乎都能誘導(dǎo)出根。馬瑛以0.1 mg/L的IBA作為生根激素，生根率也達(dá)到100%。本研究采用NAA作為生根激素，0.1 mg/L濃度下的生根率達(dá)100%，且植株生長(zhǎng)健壯。

有關(guān)矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化的研究也已有很多報(bào)道，但由于再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率的基因型依賴性強(qiáng)，故不同品種其研究結(jié)果也不同。卡那霉素為雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)常用的選擇標(biāo)記用抗生素，對(duì)植株再生有很大影響。本研究中，卡那霉素濃度為100 mg/L時(shí)才能完全抑制‘漫波紅色矮牽牛再生芽的產(chǎn)生，這與馮慧等的試驗(yàn)結(jié)果一致。劉南南等用潮霉素進(jìn)行敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10 mg/L的潮霉素就能完全抑制‘夢(mèng)幻系列矮牽牛葉片分化生長(zhǎng)。武術(shù)杰等用15mg/L卡那霉素便完全抑制了矮牽牛‘Tidal Wave品種再生芽的發(fā)生。本研究中，低濃度（20mg/L）的卡那霉素則可以抑制不定根的產(chǎn)生。司愛君等在矮牽牛的遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中采用30mg/L的卡那霉素進(jìn)行生根篩選，對(duì)照植株完全不能生根。頭孢霉素是植物遺傳轉(zhuǎn)化中常用的一種抑菌劑，其使用濃度以完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)而不影響外植體分化為宜。孫艷香等研究結(jié)果顯示，300 mg/L頭孢霉素為‘交響曲系列矮牽牛遺傳轉(zhuǎn)化適宜的抑菌劑。本試驗(yàn)中，200 mg/L頭孢霉素就有很好的抑菌效果，在0～500 mg/L范圍內(nèi)，頭孢霉素濃度對(duì)外植體出芽率的影響差異不大，因此選擇200 mg/L為適宜的抑菌濃度。