孫全霞，湯斌，李松

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

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匍枝根霉β-葡糖苷酶的分離純化及其受產(chǎn)物抑制分析

孫全霞，湯斌*，李松

(安徽工程大學(xué) 微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖，241000)

摘要對(duì)匍枝根霉β-葡糖苷酶進(jìn)行了純化并研究了葡萄糖、甘露糖、山梨醇和甘露醇對(duì)該酶的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，66.7 mmol/L的葡萄糖和88.9 mmol/L的甘露糖可完全抑制一定酶活力單位的β-葡糖苷酶活力(0.76 IU)，而山梨醇和甘露醇對(duì)β-葡糖苷酶的催化活力沒有影響。分析結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和山梨糖、甘露糖和甘露醇結(jié)構(gòu)差異僅在醛基位置，通過Molegro Virtual Docker(MVD)軟件模擬并分析葡萄糖、山梨醇和纖維二糖與β-葡糖苷酶的對(duì)接模型，發(fā)現(xiàn)含有醛基的葡萄糖與纖維二糖在酶的結(jié)合區(qū)存在兩處競爭性結(jié)合位點(diǎn)(Asp244和Asn242)，且兩者在該酶活性中心內(nèi)的全部結(jié)合位點(diǎn)上均處于競爭性關(guān)系，其中葡萄糖的醛基在與多個(gè)活性位點(diǎn)結(jié)合過程中起主導(dǎo)作用；而不含醛基的山梨醇與纖維二糖在該酶的催化中心及外圍均不存在競爭性關(guān)系，由此推測可能是葡萄糖分子中的醛基在β-葡糖苷酶受產(chǎn)物抑制的過程中起到了關(guān)鍵性的作用。

關(guān)鍵詞分離純化；β-葡萄苷酶；抑制；醛基

纖維素酶是由內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase，EG)、外切葡聚糖酶(cellobiohydrolase enzyme，CBH)和β-葡糖苷酶(β-glucosidase，BG)組成的一種復(fù)合酶[1]。內(nèi)切葡聚糖酶可以隨機(jī)水解纖維素中的β-1,4-糖苷鍵[2-3]，外切葡聚糖酶可以從還原段或非還原段將纖維素水解成纖維二糖[4]，β-葡糖苷酶進(jìn)一步將纖維二糖水解生成葡萄糖[5]，在3種纖維素酶的協(xié)同之下使得纖維素最終被水解成可發(fā)酵性單糖，在整個(gè)水解過程中β-葡糖苷酶是限速酶，是纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖的一個(gè)瓶頸[6]。在實(shí)際應(yīng)用過程中，常常由于終產(chǎn)物(葡萄糖)的積累而引起酶催化產(chǎn)物抑制作用并形成中間產(chǎn)物積累，從而致使纖維素酶系的協(xié)同作用效率大幅下降，這也是纖維素酶在生物質(zhì)能源應(yīng)用領(lǐng)域存在的一個(gè)亟待解決的難題。如，TEUGJAS等人研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖的積累抑制了β-葡糖苷酶活性并引起纖維二糖的累積和整個(gè)纖維素酶系水解效率的下降[7]。由于β-葡萄苷酶的來源不同，所以其各個(gè)方面的性質(zhì)也都不相同[8-11]。LI等人發(fā)現(xiàn)，一種新型的β-葡糖苷酶Bgl1269是目前最耐葡萄糖抑制的β-葡糖苷酶，3.6 mol/L葡萄糖濃度下β-葡糖苷酶竟有70%的酶活力[12]；OLSEN等人曾經(jīng)報(bào)道過在0.1 mol/L葡萄糖濃度下β-葡糖苷酶僅有30%的酶活力[13]；MAI等人曾經(jīng)從鏈霉菌中克隆表達(dá)了一種耐鹽耐葡萄糖的β-葡糖苷酶BglNH，在0.5 mol/L葡萄糖濃度下β-葡糖苷酶還有60%的酶活力[14]；SOPHIE等添加6 mmol/L的pNPG能使葡萄糖對(duì)來自第一家族的β-葡糖苷酶AS-Esc10的抑制減少2.5倍，以致在2.5 mol/L以上的葡萄糖濃度才開始對(duì)β-葡糖苷酶的活力有抑制作用[15]。

本文從匍枝根霉原菌的發(fā)酵液中分離純化得到β-葡糖苷酶(BGLIII)，研究了葡萄糖、山梨醇、蔗糖、甘露醇和甘露糖對(duì)BGLIII酶活力的影響并利用Molegro Virtual Docker(MVD)軟件分析了葡萄糖對(duì)BGLIII抑制的機(jī)理。有關(guān)β-葡糖苷酶受葡萄糖抑制機(jī)理的研究，對(duì)定向改造β-葡糖苷酶并解除葡萄糖對(duì)β-葡糖苷酶的抑制，提高整個(gè)纖維素酶的催化效率有著重要的意義。

