王志軒，劉喜綱，崔小麗，鄭曉英，劉翠哲*

(1．河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000； 2.承德市食品藥品檢驗檢測中心， 承德 067000)

HPLC法同時測定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量

王志軒1，2，劉喜綱1，崔小麗2，鄭曉英2，劉翠哲1*

(1．河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，承德醫(yī)學院中藥研究所，承德 067000； 2.承德市食品藥品檢驗檢測中心， 承德 067000)

目的：建立高效液相色譜法同時測定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素含量的方法。方法：采用Thermo C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；甲醇-乙腈-0.1%磷酸梯度洗脫；流速1.0 ml/min；檢測波長356 nm。 結(jié)果：金絲桃苷、槲皮素、山柰素分別在4.85～194.25、5.05～202.07和4.90～196.27 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；平均加樣回收率分別為97.34%、96.79%和97.56%，RSD 分別為1.60%、1.01%和1.40%。結(jié)論：建立的方法簡便、準確、重復性好，可用于照山白藥材的質(zhì)量控制。

照山白，金絲桃苷，槲皮素，山柰素，HPLC

照山白別名萬斤、萬經(jīng)棵，為雙子葉植物杜鵑花科植物小花杜鵑(RhododendronmicranthumTurcz)的枝葉或花，具有止咳化痰、祛風通絡、調(diào)經(jīng)止痛等功效，可用于治療急慢性氣管炎、哮喘、痛經(jīng)、產(chǎn)后周身疼痛等病癥[1-3]。照山白的主要成分為酚酸類化合物[4]、三萜類化合物[5，6]以及黃酮類化合物[7-9]，其中金絲桃苷、槲皮素、山柰素等黃酮類化合物含量較高。近年研究表明，金絲桃苷、槲皮素和山柰素具有抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗腫瘤和抗癌等多種藥效[10-12]。

照山白中黃酮類成分的含量測定方法有分光光度法、氣相色譜法、液相色譜法、毛細管電泳法等[13]。已有文獻報道用HPLC測定糙枝金絲桃中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山柰酚的含量[14]，以及用 HPLC測定宣木瓜中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量[15]，但未有文獻報道同時測定照山白中金絲桃苷、槲皮素、山柰素的含量。本實驗應用HPLC法同時測定照山白中金絲桃苷、槲皮素和山柰素3種成分的含量，為照山白藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀；電子分析天平(METTLER TOLEDO XPE26DR)。

1.2 試藥 對照品：金絲桃苷(批號111521-201205，含量93.3%)、槲皮素(批號100081-200907，含量96.5%)、山柰素(批號110861-201310，含量93.2%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；照山白藥材分別采集于吉林省通化、河北省灤平、寬城，經(jīng)河北省食品藥品檢定研究院段吉平研究員鑒定為杜鵑花科植物小花杜鵑(照山白)；乙腈(Fisher Scientific，美國)；甲醇(分析純，天津市康科德科技有限公司)；磷酸(分析純，天津佳興化工玻璃儀器工貿(mào)有限公司)；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱采用Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：[甲醇-乙腈(13∶11)]為A，0.1%磷酸為B，梯度洗脫(0～40 min, 25%A；40～60 min, 38%A；60～80 min, 43%A)，流速1.0 ml/min，檢測波長356 nm，柱溫30 ℃，進樣量10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取金絲桃苷對照品10.50 mg、槲皮素對照品10.47 mg、山柰素對照品10.53 mg，置50 ml量瓶中，加一定量的甲醇溶解，定容，搖勻，配制成金絲桃苷濃度為195.93 μg/ml、槲皮素濃度為202.07 μg/ml和山柰素濃度為196.27 μg/ml的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取粉碎后的照山白粉末約1 g，置于錐形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，用70%甲醇補足重量，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 系統(tǒng)適應性試驗 分別取供試品溶液和混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結(jié)果見圖1，表明在此色譜條件，金絲桃苷、槲皮素和山柰素3種成分分離良好。

2.4 線性關(guān)系考查 分別精密吸取混合對照品溶液0.25、0.5、2.5、5.0、7.5和10.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到3種成分的系列濃度的對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，分別以3種對照品的濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，作圖，得到金絲桃苷、槲皮素和山柰素的回歸方程為：金絲桃苷Y=12 1110 715.40X-10 550 469.80(r=0.999 1，n=6);槲皮素Y=12 1110 715.40X-10 558 469.80(r=0.998 7，n=6);山柰素Y=238 205 793.70X-20 836 336.90(r=0.998 6，n=6)。結(jié)果表明，金絲桃苷、槲皮素和山柰素分別在4.85～194.25、5.05～202.07和4.90～196.27 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.金絲桃苷 2.槲皮素 3.山柰素

