張強 李麗紅 要笑云 蔣璐瑤 王瑩 撖靜宜 曹山 李慧 陸海

摘要：【目的】對毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4進行原核表達及重組蛋白純化，為進一步研究該基因的酶學特征和生理功能打下基礎?！痉椒ā繌拿麠钪锌寺蓚€半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，構建其原核表達載體pET-30a-PtCP2及pET-30a-PtCP4，并在轉入大腸桿菌后在體外誘導表達重組蛋白，采用包涵體洗滌法對目的蛋白進行純化?！窘Y果】PtCP2基因CDS序列全長1107 bp，編碼368個氨基酸；PtCP4基因CDS序列全長1104 bp，編碼367個氨基酸。PtCP2和PtCP4基因編碼的蛋白均屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶。PtCP2和PtCP4基因在毛果楊根、莖、葉中均有表達，其中PtCP2在葉中表達量最高，PtCP4在根中表達量最高。通過包涵體洗滌法在體外得到了高表達量、單一的重組蛋白PtCP2和PtCP4，切除信號肽后蛋白酶大小分別為38.151和38.069 kD?！窘Y論】原核表達獲得的純化重組蛋白PtCP2和PtCP4可用于進一步研究毛果楊半胱氨酸蛋白酶的酶學特征和生理功能。

