陸信曜，季廣建，宗紅，諸葛斌，2*

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

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budR表達(dá)水平對(duì)克雷伯氏菌甘油代謝的影響

陸信曜1，季廣建1，宗紅1，諸葛斌1，2*

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，工業(yè)微生物研究中心，江蘇 無(wú)錫,214122) 2(江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

摘要通過(guò)過(guò)量表達(dá)和反義RNA抑制改變budR表達(dá)水平，考察budR表達(dá)水平對(duì)克雷伯氏菌甘油代謝的影響。過(guò)表達(dá)budR使得BudB和BudC的酶活提高了48.7%和69.7%，1,3-丙二醇產(chǎn)量降低了12.6%，2,3-丁二醇含量增加了73.3%，同時(shí)乙酸含量顯著降低。反義RNA抑制budR表達(dá)后，BudB和BudC酶活分別降低了56%和78%，重組菌的生物量、2,3-丁二醇(BDO)、乙酸、乳酸等均表現(xiàn)為略有降低，1,3-丙二醇含量達(dá)到23.4 g/L，提高約10%。上述結(jié)果進(jìn)一步豐富了budR基因在調(diào)控bud操縱子的表達(dá)水平、2,3-丁二醇合成及克雷伯氏菌甘油代謝中的作用，為后續(xù)代謝改造克雷伯氏菌合成1,3-丙二醇提供了新的思路。

關(guān)鍵詞budR；克雷伯氏菌；甘油代謝；1,3-丙二醇；2,3-丁二醇

1,3-丙二醇(1,3-propanediol,PDO)是一種重要的三碳平臺(tái)化合物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域，尤其是作為合成新型聚酯纖維聚對(duì)苯二甲酸丙二醇酯(polytrimethylene terephthalate，PTT)的前體[1]。在已報(bào)道的PDO合成菌株中，克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)能夠利用甘油高效生產(chǎn)PDO。在克雷伯氏菌中，甘油通過(guò)甘油脫水酶和1,3-丙二醇氧化還原酶消耗NADH生成PDO。另一方面，甘油同時(shí)被氧化為丙酮酸并繼而產(chǎn)生乙醇、乳酸、乙酸、2,3-丁二醇(2,3-butanediol,BDO)等副產(chǎn)物，與PDO合成途徑競(jìng)爭(zhēng)碳流和還原力。

在這些副產(chǎn)物中，BDO的沸點(diǎn)與PDO相似，同時(shí)其在發(fā)酵液中的含量較高，極大地增加了下游分離提取成本，限制了發(fā)酵法生產(chǎn)PDO的工業(yè)化[2]。因此，降低BDO含量對(duì)生物合成PDO的工業(yè)化具有重要意義。在克雷伯氏菌中，bud操縱子編碼了BDO合成相關(guān)基因，其中包括：α-乙酰乳酸合成酶(BudB)，α-乙酰乳酸脫羧酶(BudA)，2,3-丁二醇脫氫酶(BudC)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子BudR[3-4](圖1)。為了從基因水平上研究影響克雷伯氏菌BDO合成的因素，本文通過(guò)過(guò)量表達(dá)和反義RNA抑制改變胞內(nèi)budR表達(dá)水平，考察其對(duì)克雷伯氏菌甘油代謝的影響。

圖1　克雷伯氏菌bud操縱子Fig.1　The bud operon of K. pneumoniae

1材料與方法

1.1材料與試劑

表達(dá)質(zhì)粒pEtac、反義RNA表達(dá)載體pETR，KlebsiellapneumoniaeZG25由本研究室構(gòu)建或選育并保存。硫酸卡那霉素(Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均購(gòu)自生工生物工程公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法

LB培養(yǎng)基用于EscherichiacoliJM109和種子液培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 40，酵母膏 5，1水葡萄糖 6，KH2PO47.5，MgSO42，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，維生素B120.015，微量元素溶液 10 mL。微量元素溶液(g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl20.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035。根據(jù)需要加入Kan (終質(zhì)量濃度100 μg/L)、IPTG (終濃度0.5 mmol/L)。

種子培養(yǎng)：50 mL的三角瓶裝液10 mL，接種量1%(V/V)，37 ℃下150 r/min培養(yǎng)6～7 h。發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL的三角瓶裝液50 mL，接種量4%(V/V)，37 ℃下100 r/min培養(yǎng)。

1.2.2基因克隆與質(zhì)粒構(gòu)建

1.2.2.1pEtac-budR質(zhì)粒的構(gòu)建

根據(jù)K.pneumoniae342 (GenBank No: CP000964.1)基因組序列設(shè)計(jì)budR引物R1 (GAA GCG GGA GAG TCG TTC T)和R2 (ATT TGC GGA TGG AAA GCA T)，PCR得到budR片段后克隆至質(zhì)粒pEtac，得到質(zhì)粒pEtac-budR并轉(zhuǎn)化K.pneumoniaeZG25，得到K.pneumoniaeZG25(pEtac-budR)。同時(shí)將質(zhì)粒pEtac轉(zhuǎn)入K.pneumoniaeZG25，得到對(duì)照菌株K.pneumoniaeZG25(pEtac)。

