吳佳慧，劉　皓，郭亞云，魏睦新

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

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化痰消瘀方對胃癌前病變大鼠PTEN、FAK及paxillin表達的影響

吳佳慧，劉皓，郭亞云，魏睦新

(南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

[摘要]目的觀察化痰消瘀方對胃癌前病變大鼠PTEN、FAK及paxillin表達的影響，從分子生物學水平探討其逆轉(zhuǎn)胃癌前病變的作用機制。方法選擇90只4～5周齡SD雄性大鼠，隨機取15只作為空白組，其余大鼠均采用N-甲基-N’-硝基N-亞硝基胍綜合饑飽失常、濃鹽水灌胃的方法制備胃癌前病變大鼠模型。將造模成功大鼠隨機分為模型組，中藥高、中、低劑量組及維酶素組，每組13只?？瞻捉M正常飲食，余均造模成功后，模型組給予生理鹽水灌胃，中藥高、中、低劑量組分別給予3 mL/kg、2 mL/kg、1 mL/kg化痰消瘀方灌胃，維酶素組給予10 mL/kg維酶素灌胃，均灌胃8周。采用HE染色法觀察大鼠胃黏膜病理改變情況，應(yīng)用免疫組化法檢測胃黏膜組織中PTEN、FAK及paxillin的表達情況。結(jié)果HE染色顯示空白組大鼠胃黏膜無癌前病變改變，模型組均出現(xiàn)不同程度的胃癌前病變改變，中藥高、中劑量組和維酶素組胃黏膜癌前病變情況均較模型組明顯改善(P均<0.05)，且中藥高劑量組改善程度高于其他各給藥組(P均<0.05)。免疫組化結(jié)果顯示PTEN在空白組強陽性表達；模型組鮮有表達；中藥高、中、低劑量組表達量逐漸降低，但高于模型組(P均<0.05)；中藥高劑量組PTEN表達量高于其他各給藥組(P均<0.05)。FAK、paxillin在空白組極少表達，模型組表達量較空白組顯著增加(P均<0.05)；中藥高、中、低劑量組二者表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中高劑量組表達量明顯低于其他各給藥組(P均<0.05)。結(jié)論中藥化痰消瘀方可顯著改善胃癌前病變大鼠胃黏膜組織病理學情況，其作用機制可能是激活抑癌基因PTEN，調(diào)節(jié) FAK的去磷酸化，通過FAK/Src 信號通路下調(diào)paxillin來誘導(dǎo)細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]胃癌前病變；化痰消瘀方； PTEN；FAK；paxillin

胃癌是一種全球高發(fā)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，《五大洲癌癥發(fā)病率》第9卷[1]的統(tǒng)計結(jié)果顯示，中國的胃癌病死率和發(fā)病率位于全球前20位，高于全世界平均水平，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。我國對早期胃癌的診斷率僅為10%，這主要源于胃癌早期階段癥狀缺乏特異性，而中晚期出現(xiàn)明顯癥狀時已錯過治療的最佳時機，從而導(dǎo)致患者生存率不足10%[2]。而大多數(shù)早期胃癌都有一個比較漫長的胃癌前期過程，胃癌前期包括胃癌前狀態(tài)和胃癌前病變(PLGC)，前者包括慢性萎縮性胃炎(CAG)、胃腺瘤型息肉、殘胃炎、惡性貧血以及慢性胃潰瘍；后者指在慢性萎縮性胃炎基礎(chǔ)上伴發(fā)的不完全型腸上皮化生(IM)和/或中、重度異型增生(Dys)。中醫(yī)學中并無胃癌前病變的明確概念，而胃癌前病變通常由慢性萎縮性胃炎進一步發(fā)展而來，故目前多數(shù)學者將胃癌前病變歸入中醫(yī)“胃痞”范疇。胃癌前病變是本虛標實，寒熱錯雜的病癥，病因多為外邪犯胃、飲食傷胃、情志不暢、脾胃素虛；病機關(guān)鍵是脾胃虛弱，痰瘀交阻。魏睦新教授通過大量的臨床實踐，總結(jié)出診療胃癌前病變的獨特方案，以“化痰活血消瘀法”為核心包括補氣健脾治其本，活血祛痰治其標，凝練出了以“二陳湯”為主方加減的化痰消瘀方，隨癥加減，臨床療效顯著，達到化痰活血祛瘀、利水消腫兼以補虛、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、促進免疫等作用[3]。本實驗?zāi)康脑谟谔剿骰迪龇侥孓D(zhuǎn)胃癌前病變的分子作用機制。

