吳雪楠，孫菁菁，羅園園，劉文娟，姚　俊

(北京科技大學土木與環(huán)境工程學院，北京 100083)

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草甘膦對土壤微生物能量代謝的影響

吳雪楠，孫菁菁，羅園園，劉文娟，姚俊

(北京科技大學土木與環(huán)境工程學院，北京 100083)

摘要：草甘膦是應用最廣、產(chǎn)量最大的農(nóng)藥除草劑，草甘膦對土壤微生物能量代謝的影響受到越來越多研究者的關注。以壤質(zhì)潮土和黑土為供試土壤，采用微量量熱法研究了草甘膦對土壤微生物能量代謝的影響。結果表明，草甘膦對兩類土壤微生物能量代謝均有不同程度的抑制作用，黑土微生物對草甘膦的耐受性更強；草甘膦對壤質(zhì)潮土和黑土微生物代謝活性的半數(shù)抑制濃度分別為444.90 mg·kg-1、978.69 mg·kg-1；土壤微生物的能量代謝與土壤的理化性質(zhì)顯著相關。

關鍵詞：草甘膦；土壤微生物；微量量熱法；能量代謝

草甘膦(C3H8NO5P)屬芽后內(nèi)吸非選擇性高效廣譜滅生性除草劑[1]。自20世紀70年代問世至今，已發(fā)展成為全球范圍內(nèi)應用最廣、產(chǎn)量最大的農(nóng)藥除草劑。我國草甘膦利用率約為30%，其在土壤中的大量殘留給環(huán)境帶來了巨大的潛在風險[2]。

土壤微生物是土壤生物群落中種類最多的一種，在土壤中處于共生狀態(tài)，在生態(tài)系統(tǒng)中起著重要作用，是有機質(zhì)轉(zhuǎn)化、養(yǎng)分循環(huán)與釋放、物質(zhì)分解等生物及生物化學過程中最重要的推動力。微生物既是土壤形成過程的作用者，又是土壤的重要組成部分[3]。土壤微生物的活性與諸多因素有關。土壤的理化性質(zhì)是導致土壤微生物活性差異的原因之一。目前，大部分研究集中于污染物對土壤微生物種群、酶活性、呼吸速率等方面的影響。如范艷春[4]研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松林土壤含水量對土壤微生物呼吸的影響遠大于土壤營養(yǎng)成分，說明馬尾松林土壤營養(yǎng)充足，外界環(huán)境是土壤微生物呼吸的限制因子。Imparato等[5]通過測定細菌和原生動物的豐度、多樣性、生理狀態(tài)和土壤有機碳來研究草甘膦對植物根際微生物群落的影響。韓世忠等[6]研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌以及細菌的PLFAs含量與pH值呈顯著負相關，與含水量呈顯著正相關；土壤微生物主要類群PLFAs含量與總氮、有機碳和銨態(tài)氮均呈顯著正相關。

微量量熱法能夠監(jiān)測反應體系變化過程中總的熱效應。它對被研究體系的光譜性質(zhì)、溶劑性質(zhì)、磁性質(zhì)和電學性質(zhì)都沒有限制條件，具有非破壞性的特點，可以連續(xù)、自動、動態(tài)監(jiān)測整個反應過程[7]。Zheng等[8]通過細胞計數(shù)法和微量量熱法研究了均衡營養(yǎng)元素施肥與養(yǎng)分缺乏施肥對土壤微生物活性的長期影響，結果表明，微量量熱曲線中重要的參數(shù)(增長速率常數(shù)、微量熱峰值、到達峰值的時間)均很好地反映了土壤微生物的活性高低。

