李 玥，鄒愛(ài)英

(1.天津市濱海新區(qū)大港中醫(yī)醫(yī)院，天津 300193； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300151)

李 玥1，鄒愛(ài)英2

(1.天津市濱海新區(qū)大港中醫(yī)醫(yī)院，天津 300193； 2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300151)

目的：分析藏茵陳甲醇提取物中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸6種有效成分。方法：高效液相色譜-電噴霧/離子阱質(zhì)譜法(HPLC-ESI/MS)對(duì)藏茵陳甲醇提取物中6種有效成分進(jìn)行測(cè)定和色譜峰的歸屬。采用ACCHROM Unitary-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以水(4 mmol/L 甲酸銨-0.2%的甲酸)-甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，體積流量 0.8 ml/min，進(jìn)樣量 20 μl，柱溫40 ℃；采用電噴霧離子源進(jìn)行正離子模式監(jiān)測(cè)。結(jié)果：藏茵陳甲醇提取物中6種有效成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸分別在1.452～29.04、0.808～16.16、1.036～20.72、0.864～17.28、0.828～16.56和5.812～116.24 μg/ml范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，平均回收率分別為100.1%(RSD為1.41%)、99.7%(RSD為1.49%)、98.1%(RSD為1.69%)、101.7%(RSD為1.69%)、100.1%(RSD 1.62%)、100.3%(RSD 1.64%)。結(jié)論：本法簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、專(zhuān)屬性好，可用于藏茵陳甲醇提取物中6種有效成分的測(cè)定。

藏茵陳，HPLC-MS，獐牙菜苦苷，龍膽苦苷，芒果苷，swertia，svinertia，齊墩果酸

藏茵陳是傳統(tǒng)藏藥，藏藥名“蒂達(dá)”，具有清熱解毒，清肝利膽的功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，藏茵陳具有保肝、抗病毒、抗菌、消炎等多種作用，臨床上廣泛用于治療乙肝、急性黃疸型肝炎等疾病。藏茵陳中含有環(huán)烯醚萜、呫噸酮、三萜等多種類(lèi)別的化學(xué)成分[1]。藏茵陳來(lái)源廣泛，《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》(第一冊(cè))收載其原植物有川西獐牙菜SwertiamussotiiFranch和印度獐牙菜S.chirayitaKarsten。其中，藏茵陳為龍膽科獐牙菜屬植物印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb ex Flemi) Karsten 的干燥全草；主產(chǎn)于尼泊爾、印度、不丹，多從尼泊爾由民間進(jìn)入我國(guó)。藏茵陳中的齊墩果酸對(duì)四氯化碳引起的大鼠急慢性肝損傷有明顯保護(hù)作用；環(huán)烯醚萜類(lèi)成分具有抗炎、促進(jìn)肝損傷細(xì)胞修復(fù)等藥理活性。而黃酮類(lèi)化合物具有抑制單胺氧化酶、抑制體外腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、抗氧化、保肝等多重活性[2-10]。

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-電噴霧/離子阱質(zhì)譜法(HPLC-ESI/MS)，對(duì)藏茵陳甲醇提取物中齊墩果酸、svinertia、swertia、芒果苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷6種有效成分首次進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，可為藏茵陳的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

美國(guó)Finnigan 公司 LCQ 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，ACCHROM Unitary-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，DL-360D 智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)；BP211D型十萬(wàn)分之一天平(德國(guó) Sartorius 公司)；甲醇為色譜純(天津康科德科技發(fā)展有限公司)。獐牙菜苦苷對(duì)照品(批號(hào)110785-201404，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.3%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；龍膽苦苷對(duì)照品(批號(hào)110770-201515，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；芒果苷對(duì)照品(批號(hào)111607-200402，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；swertia對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%，自制)；svinertia對(duì)照品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.1%，自制)；齊墩果酸對(duì)照品(批號(hào)110709-201206，質(zhì)量分?jǐn)?shù)94.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)； 5批藥材均購(gòu)于青海地區(qū)，經(jīng)張鐵軍研究員鑒定為印度獐牙菜Swertiachirayita(Roxb ex Flemi) Karsten。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為ACCHROM Unitary-C18柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流動(dòng)相為水(4 mmol/L甲酸銨-0.2%的甲酸，A)-甲醇溶液(B)，梯度洗脫：0～7.0 min，95% A；7.1～21.0 min，95%～5% A；21.1～25.0 min，95% A；檢測(cè)波長(zhǎng)：分段變波長(zhǎng)測(cè)定，0～21.0 min為254 nm，21.1～25.0 min為210 nm；體積流量 0.8 ml/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 正離子檢測(cè)；離子源噴射電壓：4.5 kV；毛細(xì)管溫度：250 ℃；毛細(xì)管電壓：25 V；鞘氣流速：50 arb；輔助氣流速：20 arb；碰撞氣：氦氣；檢測(cè)方式：多級(jí)全掃描質(zhì)譜。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 分別稱取對(duì)照品獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸適量，精密稱定，加甲醇制成對(duì)照品溶液。分別取各對(duì)照品溶液適量，制成獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸的混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為 36.3、20.2、25.9、21.6、20.7和145.3 μg/ml。