1實驗資料

1.1實驗動物選用4～5周的SD雄性大鼠90只，體質(zhì)量80～100 g，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SYXK(蘇)2008-0007。

1.2藥物化痰消瘀方主要由陳皮12 g、法半夏10 g、豬苓10 g、莪術(shù)10 g、紫丹參15 g、炒薏苡仁30 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g、仙鶴草15 g等組成，煎煮前將上述中藥迅速漂洗，冷水浸泡1 h后，加水沒過藥材約2 cm，煎煮40 min，過濾藥汁后將藥渣繼續(xù)加水煎煮取汁，合并，調(diào)節(jié)濃度至1 kg/L，-20 ℃保存?zhèn)溆?。N-甲基-N’-硝基N-亞硝基胍(N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, MNNG)5 g，由日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)；雷尼替丁0.15 g，江西匯仁藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H36021340；維酶素片0.2 g，北海陽光藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，國藥準字H45021183。

1.3試劑兔抗人 PTEN、FAK、paxillin單克隆抗體購于 ABcam公司；通用型SP試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4方法大鼠正常飲食適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選擇15只作為空白組，其余大鼠均采用MNNG綜合饑飽失常及濃鹽水灌胃協(xié)同方法造模：配制MNNG濃度為150 μg/mL，避光低溫保存，每天造模大鼠自由飲用,以饑飽失常法(每周隔2 d禁食1 d)喂養(yǎng)大鼠0.03%雷尼替丁飼料，同時予15%濃鹽水于禁食日灌胃(2 mL/只)；同一天空白組予蒸餾水2 mL/只灌胃，正常飲食。分別于第10，16，24周隨機抽取2只造模大鼠麻醉取胃，分別從胃竇、胃體處取組織2～3塊，中性甲醛溶液固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，連續(xù)4 μm厚度切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，中性樹膠封片，于實驗第24 周在光鏡下觀察到胃黏膜出現(xiàn)慢性萎縮性胃炎、中重度異型增生、不完全型腸上皮化生，以此確定造模成功。將造模成功后存活大鼠隨機分為模型組，中藥高、中、低劑量組及維酶素組，每組13只?？瞻捉M保持正常飲食；模型組予生理鹽水2 mL/只灌胃；中藥高、中、低劑量組分別給予化痰消瘀方3 mL/kg、2 mL/kg、1 mL/kg灌胃；維酶素組給予維酶素混懸液10 mL/kg灌胃，均1次/d。灌胃8周后，將全部大鼠麻醉處死取胃組織，按檢測造模是否成功方法制備標本。

1.5觀察指標

1.5.1一般情況和病理表現(xiàn)觀察干預(yù)前后各組大鼠精神狀態(tài)、活動情況、毛色、食欲、糞便及體質(zhì)量變化。制備好的HE染色標本均由2位病理醫(yī)師采取雙盲法閱片，判斷各組大鼠胃癌前病變情況。

1.5.2胃黏膜組織中PTEN、FAK、paxillin表達情況采用免疫組化法檢測。配制PTEN一抗工作濃度為1∶300，F(xiàn)AK、paxillin一抗工作濃度均為1∶200，具體實驗步驟按照通用型SP試劑盒說明書操作。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的PTEN、FAK、paxillin胃腺癌組織切片作為陽性對照。結(jié)果判讀以光鏡下細胞質(zhì)呈棕黃色或棕褐色細顆粒為染色陽性。染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個細胞，陽性細胞數(shù)評分：無陽性細胞為0分；<10%為1分；11%～50%為2分；51%～75%為3分；>75%為4分。根據(jù)染色強度和陽性細胞數(shù)分別計分，總分為兩者之積， 0分計為(-)，1～3 分計為(+)，4～5 分計為()，≥6 分計為()。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況與空白組大鼠比較，造模大鼠精神差，活動少，被毛枯槁稀疏，食少瘦削，糞便軟而不成形。與模型組大鼠相比，各給藥組大鼠精神活動可，進食增加，糞便漸而成形，體質(zhì)量均較模型組顯著增加(P均<0.05)，其中中藥高、中劑量組體質(zhì)量均明顯高于維酶素組(P均<0.05) 。見表1。

