吳朝興 蔣媛 王露蓉 顧彩彩 ?？∑? 孫波 李楊瑞 楊麗濤

摘要：【目的】通過原核表達(dá)及純化獲得甘蔗1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）的大、小亞基融合蛋白，為獲得符合抗體制備條件的高純度融合蛋白提供技術(shù)支持。【方法】以甘蔗品種桂糖11號（GT11）+1葉為材料，根據(jù)NCBI公布的甘蔗Rubisco大、小亞基基因（rbcL和rbcS）的編碼域序列（CDS）設(shè)計特異性引物，PCR擴(kuò)增rbcL和rbcS基因的CDS，然后連接至原核表達(dá)載體pET-30a（+），構(gòu)建重組質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞（大腸桿菌Rosetta）中誘導(dǎo)表達(dá)，用鎳親和層析柱對融合蛋白進(jìn)行純化，并比較分析桂糖11號與其他甘蔗品種在rbcL和rbcS基因的CDS及編碼蛋白序列方面的差異?！窘Y(jié)果】rbcL和rbcS基因的CDS長度分別為1431和510 bp，其中桂糖11號rbcL基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar SP80-3280（GenBank登錄號AE009947）、Saccharum hybrid cultivar Q155（GenBank登錄號KU214867）的一致，桂糖11號rbcS基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar GT28（GenBank登錄號JN591757）的存在7個堿基差異，但僅有2個氨基酸發(fā)生錯義突變。RbcL和RbcS融合蛋白以包涵體形式存在原核細(xì)胞中，用鎳離子親和層析純化及超濾濃縮后其濃度均在1.0 mg/mL以上?！窘Y(jié)論】從桂糖11號成功克隆Rubisco大亞基和小亞基基因的CDS，大亞基基因的CDS比小亞基的保守性更高，且均可在原核細(xì)胞中高度表達(dá)，經(jīng)純化濃縮獲得的高純度融合蛋白可用于制備Rubisco單克隆抗體。

關(guān)鍵詞： 甘蔗；1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）；克??；原核表達(dá)；融合蛋白；純化

中圖分類號： S566.1；Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）04-0524-06

0 引言

【研究意義】甘蔗是我國第一大糖料作物，蔗糖產(chǎn)量占全國食糖產(chǎn)量的90%以上（李楊瑞和楊麗濤，2009；Li and Yang，2015），也是重要的能源和飼料作物。光合作用是綠色植物生長發(fā)育所需能量的來源，也是異養(yǎng)生物所需碳源的最終來源。在綠色植物中，光合作用發(fā)生在葉綠體中，而1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）參與催化光合碳同化的第一步反應(yīng)，是光合作用中決定碳同化速率的關(guān)鍵酶。因此，克隆甘蔗Rubisco基因并制備Rubisco單克隆抗體對甘蔗光合機(jī)理研究，尤其是Rubisco特性研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Wildman和Bonner在1947年發(fā)現(xiàn)了Rubisco，當(dāng)時命名為部分I蛋白，并于1965年從菠菜中提純該酶，發(fā)現(xiàn)其具有催化CO2和RuBP形成PGA的能力（李鳳玲和吳光耀，1996）。高等植物的Rubisco是由8個大亞基（50～60 kD）和8個小亞基（12～18 kD）組成的16聚體蛋白（L8S8）（Andersson and Backlund，2008），其三維結(jié)構(gòu)也已明確（Andersson et al.，1989），其中，大亞基由葉綠體基因組編碼，基因呈連續(xù)性，在葉綠體中轉(zhuǎn)錄翻譯；小亞基則由核基因組編碼，有內(nèi)含子，在細(xì)胞質(zhì)中合成（Yamazaki et al.，2005）。一個葉綠體DNA（Chloroplast DNA，ctDNA）中只有一個Rubisco大亞基基因（rbcL），但其核基因組中有多個Rubisco小亞基基因（rbcS）家族（Sasanuma，2001）。近年來，人們對不同物種的Rubisco基因進(jìn)行了多方面研究。Bedbrook等（1980）克隆獲得豌豆的rbcS基因并進(jìn)行了測序分析；曹凱鳴等（1996）克隆獲得野生大豆的rbcS基因并進(jìn)行序列分析；賀超英等（2001）克隆了大豆rbcS基因并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析；Thomas-Hall等（2007）克隆了香蕉rbcS基因并對其分子結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)行分析；崔喜艷等（2014）克隆了大豆rbcS基因全長cDNA并成功進(jìn)行原核表達(dá)。此外，多種植物的葉綠體基因組測序已完成，且被廣泛應(yīng)用在進(jìn)化研究中（黃瑤和馬誠，1994）。Coen等（1977）從玉米葉片葉綠體中克隆得到rbcL基因并證明大亞基是由葉綠體基因組所編碼；Valentin和Zetsche（1989）從紅藻質(zhì)體基因組庫中篩選出rbcL基因并完成測序；劉曉慶等（2011）成功克隆大豆rbcL基因并成功進(jìn)行原核表達(dá)?！颈狙芯壳腥朦c】雖然Rubisco免疫印跡（Western blotting）的相關(guān)研究很多，但商業(yè)化的Rubisco單克隆抗體較少，且國內(nèi)鮮見針對甘蔗Rubisco的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以甘蔗品種桂糖11號（GT11）DNA或RNA為模板克隆Rubisco大、小亞基的編碼區(qū)序列（CDS）全長，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，通過鎳親和層析柱純化獲得融合蛋白，為研究甘蔗Rubisco基因及制備單克隆抗體提供參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