1材料

1.1菌株

匍枝根霉TP-02(RhizopusstoloniferTP-02)由本實(shí)驗(yàn)室保存；稻草、豆渣、硫酸銨、KH2PO4、MgSO4、CaCl2、Tween-80購于國藥集團(tuán)(分析純)；透析袋、0.15 nm濾膜購于上海Sangon公司；DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析柱、CM-Sepharose FF陽離子交換層柱、Sephadex G-100購于GE公司。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1酶活測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]對(duì)纖維素酶活性進(jìn)行測定。纖維素酶活力單位定義：適當(dāng)催化條件下，每分鐘水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力國際單位(IU)。

2.2蛋白質(zhì)濃度測定

采用Brandford方法[17]，標(biāo)準(zhǔn)蛋白為牛血清蛋白。

2.3纖維素酶系的分離純化

匍枝根霉上罐(上海寶興生物設(shè)備公司，BIOFECH-10TSA，10 L)發(fā)酵78 h后，利用硫酸銨沉淀、G-100凝膠層析柱、DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析、CM-Sepharose FF陽離子交換層析柱等分離方法從發(fā)酵液中分離純化BGLⅢ。

2.4BG水解底物產(chǎn)生的葡萄糖量

取12根比色管，添加BGLⅢ到比色管中(0.76 IU)，加入1 mL水楊甘，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)定容到2 mL反應(yīng)體系，50 ℃下分別反應(yīng)10～120 min(每隔10 min取1根比色管)，采用DNS法[18]測量還原糖的量。對(duì)照組除了將等量的酶滅活10 min外，其他條件相同。

2.5糖和醇對(duì)β-葡萄糖苷酶的影響

在比色管中添加BGLⅢ(0.76 IU)后再分別添加葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇和甘露糖使反應(yīng)體系中葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇和甘露糖的濃度為0～100 mmol/L，用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 4.8)定容為2 mL反應(yīng)體系，然后反應(yīng)30 min，測量酶活力的變化。對(duì)照組除了將等量的酶后滅活10 min以外,其他條件相同。

2.6MVD模擬分析

通過MVD軟件進(jìn)行同源建模，分子對(duì)接。分析關(guān)鍵氨基酸與葡萄糖、山梨醇和纖維二糖之間的作用關(guān)系。

3結(jié)果和分析

3.1纖維素酶系的純化

經(jīng)過硫酸銨沉淀、SephadexG-100凝膠層析柱、DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析柱、CM-SepharoseFF陽離子交換層析柱4步驟分離法，得到電泳純的BGLⅢ(圖1)。如圖1，泳道1是純化后得到的BGLⅢ，分子質(zhì)量為70 kDa左右。

1-CM-SepharoseFF陽離子交換層析柱后的BGLIII；2-DEAE-SepharoseFF陰離子交換層析柱收集樣品；3-Sephadex G-100　　　凝膠過濾層析柱后的樣品；4-酸銨沉淀后的樣品圖1　目的蛋白SDS-PAGE圖Fig.1　Results of SDS-PAGE

3.2不同時(shí)間內(nèi)BGLⅢ水解底物產(chǎn)生的葡萄糖量

圖2　BGLⅢ水解底物產(chǎn)生的葡萄糖Fig.2　The glucose produced by BG hydrolysis the substrate

測量BGLⅢ在10～140 min內(nèi)水解水楊甘產(chǎn)生的葡萄糖濃度。由圖2可知，葡萄糖質(zhì)量濃度小于4.5 mg/mL時(shí)，BGLⅢ水解水楊甘產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量濃度不斷增加，但隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的上升，BGLⅢ水解水楊甘的速度有所下降，當(dāng)葡萄糖達(dá)到4.5 mg/mL時(shí)，葡萄糖的質(zhì)量濃度不再增加。將反應(yīng)60 min時(shí)的水解液(葡萄糖質(zhì)量濃度為4.5 mg/mL)用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(0.05 mol/L，pH 4.8)稀釋1倍(葡萄糖質(zhì)量濃度為2.23 mg/mL)后再反應(yīng)20 min后測葡萄糖濃度，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的質(zhì)量濃度又增加到了4.45 mg/mL。對(duì)比這兩個(gè)階段的試驗(yàn)，推測第一階段試驗(yàn)里面，葡萄糖質(zhì)量濃度不再增加是由于葡萄糖濃度過高引起產(chǎn)物的反饋抑制。3.3糖和醇對(duì)BGLⅢ的影響