開展草甘膦對農(nóng)田土壤微生物活性影響的研究，將為草甘膦對于不同類型土壤的使用劑量和方式提供重要依據(jù)，從一定程度上提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效率。鑒于此，作者選擇壤質(zhì)潮土和黑土作為供試土壤，通過室內(nèi)模擬實驗，從能量代謝角度研究草甘膦濃度對兩類土壤微生物活性的影響，評價草甘膦對農(nóng)田土壤環(huán)境的影響，為更科學合理地使用草甘膦和減少環(huán)境污染提供理論依據(jù)。

1實驗

1.1試劑與儀器

草甘膦(30%水劑)，北京燕化永樂農(nóng)藥有限公司；葡萄糖、硫酸銨及其它試劑均購于天津試劑公司。所有試劑均為分析純，未進行前處理。

TAM Ⅲ型多通道微量量熱儀(靈敏度為10 nW，內(nèi)反應容器為4.5 mL不銹鋼安瓿瓶)，瑞典J?rf?lla公司；DV215CD型精密電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；QL-861型微型渦旋混合器，江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司；真空抽濾泵；酸式滴定管；堿式滴定管。

1.2供試土樣的采集

供試土樣分別取自河北省保定市清苑縣和吉林省長春市榆樹縣農(nóng)田，在各農(nóng)田中設置3個采樣區(qū)域，各區(qū)域均采用對角法采集4個土樣。采樣時，以30 cm為間隔，用土鉆采集0～20 cm深處土壤，混合均勻后除去砂礫和動植物殘體，用冰盒保存并立即運回，4 ℃保存。

1.3微量量熱實驗

實驗前，將土樣在28 ℃下放置1 d；將安瓿瓶清洗干凈，置于烘箱中(110 ℃，30 min)滅菌。取兩類土樣各1 g分別置于安瓿瓶中，加入0.2 mL預先配制好的營養(yǎng)液，營養(yǎng)液主要成分為葡萄糖與硫酸銨(1∶1，體積比)；再加入草甘膦，使土樣中草甘膦濃度(mg·kg-1)分別為0、100、250、500、1 000，渦旋混合均勻；最后將安瓿瓶密封，按操作規(guī)程放入微量量熱儀中(等溫槽溫度設為28 ℃)。通過檢測器監(jiān)測微生物代謝過程中釋放的熱量并傳輸數(shù)據(jù)給計算機，繪制微量量熱曲線，分析微量量熱曲線的重要參數(shù)，評價草甘膦對兩類土壤微生物能量代謝的影響。

2結果與討論

2.1兩類土壤的理化性質(zhì)分析

清苑縣屬暖溫帶大陸性季風氣候，年均降水量550 mm，土壤為壤質(zhì)潮土；榆樹縣屬東北地區(qū)季風性中溫帶半濕潤氣候，年均降水量600 mm，土壤為黑土。兩類土壤的基本理化性質(zhì)見表1。

表1

土壤的基本理化性質(zhì)

Tab.1

Physical and chemical properties of soil

在土壤學中，有機質(zhì)含量的多少可以反映土壤肥力水平的高低；全氮量是衡量土壤氮素供應狀況的重要指標；速效磷(速效鉀)含量是指能被當季作物吸收的磷量(鉀量)，其含量多少在一定程度上反映了土壤中磷(鉀)素的貯量和供應能力；陽離子交換量反映了土壤保持養(yǎng)分的能力，即通常說的保肥能力的高低，交換量大的土壤保持速效養(yǎng)分能力強，反之則弱，土壤陽離子交換量可作為評價土壤供肥續(xù)肥能力的指標[9]。

由表1可知，兩類土壤均偏堿性；清苑土壤的有機質(zhì)、全氮、速效磷、速效鉀以及陽離子交換量等指標均低于榆樹土壤。兩類土壤均屬礦質(zhì)土壤(有機質(zhì)含量低于200 g·kg-1)，其中，榆樹土壤具有較高的肥力水平和保肥能力，重要營養(yǎng)元素氮、磷、鉀的含量也更高，表明榆樹土壤是更為肥沃的農(nóng)田土壤。

