謝木嬌 區(qū)又君 溫久福 李加兒 周慧 王鵬飛 劉奇奇

摘要：【目的】研究四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律，為指導(dǎo)四指馬鲅育苗過程中適時更換餌料及制定投餌策略、完善育苗工藝和提高育苗成活率提供參考依據(jù)?！痉椒ā坷媒M織石蠟切片和阿利新蘭—高碘酸雪夫試劑（AB-PAS）染色，觀察研究1～30日齡四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)生過程?！窘Y(jié)果】四指馬鲅的食道最早在5日齡時出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞；9日齡仔魚食道黏液細(xì)胞數(shù)量有所增加，胃部已有賁門部、幽門部、胃體部和盲囊部的明顯區(qū)域分化，黏膜皺褶豐富，各區(qū)域大部分的黏膜表面均有I型黏液細(xì)胞分布；15日齡仔魚胃腺區(qū)域出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，腸道前、中、后段均出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，且以圓形為主；17日齡仔魚幽門盲囊區(qū)域出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞；23和30日齡仔魚消化道黏液細(xì)胞以II型為主，數(shù)量持續(xù)增加。四指馬鲅消化道各段黏液細(xì)胞密度、大小及分泌能力均隨日齡的增加而增加，且同日齡仔魚消化道中以食道的黏液分泌能力最強。【結(jié)論】四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞的發(fā)生和分布特征與仔魚攝食能力日益增強及消化道結(jié)構(gòu)逐漸完善的趨勢相適應(yīng)。

關(guān)鍵詞： 四指馬鲅；消化道；黏液細(xì)胞；發(fā)生；分布；開口攝食

中圖分類號： S965.329 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）07-1222-06

0 引言

【研究意義】四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）隸屬于鯔形目（Mugiliformes）馬鲅亞目（Polynemoidei）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）（孫典榮和陳錚，2013），廣泛分布于熱帶和溫帶的砂石底海區(qū)，如澳大利亞東西海岸、美國夏威夷海域、印度尼西亞海域等（Zischke et al.，2009；Moore et al.，2011；Newman et al.，2011；Ballagh et al.，2012），我國的黃海、渤海、東海和南海也有分布（Wang et al.，2014），目前在我國臺灣、廣東、海南、浙江等地已有人工養(yǎng)殖。黏液細(xì)胞隨著機體的生長發(fā)育，其成分、形態(tài)和分布均會發(fā)生明顯變化，可作為檢測消化道功能發(fā)育的一項參考依據(jù)（謝木嬌等，2015），而消化道的結(jié)構(gòu)發(fā)育與功能完善又直接影響仔稚魚對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用及其成活率，因此，研究觀察魚類消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律對揭示仔稚魚消化道的變化規(guī)律及苗種培育具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黏液細(xì)胞分泌的黏液物質(zhì)包含水解酶、糖蛋白、免疫蛋白、黏多糖等多種活性物質(zhì)，進(jìn)而形成協(xié)調(diào)機體內(nèi)外環(huán)境平衡的黏液屏障（Khojasteh et al.，2009），在潤滑食物、協(xié)助消化吸收、抗菌、抗病毒及離子轉(zhuǎn)運方面發(fā)揮作用（Sarasquete et al.，2009）。近年來，已有關(guān)于不同魚種消化道黏液細(xì)胞發(fā)育的研究報道，如波紋唇魚（Cheilinus undulates）（王永波等，2010）、點帶石斑魚（Epinephelus malabaricus）（李鑫煒等，2012）、哲羅魚（Hucho taimen）（關(guān)海紅和尹家勝，2013）、泥鰍（Misgurnus anguillicaudatus）（張建業(yè)等，2014）等。李鑫煒等（2012）研究表明，點帶石斑魚黏液細(xì)胞出現(xiàn)的日齡與開口攝食日齡一致，即黏液細(xì)胞的存在可能是仔稚魚開口攝食的前提。關(guān)海紅和尹家勝（2013）研究發(fā)現(xiàn)，哲羅魚黏液細(xì)胞發(fā)生的部位分別是口咽腔、消化道，黏液細(xì)胞開始為囊狀，隨后發(fā)育成梨狀，最終發(fā)育為杯狀。張建業(yè)等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍仔魚3日齡時口腔、食道出現(xiàn)黏液細(xì)胞，7日齡時消化道開始出現(xiàn)黏液細(xì)胞，且黏液細(xì)胞的類型按幼稚型到成熟型的規(guī)律發(fā)生，并認(rèn)為3～10日齡是泥鰍仔魚消化道發(fā)育的敏感期，20日齡左右消化道功能發(fā)育逐漸完善?！颈狙芯壳腥朦c】除本課題組研究報道過四指馬鲅稚魚、幼魚和成魚消化道黏液細(xì)胞的組織化學(xué)（謝木嬌等，2015）外，至今未見有關(guān)四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞發(fā)育的研究報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】針對仔魚在培育過程中呈現(xiàn)生長迅速的特點，從功能細(xì)胞角度分析四指馬鲅仔魚消化機能的發(fā)育規(guī)律，為指導(dǎo)其育苗過程中適時更換餌料及制定投飼策略、完善育苗工藝和提高育苗成活率提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 苗種來源