關鍵詞： 毛果楊；半胱氨酸蛋白酶；原核表達；蛋白純化；定量PCR

中圖分類號： Q785；Q786 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0511-08

0 引言

【研究意義】半胱氨酸蛋白酶（Cysteine protease）是植物體內一類十分龐大的蛋白酶家族，廣泛參與植物的各生理過程（Ahmad et al.，2014）。大量研究發(fā)現(xiàn)，植物各組織器官的衰老與半胱氨酸蛋白酶關系密切。木本植物的細胞程序性死亡（PCD）過程主要表現(xiàn)為木質部形成、葉衰老等，而毛果楊基因組已全部測序并公布，可作為木本植物研究中的模式生物，因此，深入研究毛果楊半胱胺酸蛋白酶PtCP2和PtCP4，對木材的利用和改良等具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】有研究表明，在干旱、低溫等非生物脅迫條件下，半胱氨酸蛋白酶基因的表達會明顯上升（Battelli et al.，2014）；在細胞衰老和細胞程序性死亡過程中，半胱氨酸蛋白酶也發(fā)揮著至關重要的作用（Zhang et al.，2014）。Wagstaff等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，萱草科植物中的半胱氨酸蛋白酶基因SEN11和SEN102均在花的衰老過程中表達，其中，SEN102基因在萱草屬的葉片衰老過程中呈下調表達，但在花的衰老過程中呈上調表達；在擬南芥葉片的衰老過程中，有8個半胱氨酸蛋白酶基因表達，其中最引人注目的是木瓜蛋白酶SAG12，被認為是衰老的標志性蛋白（Wan et al.，2002；McLellan et al.，2009）；與擬南芥RD19蛋白同源率較高的MsCyp15A則被發(fā)現(xiàn)在苜蓿葉片衰老進程中發(fā)揮十分重要的作用（Bernoux et al.，2008）。Mackey等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，RD19類基因主要編碼干旱誘導性半胱氨酸蛋白酶，青枯雷爾氏菌引發(fā)的干旱脅迫可以導致該基因轉錄水平明顯上升，但這類蛋白在干旱脅迫中的作用機理目前尚不明確；研究還發(fā)現(xiàn)RD19類蛋白的失活會導致感染植物中細菌大量繁殖。目前，已有很多半胱氨酸蛋白酶基因在體外表達且相應蛋白酶已成功進行純化。半滑舌鰨中的半胱氨酸蛋白酶基因CsCatB已成功進行原核表達并純化，且在35 ℃和pH 5.5條件下獲得最大酶活性（Chen and Sun，2012）；另外，Nandana等（2014）成功將牛角瓜半胱氨酸蛋白酶基因Procerain B進行原核表達及純化，并在pH 4.0條件下成功體外激活?！颈狙芯壳腥朦c】目前，半胱胺酸蛋白酶在草本植物中研究比較透徹，但由于木本植物生長周期長于草本植物等原因，半胱氨酸蛋白酶在木本植物中的研究明顯滯后?！緮M解決的關鍵問題】以毛果楊為試驗材料，在體外大量表達毛果楊重組蛋白PtCP2和PtCP4的基礎上，探討重組蛋白的純化方法，建立一套合理有效的包涵體蛋白純化體系，為今后進一步研究該基因的生理功能打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試材料毛果楊（Populus trichocarpa Torr. & Gray）由北京林業(yè)大學生物化學與分子生物學實驗室提供。大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)DH5α和BL21及表達載體pET-30a由北京林業(yè)大學生物化學與分子生物學實驗室保存；克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司。Easyspin Plus植物RNA快速提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技公司；FastQuant RT Kit試劑盒購自Promega公司；質粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及SuperReal熒光定量預混試劑均購自天根生化科技（北京）有限公司；Ex Taq酶、T4 DNA連接酶、限制性內切酶等均購自TaKaRa公司；Taq 10 MasterMix購自北京奧賽博科技發(fā)展有限公司；引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、尿素、胃蛋白酶等購自Sigma公司。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 PtCP2和PtCP4基因的克隆與分析 按照艾德萊公司的植物全RNA提取試劑盒操作流程提取毛果楊葉片RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。將提取的RNA按照Promega公司的RT-PCR試劑盒操作說明進行反轉錄得到cDNA。通過在毛果楊數(shù)據(jù)庫JGI上檢索獲得半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，根據(jù)基因序列，運用Primer 5.0軟件分別設計特異性引物PtCP2（上游引物：5'-ATGTCTCTCAACCTCTCTCTCTTTC-3'，下游引物：5'-CTAGAGGGAGTTGGTCTGCACG-3'）和PtCP4（上游引物：5'-GTCCAAACCATGGAACGCTTAC-3'，下游引物：5'-CACAGCAATCTACTGGGCAG-3'），以反轉錄所得cDNA為模板進行特定目的片段PCR擴增。反應體系（25.0 μL）：0.5 μL Ex Taq酶，2.5 μL 10×Ex Taq Buffer，2.5 μL dNTP，上下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 15.5 μL。擴增程序： 95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

將PCR產物按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明進行回收，將回收產物與pMD18-T載體進行連接并轉化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)挑菌后進行PCR初步鑒定，將陽性克隆送至北京六合華大基因公司測序。對克隆得到的毛果楊PtCP2和PtCP4基因進行生物信息學分析：使用SignalP 3.0軟件對PtCP2和PtCP4基因的信號肽序列進行預測；使用ExPASy軟件對PtCP2和PtCP4基因編碼的蛋白酶PtCP2和PtCP4的等電點、分子量等要素進行分析預測；使用MEGA 5.1軟件對蛋白酶PtCP2和PtCP4進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建；使用BioEdit軟件將蛋白酶PtCP2和PtCP4與已知RD19A類蛋白酶進行氨基酸序列比對。