表1　各組大鼠干預(yù)前后體質(zhì)量變化情況±s，g)

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與維酶素組比較，P<0.05。

2.2各組大鼠胃黏膜病理表現(xiàn)與空白組相比，模型組胃黏膜充血水腫，有散在的潰瘍點，胃竇部黏膜變薄，以白相為主，甚至可見黏膜下血管分布，鏡下示大量炎性細胞浸潤，固有腺體減少，可見腸上皮腺體，或者不典型增生細胞出現(xiàn)，見圖1和圖2；與模型組相比，中藥高、中劑量組和維酶素組大鼠胃黏膜紅潤有光澤，黏膜皺襞完整，鏡下少見萎縮，少有炎性細胞浸潤，偶見腺上皮增生，見圖3和圖4。各給藥組干預(yù)后癌前病變得到不同程度的逆轉(zhuǎn)，見表2。

圖1　空白組大鼠胃黏膜HE染色表現(xiàn)(×200)

2.3各組胃黏膜組織中PTEN、FAK、paxillin鏡下表現(xiàn)空白組PTEN染色深，呈強陽性表達，見圖5；模型組鮮有表達，見圖6；中藥高、中、低劑量組PTEN染色逐漸變淺，陽性表達減少，見圖7；維酶素組PTEN染色強度低于中藥高劑量組而高于中劑量組，見圖8?？瞻捉MFAK鮮有表達，免疫組化染色幾乎不著色，見圖9；模型組FAK強陽性表達，染色呈深棕色，見圖10；中藥高、中、低劑量組FAK陽性表達增加，免疫組化染色逐漸變深，見圖11；維酶素組FAK著色程度介于中藥高、中劑量組之間，見圖12?？瞻捉Mpaxillin免疫組化染色幾乎不著色，見圖13；模型組paxillin免疫組化染色呈棕黃色，強陽性表達，見圖14；中藥高、中、低劑量組paxillin免疫組化染色逐漸變深，陽性細胞數(shù)增加，見圖15；維酶素組paxillin陽性表達程度介于中藥高、中劑量組之間，見圖16。

圖2　模型組大鼠胃黏膜HE染色表現(xiàn)(×200)

圖3　中藥高劑量組大鼠胃黏膜HE染色表現(xiàn)(×200)

圖4　維酶素組大鼠胃黏膜HE染色表現(xiàn) (×200)

只

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與中藥高劑量組比較，P<0.05。

圖5　空白組PTEN免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖6　模型組PTEN免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖7　中藥高劑量組PTEN免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖8　維酶素組PTEN免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖9空白組FAK免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖10　模型組FAK免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖11　中藥高劑量組FAK免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖12　維酶素組FAK免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖13　空白組paxillin免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖14　模型組paxillin免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖15　中藥高劑量組paxillin免疫組化表現(xiàn)(×200)

圖16　維酶素組paxillin免疫組化表現(xiàn)(×200)

2.4各組胃黏膜組織中PTEN、FAK、paxillin表達情況模型組PTEN表達量明顯低于空白組(P<0.05)，F(xiàn)AK、paxillin表達量均明顯高于空白組(P均<0.05)。中藥高、中、低劑量組PTEN表達量表達量逐漸降低，但均高于模型組(P均<0.05)；中藥高劑量組PTEN表達量高于其他各給藥組(P均<0.05)。中藥高、中、低劑量組FAK、paxillin表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)，其中中藥高劑量組表達量明顯低于其他各給藥組(P均<0.05)。見表3。

表3　各組胃黏膜組織中PTEN、FAK、paxillin表達情況

注：①與空白組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與中藥高劑量組比較，P<0.05。

3討論

現(xiàn)代醫(yī)學認為由胃癌前病變發(fā)展到胃癌是一個多階段的動態(tài)演變過程。早在1975年，Correa等[4]便提出正常胃黏膜歷經(jīng)慢性萎縮性胃炎、中重度異型增生、不完全型腸上皮化生逐步發(fā)展到早期胃癌的過程。多數(shù)學者認為患者胃黏膜一旦進入胃癌前病變階段便難以逆轉(zhuǎn)，故現(xiàn)代醫(yī)學對胃癌的研究焦點聚集在臨床中根據(jù)胃癌的TNM分期，采取不同的外科手術(shù)聯(lián)合化療方案綜合治療，主要以緩解癥狀為主，而對胃癌前病變的防治方法研究甚少。積極探索胃癌前期的防治方法，不僅能有效降低我國胃癌的發(fā)病率和死亡率，同時將對全球胃癌的防控做出重大貢獻。