四指馬鲅受精卵和初孵仔魚由本課題組在南海水產(chǎn)研究所珠海試驗基地培育獲得。仔魚先在室內(nèi)水泥池培育7 d后轉(zhuǎn)移到室外土池繼續(xù)培育，各階段培育條件：水溫29～32 ℃，鹽度25‰～28‰，溶氧4.80～5.50 mg/L，pH 8.00～8.30，氨氮含量0.20～0.40 mg/L，亞硝酸鹽含量0.005～0.015 mg/L。培育過程中仔魚餌料系列為輪蟲、小球藻、枝角類（2～15日齡）→鹵蟲無節(jié)幼體和部分紅蟲（16～30日齡）→粉狀配合飼料和魚肉糜或貝肉糜（31～50日齡）。孵化后第1 d的仔魚為1日齡，以此類推，培育過程中對1～30日齡的魚苗進(jìn)行連續(xù)采樣，每次取樣20尾用10%中性甲醛固定，期間定期更換固定液以延長樣品的保存時間。

1. 2 樣品處理及分析方法

采集樣品中每個日齡段的仔魚取10尾進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作，切片用阿利新蘭—高碘酸雪夫試劑（AB-PAS）進(jìn)行染色（AB-PAS試劑盒購自南京森貝伽生物科技有限公司），具體染色步驟參照試劑盒說明進(jìn)行操作，在顯微鏡下觀察拍照。根據(jù)AB-PAS顯色結(jié)果將黏液細(xì)胞分為I型、II型、III型和IV型，分別呈紅色（含PAS陽性的中性黏多糖）、藍(lán)色（含AB陽性的酸性黏多糖）、紫紅色（主要含PAS陽性的中性黏多糖，同時含少量AB陽性的酸性黏多糖）和藍(lán)紫色（主要含AB陽性的酸性黏多糖，同時含少量PAS陽性的中性黏多糖）。同時參照王永波等（2010）的方法統(tǒng)計消化道各段各類型黏液細(xì)胞的密度、細(xì)胞長短徑及消化道各段的分泌能力[單位面積黏液細(xì)胞密度與細(xì)胞表面積（π×長徑×短徑/4）的乘積]，其中細(xì)胞密度統(tǒng)計樣本為消化道各段取3張相鄰切片隨機選10個視野，分別測量每個視野中1 mm2范圍內(nèi)各類型黏液細(xì)胞的總數(shù)，同時測量黏液細(xì)胞（n=10）的長徑和短徑。試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和Duncans多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黏液細(xì)胞的發(fā)生過程

1～4日齡四指馬鲅仔魚消化道由簡單的直線管發(fā)育到基本與外界連通狀態(tài)，包括食道、胃部和腸道基礎(chǔ)的分化，但黏膜上皮間未見有黏液細(xì)胞分布。5日齡仔魚食道形成1～2個黏膜皺褶，上皮基底層和中間層出現(xiàn)少量II型黏液細(xì)胞，均為圓形且被染成深藍(lán)色的細(xì)胞，胞質(zhì)均勻（圖1-1）；胃腸黏膜皺褶增多變扁平，其黏膜邊緣呈淡藍(lán)色，但仍未見有黏液細(xì)胞分布。9日齡仔魚食道黏液細(xì)胞仍是圓形的II型黏液細(xì)胞（圖1-2）；胃部呈Y形，賁門部、幽門部、胃體部和盲囊部呈明顯的區(qū)域分化，黏膜皺褶豐富，各區(qū)域大部分的黏膜表面被染成淺紅色，為含中性黏多糖的I型黏液細(xì)胞；腸道仍無前、中、后腸的分化，上皮間未見黏液細(xì)胞。15日齡仔魚胃部以I型黏液細(xì)胞為主，但在有胃腺分布的區(qū)域（除幽門部外）分布有藍(lán)色的II型黏液細(xì)胞（圖1-3），腸道前、中、后段也出現(xiàn)藍(lán)色的II型黏液細(xì)胞，且以圓形為主（圖1-4和圖1-5）。17日齡仔魚食道上皮分布有大量的II型黏液細(xì)胞，復(fù)層上皮因黏液細(xì)胞密集而被染成深藍(lán)色，部分細(xì)胞染色較淺呈空泡狀（圖1-6），胃部胃腺區(qū)域的II型黏液細(xì)胞數(shù)量增多，黏膜表層檢測出藍(lán)色（II型）和紅色（I型）交替的黏液細(xì)胞線，幽門盲囊區(qū)域形成4～6個管腔，均可檢測出II型黏液細(xì)胞（圖1-7）。23和30日齡仔魚消化道黏液細(xì)胞類型維持不變，以II型為主，但數(shù)量持續(xù)增加（圖1-8～圖1-15）。