1. 2. 2 PtCP2和PtCP4基因的組織表達分析 以毛果楊的根、莖、葉為試驗材料分別提取總RNA，通過反轉錄獲得cDNA。通過Primer 5.0軟件設計特異性引物PtCP2（上游引物：5'-CTTTAGCGTGGTGTCCCT-3'，下游引物：5'-CTCCTCCAATGTATGTTTGC-3'）和PtCP4（上游引物：5'-GGAACGCTTACCTCTGCT-3'，下游引物：5'-TGACACGACTTGCCTGAT-3'），以各部位cDNA為模板，按SuperReal熒光定量預混試劑盒操作流程分別對PtCP2和PtCP4基因進行熒光定量分析。反應體系（20.0 μL）：10.0 μL 2×SuperReal PreMix Plus，上、下游引物各0.5 μL，cDNA模板0.7 μL，ddH2O 8.3 μL。熒光定量PCR程序： 95 ℃預變性15 min； 95 ℃ 30 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，進行40個循環(huán)；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，然后以0.5 ℃/s的速度升至95 ℃，進行61個循環(huán)。每個根、莖、葉試驗組均設1個對照組，對照組采用與試驗組相同部位的cDNA為模板，以β-actin為內參基因進行特異性擴增，每組試驗重復3次以上。

1. 2. 3 PtCP2和PtCP4基因原核表達載體構建和表達 用限制性內切酶Kpn I和Xho I對毛果楊PtCP2、PtCP4基因和原核表達載體pET-30a同時進行雙酶切，將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的產物，使用T4 DNA連接酶進行體外連接，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)挑菌后提取質粒進行PCR擴增和雙酶切鑒定，獲得pET-30a-PtCP2和pET-30a-PtCP4表達載體。PCR鑒定體系（25.0 μL）：12.5 μL 2×Taq 10 MasterMix，上、下游引物各1.0 μL，質粒1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴增程序： 95 ℃預變性5 min； 95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，進行30個循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。雙酶切鑒定體系（20.0 μL）：2.0 μL 10×M Buffer，Kpn I 1.0 μL，Xho I 1.0 μL，質粒16.0 μL。

將上述構建好的表達載體轉化至大腸桿菌BL21中，于37 ℃、200 r/min條件下在含有卡那霉素（50 mg/L）的LB中擴大培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6，加入經抽濾的IPTG溶液（終濃度為0.3 mmol/L），于28 ℃、140 r/min條件下誘導培養(yǎng)3 h。取1 mL菌液用SDS-PAGE檢測蛋白條帶，以相同培養(yǎng)條件下未加IPTG菌液為對照，檢測重組蛋白是否在體外表達。

1. 2. 4 重組蛋白PtCP2和PtCP4的純化 將獲得的誘導菌液在4 ℃、4000 r/min條件下離心10 min，收集菌體后用Tris緩沖液（300 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris、pH 8.0）重懸，超聲波破碎200次直至菌液澄清，于4 ℃、12000 r/min條件下離心30 min獲得含有目的蛋白的包涵體。對包涵體蛋白采用包涵體洗滌法進行純化，使用包涵體洗滌液（1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、0.5% Triton X-100、2 mmol/L β-巰基乙醇、2 mol/L 尿素、pH 8.0）將包涵體蛋白重懸，置于冰上后于水平搖床上搖動20 min，然后4 ℃、12000 r/min條件下離心20 min，棄去上清液，重復5次。用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液將最終獲得的包涵體蛋白重懸，超聲波破碎50次，4 ℃、12000 r/min條件下離心30 min，獲得含有重組蛋白的上清液，用SDS-PAGE檢測蛋白純度，考馬斯亮藍法測定蛋白濃度。

1. 2. 5 重組蛋白PtCP2和PtCP4的復性及酶原激活

測定上一步純化的重組蛋白濃度后，用含8 mol/L尿素的Tris緩沖液將蛋白濃度稀釋至100 ng/μL以下復性。將稀釋后的重組蛋白依次放入含6、4、2 mol/L尿素的復性液（含1 mmol/L EDTA、50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、1 mmol/L還原型谷胱甘肽、0.1 mmol/L氧化型谷胱甘肽）中，每個梯度低溫攪拌透析4 h，經2 mol/L尿素復性后將重組蛋白放入不含尿素的復性液中繼續(xù)低溫攪拌透析2 d，期間更換1次復性液，最后收集蛋白溶液。