2.2兩類土壤的微量量熱曲線

微量量熱法是一種用于評估土壤微生物代謝活性的有效工具。雖然不同生物代謝產(chǎn)生熱量的過程不同，但放出的總熱量取決于體系的初始和最終能量狀態(tài)。在不干擾系統(tǒng)的前提下，微量量熱法可對微生物動態(tài)代謝過程進行長時間且穩(wěn)定的連續(xù)監(jiān)測[10-12]。

圖1為28 ℃下不同濃度草甘膦對清苑土壤與榆樹土壤微生物微量量熱曲線的影響。

圖128 ℃下，不同濃度草甘膦對兩類土壤微生物微量量熱曲線的影響

Fig.1Effect of different concentrations of glyphosate on microcalorimetric curves of microorganisms from two kinds of soil at 28 ℃

從圖1可以看到，兩類土壤微生物的微量量熱曲線都存在明顯的微生物生長期，即延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰退期；兩類土壤微生物微量量熱曲線的峰值均隨著草甘膦濃度的增大而逐漸降低，代謝過程變緩且有延遲；清苑土壤的最大熱輸出功率(曲線峰值)的變化更明顯，相鄰峰值最大差值達621.09 μW；而榆樹土壤的最大差值僅為397.07 μW；清苑土壤微生物完成整個代謝過程需要2 000 min左右，而榆樹土壤微生物僅需要1 400 min。表明，肥沃的榆樹土壤微生物對草甘膦的耐受性更強，在急性毒性實驗中反應更快。

2.3微量量熱曲線的重要參數(shù)

草甘膦對土壤微生物的代謝過程有著不同程度的抑制作用，且抑制作用隨著草甘膦濃度的增大而增強。微量量熱曲線表明，土壤微生物的增長符合以下公式：

lnPt=lnP0+kt

式中：t為時間；Pt為t時刻的熱輸出功率；P0為初始功率；k為生長速率常數(shù)。生長速率常數(shù)k可通過微量量熱曲線的第一峰值數(shù)據(jù)計算。通過計算生長速率常數(shù)等一系列熱力學參數(shù)(表2)可以定量描述土壤微生物受草甘膦抑制的程度。

表2

兩類土壤微生物的熱力學參數(shù)

Tab.2

Thermodynamic parameters of microorganisms from two kinds of soil

注：c為草甘膦濃度；k為生長速率常數(shù)；Pmax為最大熱輸出功率；Tmax為完成整個代謝過程所需時間；QT為總熱量；I為抑制率。

由表2可知，未添加草甘膦時，兩類土壤微生物能量代謝的最大熱輸出功率(Pmax)分別為1 638.90 μW、1 608.92 μW，差異不明顯，表明，在無草甘膦干擾的情況下，兩類土壤微生物的代謝能力幾乎相當，且肥沃土壤更有利于微生物的生長；隨著草甘膦濃度的增大，兩類土壤微生物的最大熱輸出功率與生長速率常數(shù)均遞減，且清苑土壤的遞減速度比榆樹土壤快，清苑土壤比榆樹土壤需要更長的時間達到最大熱輸出功率。這可能是由于，肥沃的土壤為微生物提供了更適宜的生存條件，使其對草甘膦的耐受性增強。相關研究也驗證了這一點，如：土壤的理化性質(zhì)是決定土壤微生物群落結構的主要因素[13]；在肥沃高產(chǎn)的農(nóng)田土壤中，微生物群落以細菌為主，可觀察到更快速的營養(yǎng)循環(huán)[14]。

2.4微量量熱參數(shù)I與 IC50

抑制率I是基于k的值，通過下式計算：

I=(k0-kc)/k0

式中：k0為對照樣品的生長速率常數(shù)；kc為草甘膦濃度為c時的樣品的生長速率常數(shù)。

當I等于50%時，對應的草甘膦濃度稱為半數(shù)抑制濃度，簡稱IC50。在凋亡方面，IC50值可以理解為凋亡微生物細胞與全部細胞數(shù)之比等于50%時所對應的草甘膦濃度。IC50值可以用來衡量草甘膦誘導微生物細胞凋亡的能力，即誘導能力越強，IC50值越小。IC50值也可以反向說明微生物細胞對草甘膦的耐受程度，即耐受程度越大，IC50值越大。