2. 2 消化道各段黏液細(xì)胞密度的變化

由表1可以看出，四指馬鲅消化道各段的黏液細(xì)胞密度隨日齡增加呈顯著的增加趨勢（P<0.05）。5日齡仔魚食道開始分化出黏液細(xì)胞，密度為52.09±1.01個/mm2，發(fā)育至9、15、17、23、30日齡時分別為161.45±0.90、259.98±12.34、216.65±12.82、471.62±10.38和1489.49±8.45個/mm2；幽門盲囊黏液細(xì)胞發(fā)生時（17日齡）的密度為200.65±8.30個/mm2，23日齡時增加至590.38±2.91個/mm2，30日齡時達(dá)687.45±3.81個/mm2；腸道從15日齡起出現(xiàn)黏液細(xì)胞，密度為239.98±9.31個/mm2，至30日齡時達(dá)462.72±10.29個/mm2。

2. 3 消化道黏液細(xì)胞大小變化及各段的分泌能力

四指馬鲅消化道各段黏液細(xì)胞的大小也隨日齡的增加而增大，其中以食道黏液細(xì)胞大小增長最明顯（表2）。黏液細(xì)胞大小與其密度的乘積可用于衡量消化道各段的黏液分泌能力，由表3可知，四指馬鲅消化道各段的黏液分泌能力亦隨日齡的增加而不斷提高，同日齡仔魚消化道中以食道的黏液分泌能力最強。

3 討論

3. 1 四指馬鲅消化道黏液細(xì)胞發(fā)生的規(guī)律

黏液細(xì)胞的成分差異可反映魚類發(fā)育階段（Leknes，2010，2011；辛儉等，2013）。四指馬鲅仔魚消化道最早（5日齡）在食道黏膜出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，而胃部最先（9日齡）出現(xiàn)I型黏液細(xì)胞，隨著日齡增加才逐漸出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，幽門盲囊在17日齡時可檢測到II型黏液細(xì)胞，腸道最先（15日齡）發(fā)育的是II型黏液細(xì)胞，同時含有少量I型黏液細(xì)胞，且消化道各段在30日齡時均未見III型和IV型黏液細(xì)胞。四指馬鲅的I型和II型黏液細(xì)胞均為幼稚型黏液細(xì)胞，僅含有單一種類的黏多糖，與點帶石斑魚（李鑫煒等，2012）、泥鰍（張建業(yè)等，2014）的消化道黏液細(xì)胞發(fā)育特點相似，表明在魚類的早期發(fā)育過程中，黏液細(xì)胞與消化道自身發(fā)育有緊密聯(lián)系，黏液細(xì)胞從幼稚型向成熟型轉(zhuǎn)變體現(xiàn)了消化道結(jié)構(gòu)從發(fā)生到成熟的變化過程。本研究發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅仔魚在不同日齡中消化道各段所含的黏液細(xì)胞總密度各不相同，分泌能力也存在日齡和部位的差異，即反映消化道各段在執(zhí)行消化吸收功能的地位，其中以食道在不同日齡中的黏液分泌能力最強，表明食道在協(xié)助食物消化吸收過程中發(fā)揮了重要作用。大多數(shù)硬骨海水魚類食道被覆復(fù)層的黏膜上皮并分布有大量黏液細(xì)胞（Díaz et al.，2008），由其分泌的黏液物質(zhì)在保護(hù)黏膜上皮免受機械損傷和細(xì)菌入侵及離子吸收等方面發(fā)揮作用（Díaz et al.，2006）。此外，四指馬鲅為肉食性魚類，食道很短，借助其發(fā)達(dá)的肌肉層和黏膜層實現(xiàn)攝入足量食物進(jìn)行機械消化的目的，而豐富的黏液物質(zhì)有利于潤滑食物使其快速往胃部推送。