2.3.2 供試品溶液的制備 取藏茵陳粗粉1.0 g，精密稱定，置25 ml 具塞三角瓶中，精密加入80%甲醇20 ml，稱定重量，超聲1.0 h，放冷，用 80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，取上清液，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考查 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.0、2.0、4.0、8.0、16.0和20.0 ml，分別置25 ml量瓶中，以甲醇定容，搖勻，即得系列質(zhì)量濃度的混合溶液，分別吸取上述溶液各20 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，見(jiàn)表1。

2.5 LC-UV分析 在上述色譜條件下，采用UV檢測(cè)方法獲得混合對(duì)照品，印度獐牙菜提取物的HPLC色譜圖見(jiàn)圖1。對(duì)照品的色譜結(jié)果顯示獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸的保留時(shí)間；根據(jù)保留時(shí)間，樣品的色譜圖中1、2、3、4、5和6色譜峰初步鑒別為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸。

2.6 HPLC-ESI-MS/MS分析 在設(shè)定的HPLC-ESI(+)-MS/MS條件下，經(jīng)色譜分離后，得到各離子峰的精確分子質(zhì)量數(shù)，質(zhì)譜歸屬結(jié)果見(jiàn)表2?；趍/z值，保留時(shí)間，進(jìn)一步鑒定樣品的色譜圖中1、2、3、4、5和6色譜峰為獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸。

2.7 精密度試驗(yàn) 取藏茵陳粗粉，取約1.0 g，精密稱取 6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下記錄 6 種化合物的峰面積，計(jì)算 RSD 值，考查日內(nèi)精密度。取上述供試品溶液連續(xù) 3 d 測(cè)定計(jì)算 RSD 值，考查日間精密度。結(jié)果顯示6種成分日內(nèi)精密度的 RSD 值分別為0.88%、0.97%、0.65%、1.34%、1.12%和1.32%；日間精密度的RSD值分別為 1.37%、1.61%、0.99%、1.51%、1.28%和0.85%，表明該方法精密度良好。

表2 6種成分質(zhì)譜歸屬

化合物MS1m/z歸屬M(fèi)S2m/z歸屬獐牙菜苦苷375[M+H]+212[M+H-C6H11O5]+龍膽苦苷357[M+H]+194[M+H-C6H11O5]+芒果苷423[M+H]+260[M+H-C6H10O5]+swertia275[M+H]+260[M+H-CH3]+svinertia289[M+H]+274[M+H-CH3]+齊墩果酸457[M+H]+412[M+H-COOH]+

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已測(cè)定的藏茵陳粗粉0.5 g，分別精密加入高、中、低 3 個(gè)水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)水平 3 份，共 9 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。按上述的色譜條件測(cè)定 6 個(gè)化合物的峰面積，計(jì)算回收率及 RSD 值。結(jié)果 6 種被測(cè)成分獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、芒果苷、swertia、svinertia和齊墩果酸的平均回收率分別為100.1%、99.7%、98.1%、101.7%、100.1%和100.3%，RSD 值分別為1.41%、1.49%、1.69%、1.69%、1.62%和1.64%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 3-8。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12和24 h 進(jìn)樣分析測(cè)定，記錄峰面積，考查供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果表明所有被測(cè)物峰面積的 RSD分別為0.51%、0.55%、0.59%、0.67%、0.70%和0.78%，說(shuō)明樣品穩(wěn)定性良好。

表4 龍膽苦苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表5 芒果苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表6 swertia加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表7 svinertia 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

表8 齊墩果酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 (n=9)

2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取藏茵陳粗粉，取約 1.0 g，精密稱取 6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄6 種化合物的峰面積，計(jì)算 RSD 值，考查重復(fù)性。6 種化合物的 RSD 值分別為0.79%、0.88%、1.74%、1.22%、1.38%和1.66%， 符合規(guī)定， 表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 樣品測(cè)定 按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜峰面積，將 6 個(gè)待測(cè)成分的峰面積代入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，并計(jì)算其質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 藏茵陳中 6 種成分的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)首次建立了一種快速、準(zhǔn)確的 HPLC-MS/MS 分析方法，用于同時(shí)測(cè)定藏茵陳藥材中6種有效成分含量，為藏茵陳藥材的質(zhì)量控制提供了可靠的分析手段。

實(shí)驗(yàn)比較了以甲醇、乙醇為提取媒介，提取供試品，結(jié)果表明以甲醇提取效率較高。同時(shí)考查了提取時(shí)間20 min、30 min、1 h和1.5 h，結(jié)果顯示1 h各成分提取較完全，確定提取時(shí)間為1 h。流動(dòng)相的選擇和優(yōu)化是整個(gè)色譜條件的關(guān)鍵，同時(shí)考慮到要用質(zhì)譜進(jìn)行分析，不揮發(fā)性鹽類(lèi)不能使用，如磷酸鹽等。為此，我們分別考查了有機(jī)相的種類(lèi)、緩沖鹽的種類(lèi)、緩沖鹽濃度、流動(dòng)相比例等。在確定緩沖鹽的種類(lèi)后，分別考查了2、4和8 mmol/L甲酸銨水溶液為緩沖鹽溶液，隨著緩沖鹽濃度的增加，色譜峰的峰形發(fā)生變化，最終確定4 mmol/L為最佳緩沖鹽溶液濃度。同時(shí)進(jìn)行了色譜柱的篩選，篩選了C18柱、C8柱、氨基柱、苯基柱、氰基柱各種填料的色譜柱，最終確定使用C18柱。

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2015-11-28

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A

1006-5687(2016)01-0008-04