中醫(yī)強調(diào)辨病與辨證相結(jié)合，在腫瘤的癌前病變時期，中醫(yī)藥發(fā)揮治未病的優(yōu)勢，在逆轉(zhuǎn)胃癌前病變方面取得了一定的臨床療效。魏睦新教授指導(dǎo)的課題組近年來在胃癌前病變內(nèi)在機制研究以及防治策略方面積累了一定的經(jīng)驗，一方面用化痰消瘀方對胃癌前病變患者進行臨床治療，實現(xiàn)了癥狀改善，病理逆轉(zhuǎn)[5-7]；另一方面進行動物實驗，證實逆轉(zhuǎn)機制可能與抑制Survivin、Livin表達，促進細胞凋亡[8]；上調(diào)Caspase-3表達、下調(diào)CyclinD1及mTOR表達，調(diào)節(jié)細胞周期有關(guān)[9]。但腫瘤的發(fā)生是分子事件，多種基因協(xié)同調(diào)控細胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)通路，調(diào)控細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，一旦基因表達異常，便會影響細胞的生長發(fā)育。

PTEN是第10號染色體上同源缺失性磷酸酶和張力蛋白基因 (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)，定位于人類染色體10q23.3，也稱TEP1或MMAC1基因，是使脂類去磷酸化的唯一抑癌基因，在晚期原發(fā)性惡性腫瘤中表達多缺失[10]。Bronise 等[11]研究發(fā)現(xiàn)通過蛋白磷酸酶的作用，PTEN能使FAK去磷酸化，下調(diào)FAK活性，從而達到抑制腫瘤細胞的浸潤轉(zhuǎn)移作用。有研究結(jié)果顯示在癌旁胃黏膜-腸化生-異型增生-胃癌的癌變進展過程中，PTEN的陽性率逐漸降低，且胃癌和異型增生中的陽性率顯著低于癌旁胃黏膜和腸化生胃黏膜，提示胃黏膜上皮細胞的惡性轉(zhuǎn)化與PTEN基因的異常遺傳學改變相關(guān)[12-13]。

FAK是一種非受體酪氨酸激酶，F(xiàn)AK基因定位于人體8q24，生物進化過程高度保守，各物種間的同源性高達90%[14]。Tyr397是FAK自身磷酸化的主要位點[15]，與Src家族直接作用。研究發(fā)現(xiàn)FAK通過Tyr397活化后，可引起胃癌細胞的增生、遷移和侵襲[16]。諸多研究表明，F(xiàn)AK作為細胞內(nèi)重要的信號分子，被認為是信號傳導(dǎo)的匯聚點，還可以促進細胞的運動和生長，促進細胞失巢凋亡，促使腫瘤細胞的增殖和遷移[17-20]。楊麗敏等[21]研究顯示FAK在胃腺癌組織中的表達水平與其分化程度、TNM分期明顯相關(guān)，且顯著高于正常胃黏膜組織。

paxillin基因定位于人類染色體12q24，表達產(chǎn)物是磷酸蛋白，有許多潛在的絲/蘇氨酸或絡(luò)氨酸磷酸化位點，paxillin是黏著斑信號蛋白和細胞黏附分子，其磷酸化是一個動態(tài)過程，受同時活化的FAK和Src的共同調(diào)控[22]。paxillin分子是介導(dǎo)信號傳導(dǎo)的重要位點，源于其含有和多種信號蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域，張春宏[23]認為paxillin在正常胃黏膜中表達很少，在慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、中重度異型增生、胃腺癌中的表達呈逐漸增強的趨勢。