用HAc-NaAc緩沖液（pH 4.0）對復性蛋白進行酸化，酸化環(huán)境為pH 4.5，反應時間分別為30 s、1 min、5 min、10 min、30 min、1 h、6 h、12 h、1 d和3 d，待酸化完成后加入1 mol/L NaOH中和反應體系，終止酸化反應。使用SDS-PAGE檢測酸化條帶，對照組為未酸化蛋白。另外，本研究采用組織蛋白酶B催化的方法進行酶原激活（Gogiel et al.，2012），在上述酸化體系中加入終濃度為10 μg/mL的組織蛋白酶B，以幫助酶原激活，按照上述時間梯度進行酸化，待酸化完成后，使用1 mol/L NaOH中和反應體系，終止酸化反應；使用SDS-PAGE檢測酸化條帶，對照組分別為未酸化蛋白和組織蛋白酶B。

2 結果與分析

2. 1 PtCP2和PtCP4基因克隆及蛋白序列分析

以毛果楊cDNA為模板，分別使用PtCP2和PtCP4特異性引物進行PCR克隆并測序。結果（圖1）顯示，PtCP2基因（JGI基因編號grail3.0001039901）全長1107 bp，編碼368個氨基酸，通過SignalP 3.0軟件預測該蛋白信號肽為21個氨基酸，去除信號肽后分子量為38.151 kD，理論等電點為6.11；PtCP4基因（JGI基因編號grail3.0002061802）全長1104 bp，編碼367個氨基酸，通過SignalP 3.0軟件預測該蛋白信號肽為20個氨基酸，去除信號肽后分子量為38.069 kD，理論等電點為6.44。選取木本棉體內的已知RD19A類蛋白酶KHG24064和KHG15062與PtCP2、PtCP4進行序列比對，結果（圖2）表明，PtCP2中的C160、H303、N330及PtCP4中的C159、H302、N329組成催化三聯(lián)體，其為木瓜蛋白酶的核心催化殘基。由于PtCP2和PtCP4蛋白結構域中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件組成花環(huán)狀結構，且蛋白酶結構域中VxNFS或VxNFT元件中有保守的PGS序列（NxS/T），因此可以推論PtCP2和PtCP4屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶。

2. 2 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

分別選擇來自木本棉（Gossypium arboreum）、大豆（Glycine soja）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）及菜豆（Phaseolus vulgaris）的RD19A類蛋白酶的物種和基因及分別來自木本棉、大豆、擬南芥、小球藻（Auxenoc-hlorella protothecoides）、桑樹（Morus notabilis）、玉米（Zea mays）及節(jié)節(jié)麥（Aegilops tauschii）的RD21A類蛋白酶的物種和基因，對毛果楊半胱氨酸蛋白酶PtCP2和PtCP4進行系統(tǒng)發(fā)育進化分析，結果（圖3）顯示，PtCP2與木本棉RD19A類蛋白KHG15253和KHG24064同源率較高，PtCP4則與木本棉RD19A類蛋白KHG15062同源率較高，此外，其所在的亞組還包括其他所有選取的RD19A類蛋白，由此可以看出PtCP2和PtCP4與其他物種的RD19A類蛋白親緣關系較近；而在與8類RD21A類蛋白的同源性比較中發(fā)現(xiàn)，PtCP2和PtCP4與其親緣關系相對較遠。

2. 3 PtCP2和PtCP4基因的組織表達特性分析

為研究PtCP2和PtCP4基因在不同組織器官的表達量，分別取毛果楊的根、莖、葉3個部位的材料提取總RNA，反轉錄后進行熒光定量PCR檢測，結果表明，PtCP2和PtCP4基因在毛果楊根、莖、葉中均有表達，但表達量存在差異，PtCP2基因在葉中的表達量最高，是內參基因β-actin表達量的3.180倍，根次之，莖中表達量最低（圖4-A）；PtCP4基因則在根中的表達量最高，為內參基因β-actin表達量的0.285倍，葉次之，莖中表達量最低（圖4-B）；PtCP2基因整體表達量明顯高于PtCP4基因。