3. 2 四指馬鲅消化道早期發(fā)育中黏液細(xì)胞的功能

四指馬鲅早期發(fā)育的消化道黏液細(xì)胞發(fā)育順序為II型→I型，其中II型黏液細(xì)胞在17日齡后整個消化道均有分布，尤其在食道和腸道分布較多，其分泌的酸性黏液物質(zhì)（主要含有酸性糖蛋白復(fù)合物）與含中性糖蛋白的黏液物質(zhì)不同，可增加表面黏液的黏性（Kumari et al.，2009），以此潤滑食物（魚類攝入的一些軟體動物、甲殼類小型魚類和昆蟲等）并保護(hù)黏膜表面，還起到協(xié)助機體對食物的轉(zhuǎn)運和吞咽作用，而且腸道是吸收營養(yǎng)物質(zhì)及清除有害微生物的場所，富含的II型黏液細(xì)胞可能與刺激黏膜免疫發(fā)生有關(guān)（Khojasteh et al.，2009）。本研究中，5日齡四指馬鲅仔魚食道開始出現(xiàn)II型黏液細(xì)胞，隨著日齡的增加，消化道II型黏液細(xì)胞數(shù)量呈明顯的增加趨勢，但未見其他類型（III型、IV型）黏液細(xì)胞，故推測II型黏液細(xì)胞在仔魚早期發(fā)育過程中維持機體正常消化功能和形成一定黏膜免疫能力方面占主導(dǎo)地位。四指馬鲅仔魚在3日齡時開口，體內(nèi)消化道與外界連通，消化道具備簡單的攝食和消化能力，但尚未分化完備的消化器官，隨著營養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變?yōu)橥庠葱誀I養(yǎng)，攝食同時也增加了有害微生物入侵的機會，分泌酸性黏液物質(zhì)的II型黏液細(xì)胞在一定程度上能協(xié)助食物消化吸收及提高機體抵御不良環(huán)境的能力；四指馬鲅腸道從15日齡開始分化出II型黏液細(xì)胞和少量I型黏液細(xì)胞，其中I型黏液細(xì)胞分泌的中性黏多糖常與堿性磷酸酶共存，有利于乳化食物，且中性黏液物質(zhì)可作為酶解食物過程中的必需輔助因子（Carrassón et al.，2006），表現(xiàn)為吸收功能與防御能力相協(xié)調(diào)。四指馬鲅從9日齡起胃部黏膜開始出現(xiàn)I型黏液細(xì)胞，且數(shù)量隨日齡的增加而增加，營造出中性黏液環(huán)境以利于食物的快速消化，與平鯛（Rhabdosargus sarba）（勾效偉等，2008）、黃鰭鯛（Sparus latus）（王永翠等，2012）、黃斑籃子魚（Siganus oramin）（區(qū)又君等，2013）的研究結(jié)果相似。

3. 3 研究黏液細(xì)胞發(fā)育對育苗的指導(dǎo)意義

在仔魚培育過程中，選擇適口餌料與及時更換餌料并制定投餌策略是提高育苗成活率的關(guān)鍵措施之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，黏液細(xì)胞的出現(xiàn)與仔稚魚開口日齡具有一致性，且黏液細(xì)胞的存在可能是仔魚開口的前提（李鑫煒等，2012）。張建業(yè)等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍在開口時（3日齡）口咽腔即出現(xiàn)酸性黏液細(xì)胞，且其分泌的黏液物質(zhì)在仔魚進(jìn)入外源性營養(yǎng)期間對食物的消化起主要作用。但本研究發(fā)現(xiàn)，四指馬鲅仔魚的開口日齡（3日齡）與黏液細(xì)胞發(fā)生日齡（5日齡）并不一致，可能與種屬特異性、培育環(huán)境及仔魚營養(yǎng)方式轉(zhuǎn)變有關(guān)，仔魚開口前由卵黃囊提供營養(yǎng)物質(zhì)，為內(nèi)源性營養(yǎng)期，開口攝食后由于消化道發(fā)育尚不完善，并未直接進(jìn)入完全外源營養(yǎng)階段，而是經(jīng)歷短暫的混合營養(yǎng)期，此期間（3～5日齡）尚未分化出黏液細(xì)胞，表明此階段仔魚體內(nèi)執(zhí)行消化功能的并非黏液細(xì)胞分泌的黏液物質(zhì)。至5日齡時卵黃囊吸收完畢，消化道結(jié)構(gòu)得到發(fā)育的同時出現(xiàn)黏液細(xì)胞，消化機能進(jìn)一步提高，使得仔魚具備獨立攝食、消化和吸收的能力，進(jìn)入完全外源性營養(yǎng)期成為可能。值得注意的是，雖然仔魚在5日齡時出現(xiàn)黏液細(xì)胞，但分泌黏液物質(zhì)單一且量不多，消化吸收能力較差且應(yīng)對不良環(huán)境的能力較低，極易感染疾病，因此，此階段除了要保證餌料充足外，還應(yīng)加強仔魚培育的日常管理。

4 結(jié)論

四指馬鲅消化道內(nèi)黏液細(xì)胞按食道、胃部、腸道、幽門盲囊的次序發(fā)生，其類型從II型→I型的順序出現(xiàn)，且不同部位黏液細(xì)胞密度、大小及分泌能力均隨日齡的增加而增加，黏液細(xì)胞這種發(fā)生和分布的特征與仔魚攝食能力日益增強及消化道結(jié)構(gòu)逐漸完善的趨勢相適應(yīng)。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）