桂糖11號于2014年6月20日采自廣西大學(xué)甘蔗實驗田。大腸桿菌DH5α和Rosetta菌株由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室生物質(zhì)能源實驗室提供，pET-30a（+）表達(dá)載體由廣西甘蔗遺傳改良重點實驗室保存，內(nèi)切酶和T4連接酶購自美國Thermo Scientific公司，同源連接試劑盒ClonExpress MultiS購自南京諾唯贊生物科技有限公司，質(zhì)粒提取試劑盒BioSpin Plasmid DNA Extraction Kit、PCR純化試劑盒BioSpin PCR Purification Kit和膠回收試劑盒BioSpin Gel Extraction Kit購自日本BioFlux公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit、DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA合成酶和Ex Taq購自寶生物工程（大連）有限公司，TRIzon總RNA提取試劑購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，鎳填充物Ni Sepharose Excel購自美國GE公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀（美國AB公司），TProfessional Thermocycler PCR儀（德國Biometra公司），NanoPhotometerTM P- Class微量分光光度計（德國IMPLEN公司），Amicon Ultra-15 10K超濾管（德國Millipore公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 DNA和RNA的提取 采集桂糖11號宿根蔗+1葉，利用改進(jìn)的SDS法提取甘蔗葉片總DNA（黃東亮等，2010），參照TRIzol總RNA提取試劑說明提取葉片總RNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的總DNA和RNA，以NanoPhotometerTM P-Class測定總RNA濃度及純度。

1. 2. 2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 參照PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明，以總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1. 2. 3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI已公布甘蔗Rubisco rbcL基因的CDS（GenBank登錄號AE009947）和rbcS基因的CDS（GenBank登錄號JN591757），應(yīng)用Vector NTI 10軟件分別設(shè)計rbcL和rbcS基因特異引物，并在引物中插入酶切位點（下劃線處）（表1）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 2. 4 目的基因擴(kuò)增 rbcS基因的CDS PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×Ex Taq Buffer 5.0 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4.0 μL，上下游引物（10.0 μmol/L）各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，Ex Taq 1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物于10 ℃下保存，并取4.0 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。rbcL基因的CDS PCR反應(yīng)體系50.0 μL：5×PrimeSTAR Buffer 10.0 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4.0 μL，上下游引物（10 μmol/ L）各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，PrimeSTAR HS DNA合成酶1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性5 min；98 ℃ 10 s，55 ℃ 15 s，72 ℃ 2 min，進(jìn)行30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。RCR產(chǎn)物于10 ℃下保存，并取2.0 μL用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)膠回收后抽真空濃縮，-20 ℃保存。