1.2.2.2pETRH-budR質(zhì)粒的構(gòu)建

設(shè)計(jì)與budR基因RBS位點(diǎn)附近序列互補(bǔ)的反義DNA引物RB1 (CCG GAA TTC ATG GAA CTT CGT TAT CTT C)和RB2(ATA GAG CTC TCA GAA CAT CGC CAG AAA G)，PCR得到的片段克隆至質(zhì)粒pETRH，得到質(zhì)粒pETRH-budR并轉(zhuǎn)化K.pneumoniaeZG25，得到K.pneumoniaeZG25(pETRH-budR)。

1.2.3分析測(cè)定

菌體生物量用600 nm下的吸光值表示。發(fā)酵產(chǎn)物利用高效液相色譜 (high performance liquid chromatography，HPLC) 測(cè)定，Amines HPX-87H (Bio-Rad) (300 mm×7.8 mm，9 μm)，60 ℃，流動(dòng)相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，使用示差折光及紫外檢測(cè)器。

SDS-PAGE采用5%濃縮膠和12%分離膠的垂直平板電泳，利用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。

α-乙酰乳酸合成酶酶活(BudB)：1 min將丙酮酸脫酸獲得1 μmol乙偶姻的酶量定義為單位酶活，檢測(cè)方法及步驟參照文獻(xiàn)[5]。

2,3-丁二醇脫氫酶酶活(BudC)：1 min生成1 μmol NADH酶量定義為單位酶活，檢測(cè)方法及步驟參照文獻(xiàn)[6]。

2結(jié)果與分析

2.1budR過(guò)表達(dá)對(duì)克雷伯氏菌甘油代謝的影響

如圖2A所示，克隆得到的budR大小與預(yù)期相符、測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中序列比對(duì)一致。將其連接至pEtac載體，得到重組質(zhì)粒pEtac-budR(圖2B)。將重組質(zhì)粒pEtac-budR轉(zhuǎn)化克雷伯氏野生菌得到K.pneumoniaeZG25(pEtac-budR)。SDS-PAGE電泳顯示，與對(duì)照菌K.pneumoniaeZG25(pEtac)相比，K.pneumoniaeZG25(pEtac-budR)成功實(shí)現(xiàn)了budR的胞內(nèi)重組表達(dá)(圖2C)。重組菌胞內(nèi)酶活檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，過(guò)表達(dá)budR使得BudC的酶活提高了69.7%，BudB的酶活提高了48.7%(由于BudA底物α-乙酰乳酸不穩(wěn)定、難以獲得標(biāo)準(zhǔn)品，本文未測(cè)定其酶活)。上述結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)budR能夠顯著提高BudB和BudC的酶活。

1-budR基因的PCR產(chǎn)物；M1-DNA marker；M2-標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白質(zhì)marker；2-K. pneumoniae ZG25(pEtac-budR)胞內(nèi)可溶蛋白；　　　　　　　　　　　　　　　　3-K. pneumoniae ZG25(pEtac)胞內(nèi)可溶蛋白圖2　budR基因的PCR產(chǎn)物(A)，質(zhì)粒pEtac-budR圖譜(B)及budR在克雷伯氏菌中表達(dá)的SDS-PAGE電泳分析(C)Fig.2 PCR product of budR gene (A), plasmid map of pEtac-budR (B), and SDS-PAGE analysis of the expression of budR (C)

菌體K.pneumoniaeZG25(pEtac)K.pneumoniaeZG25(pEtac-budR)K.pneumoniaeZG25(pETRH-budR)BudC/[U·mg-1(protein)]46.879.410.3BudB/[U·mg-1(protein)]11.917.75.22

如圖3A所示，budR過(guò)表達(dá)使得重組菌的生物量提高了約20%，表明budR對(duì)克雷伯氏菌生長(zhǎng)有明顯的正調(diào)控作用。2株菌的PDO和BDO積累趨勢(shì)相似，重組菌K.pneumoniaeZG25(pEtac-budR)的PDO產(chǎn)量降低了12.6%，而B(niǎo)DO含量則增加了73.3% (圖3B)。這些結(jié)果表明，budR的過(guò)表達(dá)激活了BDO合成相關(guān)代謝酶活性，使得碳流向BDO途徑偏轉(zhuǎn)，與PDO途徑競(jìng)爭(zhēng)碳流和還原力，造成PDO產(chǎn)量降低。由于BDO具有抑制有機(jī)酸合成、穩(wěn)定pH的作用，BDO含量的增加導(dǎo)致乙酸產(chǎn)量顯著降低(圖3C)，同時(shí)有機(jī)酸積累量的減少也能夠進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)。其他副產(chǎn)物含量均較少。

圖3　重組菌K. pneumoniae ZG25(pEtac)、K. pneumoniae ZG25(pEtac-budR)和K. pneumoniae ZG25(pETR-budR)的發(fā)酵過(guò)程中的生物量(A)、主產(chǎn)物(B)和副產(chǎn)物(C)Fig.3　Time course of the fermentation of biomass (A), products (B) and byproducts (C) of the recombinants