2. 4 PtCP2和PtCP4基因原核表達載體的構建

由于PtCP2和PtCP4基因中包含信號肽序列，該序列不能在原核生物中表達，因此需要在構建原核表達載體時去除該部分序列。以已克隆得到的毛果楊PtCP2和PtCP4基因為模板，用特異性引物通過PCR擴增得到目的片段，大小約1044 bp，與預期結果一致（圖5）。將該片段回收，與pMD-18T連接，獲得陽性克隆并測序正確。

使用限制性內切酶Kpn I和Xho I分別對克隆載體pMD18-T-PtCP2和pMD18-T-PtCP4進行酶切獲得目的片段，與表達載體pET-30a連接，獲得重組質粒。重組質粒雙酶切電泳檢測結果（圖6）顯示，重組質粒經雙酶切后獲得長度約5400 bp的大片段和1000 bp的小片段，分別與表達載體pET-30a和目的片段大小相符。

2. 5 重組蛋白PtCP2和PtCP4的表達和純化

將重組質粒pET-30a-PtCP2和pET-30a-PtCP4轉化大腸桿菌BL21后體外誘導表達，所得蛋白為包涵體形式。采用包涵體洗滌法對目的蛋白進行純化，所得重組蛋白PtCP2和PtCP4去除信號肽后理論分子量大小分別為38.151和38.069 kD，與His-tag（5.3 kD）結合后，大小分別約為43.5和43.4 kD（圖7）。

2. 6 重組蛋白PtCP2和PtCP4的體外酶原激活結果

對酶原進行體外激活，結果顯示，在酸性條件下，酶原出現(xiàn)降解，且隨著酸化時間的延長酶原降解程度增加，在酸化達24 h后，酶原完全降解，但沒有新的成熟酶條帶產生；在組織蛋白酶B催化條件下，單位時間內酶原降解程度較酸性條件下有所增加，在16 h左右即可完全降解，但同樣沒有成熟酶條帶產生。表明這兩個蛋白酶不能在本研究酸性條件下完成酶原激活，也不能在組織蛋白酶B催化條件下完成酶原激活，可能需要其他蛋白酶參與其酶原激活過程。

3 討論

半胱氨酸蛋白酶主要分為木瓜蛋白酶（Papain）、豆類天冬氨酸蛋白內切酶（Legumain）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（Caspase）和鈣依賴半胱氨酸蛋白酶（Calpain）（Barrett and Rawlings，2001），其中木瓜蛋白酶是種類最多，研究最深入、最透徹的一類（Bar-Ziv et al.，2015）。木瓜蛋白酶家族成員均含有1個由保守氨基酸殘基組成的催化三聯(lián)體Cys25-His159-Asn175，這一結構也是木瓜蛋白酶家族的分類標志之一（閆龍鳳等，2005）。木瓜蛋白酶家族成員主要分為9類：RD21A-like、RD19A-like、CEP 1-like、XCP2-like、XBCP3-like、THIl-like、SAG12-like、AALP-like和CTB3-like（Ri-chau et al.，2012）。其中，RD19A-like在蛋白結構域中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件，蛋白酶結構域存在VxNFS或VxNFT元件且元件中存在保守的PGS序列（NxS/T）。RD19類蛋白酶家族與動物組織蛋白酶F相似，可以劃分為RD19A、RD19B和RD19C 3個亞家族（Babula-Skowrońska et al.，2015）。本研究成功克隆獲得毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，通過氨基酸序列分析表明PtCP2蛋白中的C160、H303、N330及PtCP4蛋白中的C159、H302、N329與木瓜蛋白酶保持一致，是證明其屬于木瓜蛋白酶家族的重要證據(jù)；另外，PtCP2和PtCP4蛋白結構中由ERFNAQ元件取代了ERFNIN元件，蛋白酶結構域中存在VxNFS或VxNFT元件且元件中有保守的PGS序列（NxS/T），這些都是PtCP2和PtCP4屬于RD19A-like類型木瓜蛋白酶的重要證據(jù)。