配置不同濃度的糖和醇，研究它們對(duì)BGLⅢ酶活力的影響并比較這些糖和醇在結(jié)構(gòu)上的差異。根據(jù)圖3得出，葡萄糖、山梨糖對(duì)BGLⅢ酶活力有很強(qiáng)的抑制作用，在糖濃度為66.7～88.9 mmol/L時(shí)，BGLⅢ的酶活力完全喪失；山梨醇、甘露醇和蔗糖對(duì)BGLⅢ的水解效率沒有影響。如圖4分析這兩種糖和兩種醇的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的醛基位置加氫還原形成山梨醇；甘露糖的醛基位置加氫還原形成甘露醇，因此它們的結(jié)構(gòu)差異僅僅在于糖的醛基位置。雖然它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上有細(xì)微差異但是對(duì)BGLIII酶活力的影響卻有截然不同的影響，因此我們推測在抑制的過程中葡萄糖和甘露糖的醛基起到了主要的作用。

圖3　糖和醇對(duì)BGLⅢ酶活力的影響Fig.3　Effect of sugar and alcohol on the activity of BGLⅢ

圖4　糖和醇的結(jié)構(gòu)Fig.4　The structure of sugar and alcohol

3.4機(jī)理分析

3.4.1BGLⅢ結(jié)合區(qū)的對(duì)接分析

利用MVD軟件分析葡萄糖對(duì)BGLⅢ抑制原因,模擬BGLⅢ在結(jié)合區(qū)與葡萄糖、纖維二糖、山梨醇的對(duì)接模型。

通過對(duì)接結(jié)果和查閱文獻(xiàn)推斷此處為底物和BGLⅢ的結(jié)合區(qū)域。對(duì)接結(jié)果顯示BGLⅢ的活性區(qū)域呈口袋結(jié)構(gòu)，這與大多數(shù)報(bào)道的β-葡糖苷酶的活性區(qū)域一致，即底物進(jìn)入活性中心及產(chǎn)物排出都需經(jīng)過此入口。由圖5-a可知，纖維二糖在結(jié)合區(qū)結(jié)合的位點(diǎn)有Asn242，Gly243，Lys263，Asp244等，氫鍵整體作用力的方向指向活性中心，由此推測纖維二糖在此處的結(jié)合是使其更好的進(jìn)入活性中心內(nèi)部；葡萄糖在結(jié)合區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)有Asp244，Tyr313，Tyr315，Tyr173，Asn242，與葡萄糖的醛基結(jié)合的位點(diǎn)有Asp244，Tyr313，Tyr315，其中Asp244也是與纖維二糖競爭性結(jié)合的位點(diǎn)。葡萄糖在此處的結(jié)合不僅阻止纖維二糖進(jìn)入活性中心也同時(shí)導(dǎo)致了活性中心內(nèi)水解產(chǎn)生的葡萄糖無法流出，造成活性中心內(nèi)部葡萄糖的累積，加大了活性中心內(nèi)部葡萄糖和纖維二糖競爭結(jié)合活性位點(diǎn)的能力。

a-纖維二糖與BGLⅢ對(duì)接模型；b-葡萄糖與BGLⅢ對(duì)接模型；c、d-纖維二糖與葡萄糖競爭性結(jié)合的位點(diǎn)；e～i-葡萄糖的醛基結(jié)合的位點(diǎn)圖5　BGLⅢ結(jié)合區(qū)的分子對(duì)接示意圖Fig.5　The docking result of BGLⅢ in bining site

3.4.2BGLⅢ活性中心對(duì)接分析

利用MVD軟件對(duì)BGLⅢ同源建模，模擬活性中心。利用纖維二糖、葡萄糖、山梨醇與BGLⅢ進(jìn)行對(duì)接，模擬在活性中心處與三者作用的氨基酸并分析葡萄糖對(duì)BGLⅢ的抑制機(jī)理。