2.2反義RNA抑制budR表達(dá)對(duì)克雷伯氏菌甘油代謝的影響

通常情況下，敲除是研究基因功能的重要手段。但由于bud操縱子可能參與了支鏈氨基酸的合成，因此敲除其中基因可能會(huì)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有重要影響[7]。反義RNA技術(shù)能夠在保留目的基因的前體下顯著降低其表達(dá)水平[8]。本小節(jié)利用反義RNA抑制budR基因的表達(dá)。

已有報(bào)道根據(jù)起始密碼子附近序列設(shè)計(jì)的反義RNA具有較好效果[9]，據(jù)此設(shè)計(jì)引物克隆得到budR基因的反義DNA，擴(kuò)增得到的反義DNA克隆至帶有發(fā)夾結(jié)構(gòu)[10]的反義RNA轉(zhuǎn)錄載體pETR，得到重組質(zhì)粒pETR-budR(圖4)，將重組質(zhì)粒pEtac-budR轉(zhuǎn)化克雷伯氏野生菌得到K.pneumoniaeZG25(pETR-budR)。重組菌胞內(nèi)酶活檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，重組菌K.pneumoniaeZG25(pETR-budR)中反義RNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后，BudC酶活降低了78%，BudB酶活降低了56%，表明budB、budC的表達(dá)受到顯著抑制。

M-DNA marker；1- PCR得到的budR反義DNA片段圖4　budR反義DNA的克隆(A)和質(zhì)粒pETR-budR圖譜(B)Fig.4　PCR product of antisense budR (A) and plasmid map of pETR-budR (B)

如圖3A所示，反義RNA抑制budR表達(dá)后，重組菌的生物量略有降低。雖然BudB和BudC的酶活下降嚴(yán)重，但重組菌K.pneumoniae(pETR-budR)的BDO含量降低并不明顯(圖3B)。事實(shí)上，已有文獻(xiàn)報(bào)道克雷伯氏菌中可能存在其他負(fù)責(zé)BDO合成的酶[11]，從而表現(xiàn)為抑制BudB和BudC活性未能顯著弱化BDO合成。由于BDO的合成未受到嚴(yán)重的抑制，所以乙酸積累僅降低了約10%。相比之下，反義RNA抑制budR表達(dá)后，重組菌的生物量、BDO、乙酸、乳酸等均表現(xiàn)為稍有降低，從而在一定程度上為PDO提供了碳流和還原力，使得重組菌K.pneumoniae(pETR-budR)的PDO的產(chǎn)量達(dá)到23.4 g/L，提高約10%。

3結(jié)論

本文通過(guò)過(guò)量表達(dá)和反義RNA抑制budR，改變其表達(dá)水平，考察budR對(duì)克雷伯氏菌甘油代謝的影響。結(jié)果表明budR表達(dá)水平和BudB及BudC酶活之間具有正相關(guān)性。同時(shí)，budR表達(dá)水平的上調(diào)對(duì)BDO合成及克雷伯氏菌甘油代謝具有明顯的影響，但budR表達(dá)水平的下調(diào)對(duì)甘油代謝的影響有限。上述結(jié)果進(jìn)一步豐富了budR基因在調(diào)控bud操縱子的表達(dá)水平、BDO合成及克雷伯氏菌甘油代謝中的作用，為后續(xù)代謝改造克雷伯氏菌合成PDO提供新的思路。

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Influence of expression level ofbudR on glycerol metabolism ofKlebsiellapeneumoniae

LU Xin-yao1, JI Gang-jian1, ZONG Hong1, ZHUGE Bin1,2*

1(Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Research Centre of Industrial Microbiology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTIn this study, the expression level of budR was enhanced and repressed by overexpression and synthetic antisense RNA, respectively. The BudB and BudC activities were increased by 48.7% and 69.7%, respectively, by overexpression of budR. The titer of 1,3-propanediol was reduced by 12.6%. The concentration of 2,3-butanediol was increased by 73.3%. Meanwhile, the concentration of acetate was significantly increased. The BudB and BudC activities were repressed by 56% and 78%, respectively, after introduction of antisense RNA of budR. The 1,3-propanediol titer reached 23.4 g/L with the improvement by 10%. However, there were no significant changes of the concentrations of 2,3-butanediol and other byproducts after the introduction of the antisense RNA of budR. The results reported here provided new information about the effect of budR on the regulation of bud operon, 2,3-butanediol synthesis and glycerol metabolism of Klebsiella peneumoniae.

Key wordsbudR; Klebsiella peneumoniae; glycerol metabolism; 1,3-propanediol; 2,3-butanediol

收稿日期：2015-10-22，改回日期：2015-12-22

基金項(xiàng)目：863計(jì)劃(2012AA021201)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604005

第一作者：博士，講師(諸葛斌教授為通訊作者，E-mail：bzhuge@163.com)。