1. 2. 5 大腸桿菌感受態(tài)的制備 首先加入30 mL預(yù)冷的0.10 mol/L MgCl2-CaCl2溶液（含0.08 mol/L MgCl2和0.02 mol/L CaCl2，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌），將大腸桿菌DH5α菌體重新懸浮，冰浴25 min后4 ℃ 4000 r/min離心10 min，棄上清液，然后將以上步驟重復(fù)一次，再將菌體懸浮于4 mL預(yù)冷的0.10 mol/L CaCl2和10%甘油的溶液中，分裝于EP管中，每個EP管100.00 μL，液氮速凍后于-80 ℃保存（謝翎等，2011）。

1. 2. 6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 用Kpn Ι和EcoR I于37 ℃下雙酶切rbcS基因和pET-30a（+）表達(dá)載體3 h，用EcoR V于37 ℃下酶切rbcL基因和pET-30a（+）表達(dá)載體3 h，用PCR純化試劑盒分別對其酶切產(chǎn)物進(jìn)行純化，并用T4連接酶16 ℃連接3 h，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中，涂到含卡那霉素的LA培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，通過重組質(zhì)粒驗證，篩選出陽性菌株，送至深圳華大基因研究院測序。

1. 2. 7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達(dá) 分別將pET-30a（+）和陽性重組質(zhì)粒pET-30a-rbcS、pET-30a-rbcL轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta中，挑取陽性菌落置于含卡那霉素和氯霉素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)OD600為0.6～0.8時加入終濃度為1.0 mmol/L的IPTG，28 ℃下150 r/min搖床培養(yǎng)過夜。收集菌體后菌體沉淀用Lysis Buffer（pH 8.0，NaH2PO4 50 mmol/L，NaCl 300.0 mmol/L，咪唑10.0 mmol/L）重懸菌體后置于冰水浴中超聲波裂解，離心后分別收集裂解上清液和沉淀，最后用12.5% SDS-PAGE進(jìn)行檢測。

1. 2. 8 蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定 取SDS-PAGE中的目的條帶送至亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點實驗室，用MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

1. 2. 9 融合蛋白的純化 取誘導(dǎo)表達(dá)后的重組菌，在冰浴中超聲波裂解，離心后收集沉淀，先用4.0 mol/L尿素洗滌沉淀，離心后棄上清液，再用8.0 mol/L鹽酸胍溶解沉淀，收集上清液；利用鎳親和層析柱純化上清液中的目的蛋白，每次上樣量約15 mg蛋白，按每2.0 mL為1管收集洗脫液（洗滌和洗脫用的咪唑溶液配制除咪唑濃度不同外，其他組分均與Lysis Buffer相同），用SDS-PAGE檢測融合蛋白，最后用Amicon Ultra-15 10K（Millipore）超濾管濃縮，SDS- PAGE檢測目的蛋白純度。

2 結(jié)果與分析

2. 1 目的基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以cDNA和總DNA為模板，用所設(shè)計的引物對rbcS和rbcL基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖1所示，rbcS和rbcL基因條帶與預(yù)期結(jié)果（510和1431 bp）相符。

2. 2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

將rbcL和rbcS基因分別和pET-30a（+）載體連接，其連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)含卡那霉素LA培養(yǎng)基的抗性篩選，獲得轉(zhuǎn)化子，提取其質(zhì)粒，用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖2）表明，目的基因已連接至pET-30a（+）載體，成功獲得重組質(zhì)粒pET-30a-rbcL和pET-30a-rbcS。

2. 3 目的基因CDS分析

測序結(jié)果表明，已獲得rbcS和rbcL基因CDS，且在重組質(zhì)粒上插入的位置讀碼框與載體讀碼框一致。其中，rbcS基因的CDS長度為510 bp，編碼169個氨基酸，相對分子量為19.105 kD，等電點為8.78；rbcL基因的CDS長度為1431 bp，編碼476個氨基酸，相對分子量為52.729 kD，等電點為6.33。經(jīng)BLAST序列比對分析，發(fā)現(xiàn)桂糖11號rbcS基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar GT28（GenBank登錄號JN591757）的存在7個堿基差異（圖3），分別為39T→C、76T→C、78A→C、126C→A、153T→G、282G→C和314G→A，但編碼的氨基酸序列中僅有2個氨基酸發(fā)生錯義突變，分別為26Ser→Pro和105Cys→Tyr，其他5個堿基突變均為同義突變。桂糖11號rbcL基因的CDS核苷酸序列與Saccharum hybrid cultivar SP-80-3280（GenBank登錄號AE009947）、Saccharum hybrid cultivar Q155（GenBank登錄號KU-214867）的一致。