由圖6-b可知，在活性中心與纖維二糖相互作用的氨基酸有Asn172， His126，Tyr315， Glu384，Glu441，Gln23，Thr442等。由圖6-a可知，在活性中心處與葡萄糖相互作用的氨基酸有Cys176，Asn172，Glu173，His126，Tyr315，Trp356， Glu384，Glu441等，葡萄糖與纖維二糖作用的氨基酸幾乎相同，因此在活性中心處葡萄糖和纖維二糖是競爭性結(jié)合活性位點(diǎn)造成了BGLⅢ的活性受到抑制。對(duì)比圖6-d、e、f和圖6-c可知，與葡萄糖結(jié)合的8種氨基酸過程中，Glu384、His126、Asn172和Glu173都與葡萄糖的醛基相互作用，而山梨醇與纖維二糖既沒有競爭性結(jié)合活性位點(diǎn)，結(jié)合的位置對(duì)BGLⅢ的活性中心也沒有造成堵塞，因此對(duì)酶活力沒有造成影響。根據(jù)以上分析，我們得出在葡萄糖對(duì)BGLⅢ的抑制過程中，葡萄糖的醛基和BGLⅢ有很強(qiáng)的結(jié)合力對(duì)抑制起到了決定性的作用。

a-葡萄糖與BGLⅢ對(duì)接模型；b-纖維二糖與BGLⅢ在處對(duì)接；c-山梨醇與BGLⅢ在處對(duì)接；d～g-葡萄糖的醛基在活性中心處結(jié)合的氨基酸圖6　BGLⅢ活性中心分子對(duì)接示意圖Fig.6　The docking result of BGLⅢ in active site

4討論

本文使用了4步驟分離法對(duì)匍枝根霉TP-02發(fā)酵液中的BGLⅢ進(jìn)行分離純化，得到了純度較高的BGLⅢ，采用此分離技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)在于可以利用蛋白質(zhì)性質(zhì)的不同以及梯度洗脫的方式除去雜蛋白，更好的保留目的蛋白。在過G-100凝膠層析柱時(shí)，由于時(shí)間過長，對(duì)酶活損傷較大，我們采用了多次上樣、收集和濃縮的方式保證有較高的酶活做進(jìn)一步純化。目前對(duì)纖維素酶活性抑制的研究主要集中在里氏木霉和黑曲霉的研究，在匍枝根霉中很少有報(bào)道。通過MVD軟件模擬分析得出葡萄糖在BGLⅢ結(jié)合區(qū)和活性中心與纖維二糖都存在競爭性結(jié)合。在葡萄糖的結(jié)合位點(diǎn)中，進(jìn)一半位點(diǎn)與葡萄糖的醛基相結(jié)合，由此可見葡萄糖的醛基和BGLⅢ有很強(qiáng)的結(jié)合能力，而山梨醇結(jié)合的位置和位點(diǎn)對(duì)酶的催化活性均無影響，由此我們得出葡萄糖是通過醛基將自身錨定在結(jié)合區(qū)以及活性中心內(nèi)部，即阻止了纖維二糖進(jìn)入活性中心也造成了活性中心內(nèi)水解產(chǎn)生的葡萄糖無法流出，加大了葡萄糖在活性中心內(nèi)與纖維二糖的競爭性結(jié)合能力，在抑制過程中起到了決定性的作用。我們認(rèn)為在抑制的過程中葡萄糖在結(jié)合區(qū)的結(jié)合對(duì)酶活性的影響更強(qiáng)。下一步可以突變結(jié)合區(qū)的位點(diǎn)消除葡萄糖在入口處的結(jié)合，或者增加活性中心入口處的大小讓產(chǎn)物更好的流出活性中心，減少葡萄糖對(duì)BGLⅢ的抑制。

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Purification of a β-glucosidase fromRhizopusstoloniferand analysis on its product inhibition

SUN Quan-xia, TANG Bin*, LI Song

(Anhui Polytechnic University,Engineering Technololy Research Center of Anhui Microbial Fermentation,Wuhu 241000,China)

ABSTRACTβ-glucosidase was purified from Rhizopus stolonifer. Its inhibition by glucose, mannose, sorbitol and mannitol was studied. The results showed that 66.7 mmol/L glucose and 88.9 mmol/L mannose could completely inhibit the activity of 0.76 IU β-glucosidase, while the sorbitol and mannitol had no effect on the catalytic activity of β-glucosidase. Structure disparity of these sugars and polyols was located in the aldehyde group. Molegro Virtual Docker(MVD) was used to simulate the docking model of glucose, sorbitol and cellobiose with the β-glucosidase. It was found that glucose and cellobiose had two competing binding sites (Asp244 and Asn242) in the substrates binding region, and a competitive relationship was found in active regions of these two molecules. The aldehyde group of glucose played a leading role in the process of combination with active sites. However, sorbital and cellobiose displayed noncompetitive relationship in the catalytic center and binding region of β-glucosidase. It indicated that the aldehyde group played a key role in the product inhibition of β-glucosidase by glucose.

Key wordsseparation and purification; β-glucosidase; inhibition; aldehyde group

收稿日期：2015-09-26，改回日期：2015-12-07

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金(31270135)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604019

第一作者：碩士研究生(湯斌教授為通訊作者，E-mail：tangbin@ahpu.edu.cn)。