有研究表明擬南芥的RD系列基因與干旱脅迫和鹽脅迫等非生物脅迫有密切聯(lián)系（Yang et al.，2011），但對高溫和低溫等脅迫無響應。本研究通過系統(tǒng)進化樹構建和蛋白質序列比對分析，發(fā)現(xiàn)PtCP2、PtCP4和擬南芥AT4G39090基因編碼的RD19A蛋白同屬于RD19A亞家族且具有很高的同源性，由于同一亞家族的基因功能通常相似，因此推測毛果楊PtCP2和PtCP4基因與非生物脅迫相關。通過組織表達定量結果分析，本研究發(fā)現(xiàn)PtCP2和PtCP4基因表達存在明顯差異，推測這兩個基因具有不同的生物學功能。進一步檢索楊樹EST數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)這兩個基因均在干旱脅迫條件下大量表達，但表達時期和表達量存在顯著差異，表明這兩個基因可能在參與干旱脅迫應答的不同時期起作用，將是今后基因功能研究的重點方向。

木瓜蛋白酶的氨基酸序列從N端到C端按其功能可以劃分為3個區(qū)域：信號肽序列、前體肽序列和成熟酶序列（Wiederanders，2003）。信號肽作為引導新生蛋白質轉移的短肽鏈，在木瓜蛋白酶進入到內質網后即被切除，蛋白質則以一種前體酶的形式存在，不具備活性，前體肽序列則在酶發(fā)揮活性時被自動切除，形成具有活性的成熟酶（Riese and Chapman，2000；Martinez and Diaz，2008）。氨基酸序列分析結果表明，RD19類蛋白酶家族與動物組織蛋白酶F相似，但也有報道把組織蛋白酶F歸入組織蛋白酶L類（Wex et al.，2000）。有報道顯示與RD19A類蛋白相似度很高的組織蛋白酶L在弱酸性環(huán)境中易被活化（Fonseca et al.，2012），但新產生的成熟酶在堿性和中性環(huán)境中無法穩(wěn)定存在。因此，本研究選用pH 4.0～5.5作為酸化環(huán)境，同時在組織蛋白酶B催化條件下對酶原進行激活，但經酸化后始終無法獲得穩(wěn)定的成熟酶序列。分析原因，可能是RD19A類蛋白酶在進行前體肽切除后成熟酶無法在酸性環(huán)境下穩(wěn)定存在，需要自身體內異體蛋白酶的催化，有助于穩(wěn)定成熟酶的結構，這一部分工作將成為今后的研究重點。

本研究將PtCP2和PtCP4基因與原核表達載體pET-30a連接，在原核表達系統(tǒng)中成功誘導表達，采用包涵體洗滌法對目的蛋白進行純化即可獲得單一的目的蛋白。此外，本研究通過熒光定量PCR對PtCP2和PtCP4基因進行組織表達分析，初步分析了該基因可能的功能。為了更加透徹地研究PtCP2和PtCP4的生物學功能，下一步將構建這兩個基因的正義表達載體，轉化野生型擬南芥，并對轉基因擬南芥進行性狀分析，初步鑒定該基因在PCD過程中的作用，為進一步揭示PtCP2和PtCP4在毛果楊體內的功能提供參考。

4 結論

本研究克隆獲得了毛果楊半胱氨酸蛋白酶基因PtCP2和PtCP4，在大腸桿菌中成功誘導表達，并經包涵體洗滌法純化后獲得重組蛋白PtCP2和PtCP4，為進一步研究毛果楊半胱氨酸蛋白酶的酶學特征和生理功能打下基礎。

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（責任編輯 麻小燕）