2. 4 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)及質(zhì)譜鑒定

重組菌pET-30a-rbcS/Rosetta和pET-30a-rbcL/Ros-etta誘導(dǎo)表達(dá)獲得目的蛋白，經(jīng)超聲波裂解后進(jìn)行SDS-PAGE檢測。結(jié)果如圖4所示，rbcS和rbcL基因均在原核細(xì)胞中表達(dá)，且以包涵體的形式存在，蛋白質(zhì)條帶大小約15.0和52.0 kD，與預(yù)期結(jié)果相符，且蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定結(jié)果也表明，蛋白條帶分別為Rubisco小亞基和大亞基蛋白。

2. 5 RbcS和RbcL融合蛋白的純化及濃縮

對鎳親和層析（重力柱）純化體系不斷優(yōu)化，最終獲得較好的純化效果，洗脫下來的小亞基和大亞基的純度和質(zhì)量均能滿足制備抗體要求，超濾濃縮后濃度均在1.0 mg/mL以上（圖5）。

3 討論

本研究從甘蔗品種桂糖11號的+1葉中成功克隆Rubisco的rbcS和rbcL基因CDS，rbcS基因的CDS長度為510 bp，rbcL基因的CDS長度為1431 bp，其長度與NCBI上其他甘蔗品種一致，其中rbcL基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar SP-80-3280和Q155的一致，但桂糖11號rbcS基因的CDS與Saccharum hybrid cultivar GT28的存在7個堿基差異，分別為39T→C、76T→C、78A→C、126C→A、153T→G、282G→C和314G→A，而編碼的氨基酸序列中有2個氨基酸發(fā)生錯義突變，分別為26Ser→Pro和105Cys→Tyr。這與前人的相關(guān)研究結(jié)果（Gontcharov et al.，2004）相似，進(jìn)一步證明了大亞基基因序列在進(jìn)化中高度保守，而核基因組編碼的小亞基保守性較差，且存在多個rbcS基因家族，可用于種間系統(tǒng)發(fā)育分析（Sasanuma，2001；Thomas-Hall et al.，2007）。在表達(dá)水平方面，大亞基和小亞基也存在差異，如魚腥藻的Rubisco大亞基表達(dá)量遠(yuǎn)高于小亞基表達(dá)量，且多余的大亞基以不可溶的狀態(tài)存在，只有大亞基和小亞基形成完整且有活性的Rubisco時才可溶（Gurevitz et al.，1985）。本研究原核表達(dá)的RbcS和RbcL融合蛋白也均以包涵體形式存在，可推測即使換用更利于融合蛋白可溶性表達(dá)的載體及優(yōu)化表達(dá)條件也無法實現(xiàn)可溶性表達(dá)。

本研究融合蛋白純化效果很好，超濾濃縮后測定其濃度均在1.0 mg/mL以上，且純化蛋白的總量在4.0 mg以上，蛋白質(zhì)總量和純度均滿足制備單克隆抗體的要求，可用于其單克隆抗體制備與研究。由于單克隆抗體具有特異性強(qiáng)、便于人為控制的特點，因此制備Rubisco單克隆抗體有助于甘蔗Rubisco定量分析及其形態(tài)學(xué)分布觀察研究。

4 結(jié)論

本研究從桂糖11號成功克隆Rubisco大、小亞基基因CDS，大亞基的CDS比其小亞基的保守性更高，均可在原核細(xì)胞中高度表達(dá)，經(jīng)純化濃縮可獲得的高純度融合蛋白可用于制備Rubisco單克隆抗體，有助于甘蔗Rubisco定量分析及其形態(tài)學(xué)分布觀察研究。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）