圖1 混合對照品(A)供試品(B)HPLC色譜圖

2.5 精密度試驗 精密吸取3種成分的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，計算金絲桃苷、槲皮素和山柰素峰面積RSD分別為1.1%、0.14%和0.88%。表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗 分別精密稱取粉碎后的同一樣品6份，每份1 g，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下方法測定，測得樣品中金絲桃苷、槲皮素和山柰素的平均含量分別為5.10、0.10和0.40 mg/g，RSD分別為0.71%、0.56%和1.5%，表明重復性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一樣品溶液10 μl，分別于0、2、6、12、24和48 h進樣，結(jié)果樣品中3種成分金絲桃苷、槲皮素和山柰素峰面積的RSD分別為0.51%、1.5%和1.7%。表明金絲桃苷、槲皮素和山柰素在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 回收率試驗 分別精密稱取9份已知含量樣品,每份約0.5 g，分別加入一定量的金絲桃苷、槲皮素和山柰素對照品，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件檢測，計算金絲桃苷、槲皮素和山柰素的回收率，結(jié)果金絲桃苷平均回收率為97.34%，RSD為1.60%；槲皮素平均回收率為96.79%，RSD為1.01%；山柰素平均回收率為97.56%，RSD為1.40%。見表1-3。

表1 金絲桃苷回收率試驗結(jié)果

表2 槲皮素回收率試驗結(jié)果

表3 山柰素回收率試驗結(jié)果

2.9 含量測定 分別取不同批號照山白藥材5份，精密稱定，按“2.2.2”項下方法制備，按“2.1”項下色譜條件測定，外標法計算，結(jié)果見表4。

表4 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 流動相的選擇 照山白中化學成分較復雜，檢測組分較多，實驗中曾選擇過不同比例的甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、[甲醇-乙腈(1∶1)]-0.1%磷酸、[甲醇-乙腈(13∶11)]-0.1%磷酸等流動相，其中以[甲醇-乙腈(13∶11)]-0.1%磷酸分離效果最為良好，故選擇該流動相體系。

3.2 提取方法的選擇 在供試品制備時分別考查了甲醇回流提取、乙醇回流提取、索氏提取器提取、超聲提取等不同方法，發(fā)現(xiàn)超聲提取即可提取完全；又對不同濃度的甲醇進行考查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)70%甲醇提取完全，同時對超聲處理的時間進行了考查，發(fā)現(xiàn)超聲處理30 min即可提取完全。

3.3 產(chǎn)地和采收季節(jié)的影響 從結(jié)果來看，不同產(chǎn)地、不同采收季節(jié)對金絲桃苷、槲皮素和山柰素的含量均有影響。從產(chǎn)地來看，吉林產(chǎn)照山白中槲皮素含量最高，采收自灤平的照山白中山柰素含量最高。從采收季節(jié)來看，承德地區(qū)5月份采收的照山白中金絲桃苷、山柰素均高于7月、10月采收，槲皮素含量也較高，為照山白比較適合的采收季節(jié)。

1 楊秀嶺, 袁志芳, 張?zhí)m桐,等.照山白總黃酮的藥理作用研究[J].中草藥, 2006, 37(4):583-584,615

2 陳玉華, 韓東旭, 蘭希寧, 等.照山白鎮(zhèn)咳作用分析[J].中外健康文摘,2010,24 (7)：359

3 劉洋, 王東風,黃娜.照山白醇提物對大鼠缺血心肌的保護作用[J].中國藥師, 2012,15(1):12-14

4 夏重道, 杜安全, 王紅萍, 等. 照山白有效成分的化學研究[J].中國藥科大學學報, 1999, 30(4):314-315

5 陳萌，郭偉，郭慶梅，等. 蒙藥照山白揮發(fā)油化學成分的研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實踐，2013,27(5):28-30

6 常國棟，羅都強. 照山白的化學成分研究[J] .亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2011,7(4)：39-40

7 王先榮,杜安全,王紅萍.照山白中黃酮醇類成分的提取分離和鑒定[J].安徽醫(yī)藥, 1997, 1(4)：17-18

8 張孟科，詹冠群，雷亮，等.照山白枝葉化學成分研究[J] .中國科技論文在線精品論文，2015，8(17)：1861-1865

9 楊秀嶺, 袁志芳, 許慧君,等. 照山白黃酮類化學成分的研究[J]. 藥物分析雜志,2010,30(9):1750-1752

10 林萍，易宏偉, 張斐.金絲桃苷藥理作用研究進展[J].中國現(xiàn)代中藥,2012,14(10):23-26

11 孫涓，余世春. 槲皮素的研究進展[J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐, 2011, 25(3):85-88

12 陳育華,周克元,袁漢堯.山奈酚藥效的研究進展[J].廣東醫(yī)學, 2010, 31(8):1064-1066

13 姜紅波.黃酮類物質(zhì)的提取和含量測定方法研究進展[J]. 化工時刊, 2010, 24(11):45-49

14 郭炬亮，李新霞，支玲. HPLC測定糙枝金絲桃中綠原酸 、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素和山奈酚[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2013,19(11):75-78

15 丁姍姍, 呂凌, 張毅, 等. HPLC法同時測定宣木瓜中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素的含量[J]. 安徽醫(yī)藥, 2012,16(4):450-452

2015-10-29

河北省高校重點學科建設項目(No.冀教高[2003]4號)

R917

A

1006-5687(2016)01-0015-03

*通訊作者: 劉翠哲，E-mail: liucuizhexy@163.com。