目前將 PTEN、FAK、paxillin三者一起研究的國內(nèi)外文獻甚少。Herlevsen等[24]和Haier 等[25]研究發(fā)現(xiàn)PTEN 與 paxillin有一定的作用關(guān)系。Van等[26]進一步研究發(fā)現(xiàn)，PTEN調(diào)節(jié) FAK 去磷酸化，同時作為 FAK/Src 信號通路下游信號的paxillin被磷酸化激活，因此三者之間的內(nèi)在關(guān)系可能是PTEN通過FAK 而間接調(diào)節(jié) paxillin的表達。

本研究結(jié)果顯示，中藥化痰消瘀方能有效改善胃癌前病變大鼠一般狀況以及胃黏膜病理情況，在一定程度上逆轉(zhuǎn)胃癌前病變，達到胃癌的二級預(yù)防作用。化痰消瘀方可顯著上調(diào)胃癌前病變大鼠胃黏膜組織中PTEN水平，抑制FAK及 paxillin的表達，且中藥高、中劑量組抑制效果優(yōu)于維酶素組。其作用的分子生物學機制可能為化痰消瘀方激活抑癌基因PTEN，調(diào)節(jié) FAK的去磷酸化，通過FAK/Src 信號通路下調(diào)paxillin來誘導(dǎo)細胞凋亡。

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Effects of Huatan Xiaoyu decoction on expressions of PTEN, FAK and paxillin in rats with precancerous lesions of gastric cancer

WU Jiahui, LIU Hao, GUO Yayun, WEI Muxin

(The First Affiliated Hospital with Nanjing Medical University, Nanjing 210029, Jiangsu, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of Huatan Xiaoyu decoction (HTXYD) on expressions of PTEN, FAK and paxillin in rats with precancerous lesions of gastric cancer (PLGC), and explore the mechanism of reversing the precancerous lesions of gastric cancer from the level of molecular biology. Methods Ninety male SD rats of 4 to 5-week-old were randomly divided into blank group, model group, high dose Chinese medicine group, medium dose Chinese medicine group, low dose Chinese medicine group, and Vitacoenzyme group. Except for blank group, all the other groups mainly used N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG), irregular diet and emotional stimuli to establish PLGC rat models. After successful modeling, the animals in the model group were given normal saline, and different dose HTXYD and Vitacoenzyme in the corresponding treat groups. 8 weeks later, the pathological changes of gastric mucosa was observed by HE staining, and the expressions of PTEN, FAK and paxillin was detected by immunohistochemistry. Results HE staining showed that there was no precancerous lesion in the gastric mucosa of the rats in the blank group, but had different degree of precancerous lesion of gastric cancer in the model group. Compared with the model group, the gastric mucosal precancerous lesion of the high does and the middle dose Chinese medicine group and the Vitacoenzyme group were significantly improved (all P<0.05); and the improvement of the high dose Chinese medicine group was better than that of the other treatment groups (all P<0.05). The immunohistochemistry results showed that PTEN was strongly expressed in the blank group; there was little expression in model group; the expressions of the high does, the medium does and the low dose Chinese medicine group were gradually decreased, but were significantly higher than that of the model group (all P<0.05), and the expression of PTEN in the high dose group was significantly higher than that in the other treatment groups (all P<0.05). Paxillin, FAK was very little expression in the blank group, but the expressions in the model group were significantly increased than that in the blank group (all P<0.05); their expression levels in the high does, the medium does and the low does Chinese medicine group were significantly lower than those in the model group (all P<0.05), and which in the high dose Chinese medicine group was significantly lower than that in the other treatment groups (all P<0.05). Conclusion HTXYD can significantly improve the pathological conditions of gastric mucosa to reverse the PLGC rats, the possible mechanism is to activate tumor suppressor gene PTEN, to regulate the dephosphorylation of FAK, and to down-regulate the paxillin through FAK/Src signaling pathway in aim to induce apoptosis.

Key words:precancerous lesions of gastric cancer; Huatan Xiaoyu decoction; PTEN; FAK; paxillin

[收稿日期]2015-12-15

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)15-1611-06

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.15.005

[基金項目]江蘇省中醫(yī)藥局科技基金資助項目(YB2015163)；江蘇省中醫(yī)藥管理局基金資助項目(JD11040)

[作者簡介]吳佳慧，女，碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療消化病的基礎(chǔ)和臨床研究。[通信作者]魏睦新，E-mail: weimuxin@njmu.edu.cn