兩類土壤微生物的IC50值見圖2。

圖2　兩類土壤微生物的IC50值

從圖2可以看出，清苑土壤的IC50值為444.90 mg·kg-1，榆樹土壤的IC50值為978.69 mg·kg-1，為前者的2.2倍。表明，肥沃的榆樹土壤中的微生物對草甘膦的耐受性比清苑土壤微生物強，進一步說明了土壤的理化性質(zhì)對微生物的代謝活性影響顯著。相關研究也驗證了這一點，如：經(jīng)不同濃度NaF處理的土壤的pH值、導電性均發(fā)生改變，導致微生物的硝化作用、氨化作用以及酶活性減弱，進而影響其熱力學參數(shù)的表征[15]；吳俐莎等[16]研究發(fā)現(xiàn)，4類土壤中的轉(zhuǎn)化酶均與土壤理化性質(zhì)表現(xiàn)出顯著或極顯著相關，其中泥炭土和沼澤土的轉(zhuǎn)化酶與多個理化性質(zhì)相關；Gul等[17]研究發(fā)現(xiàn)，生物碳修復土壤的機理是通過改變土壤的pH值、陽離子交換量以及聚合度等理化性質(zhì)，進而影響土壤微生物的豐度和群落結構。

3結論

采用微量量熱法研究了草甘膦對兩類土壤微生物能量代謝的影響。結果表明，草甘膦對兩類土壤微生物能量代謝均表現(xiàn)出一定程度的抑制作用，草甘膦對壤質(zhì)潮土微生物的抑制作用更強，黑土微生物對草甘膦的耐受性和代謝活性更強；草甘膦對壤質(zhì)潮土和黑土微生物的半數(shù)抑制濃度分別為444.90 mg·kg-1、978.69 mg·kg-1；土壤微生物的能量代謝與土壤的理化性質(zhì)顯著相關。在實際應用中，黑土比潮土更適宜使用草甘膦農(nóng)藥。

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Effect of Glyphosate on Energy Metabolism of Soil Microorganisms

WU Xue-nan,SUN Jing-jing,LUO Yuan-yuan,LIU Wen-juan,YAO Jun

(SchoolofCivil&EnvironmentalEngineering,UniversityofScience&TechnologyBeijing,Beijing100083,China)

Abstract：Glyphosate is a widely used and mass produced herbicide.The effect of glyphosate on the energy metabolism of soil microorganisms has attracted concerns from more and more researchers.Using medium loam soil and black soil as tested samples,the effects of glyphosate on the energy metabolism of microorganisms were studied by microcalorimetry.Results showed that,glyphosate had inhibitory effects on both two kinds of soil in varying degrees.Stronger microbial resistance and tolerance to glyphosate was observed in black soil.Half inhibitory concentrations(IC50) of glyphosate for metabolism activity of soil microorganisms on medium loam soil and black soil were 444.90 mg·kg-1and 978.69 mg·kg-1,respectively.The energy metabolism of soil microorganisms was significantly related to the physicochemical properties of the soil.

Keywords：glyphosate;soil microorganisms;microcalorimetry;energy metabolism

中圖分類號：O 642.31

文獻標識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)04-0018-04

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.005

作者簡介：吳雪楠(1992-)，女，北京人，碩士研究生，研究方向：環(huán)境毒理學，E-mail：694419300@qq.com；通訊作者：姚俊，教授，E-mail：yaojun@ustb.edu.cn。

收稿日期：2015-12-24

基金項目：國家自然科學基金資助項目(4143000452)