王茂淋，程萬里，余　晨，張吉斌

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

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抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選及活性物質(zhì)的初步研究

王茂淋，程萬里，余晨，張吉斌

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，湖北 武漢 430070)

摘要：從80株深海細(xì)菌和425株植物根際細(xì)菌中分離得到2株對恥垢分枝桿菌有穩(wěn)定拮抗作用的細(xì)菌，其中多粘類芽胞桿菌KM2501-1的拮抗效果最佳；對其活性物質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該活性物質(zhì)能被硫酸銨沉淀、耐高溫、對部分蛋白酶敏感、在pH值2.0～8.0范圍內(nèi)和紫外環(huán)境下穩(wěn)定，分子量在10～30 kDa之間，初步判斷該活性物質(zhì)可能是蛋白類物質(zhì)；對該活性物質(zhì)進(jìn)行初步分離純化，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，該活性物質(zhì)中有蛋白存在；初步純化的蛋白類活性物質(zhì)的最小抑菌濃度在125～250 μg·mL-1之間，具有深入研究的價值。

關(guān)鍵詞：多粘類芽胞桿菌；恥垢分枝桿菌；理化特性；最小抑菌濃度；耐高溫蛋白

恥垢分枝桿菌常作為研究結(jié)核分枝桿菌的模式菌株。結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病是一種導(dǎo)致人類死亡的第二大類傳染性疾病，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。結(jié)核病缺乏相關(guān)有效的疫苗且新藥開發(fā)較慢，使得結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核在我國流行，目前，我國已是耐多藥結(jié)核負(fù)擔(dān)最重的國家。耐多藥結(jié)核是結(jié)核病防治的重大難題[2-4]，所以開發(fā)新的抗結(jié)核藥物迫在眉睫。

多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)是一種產(chǎn)芽胞的革蘭氏陽性細(xì)菌。1993年，Ash等[5]將其從芽胞桿菌屬中獨立出來，成立類芽胞桿菌屬。多粘類芽胞桿菌的代謝產(chǎn)物非常豐富，如抗菌物質(zhì)、植物激素類、酶類以及絮凝劑等，大多為蛋白質(zhì)、多糖、多肽等[6]。Rastogi等[7]發(fā)現(xiàn)，多粘類芽胞桿菌產(chǎn)生的多粘菌素E對結(jié)核分枝桿菌有很好的防治作用；Khan等[8]發(fā)現(xiàn)，從多粘類芽胞桿菌發(fā)酵上清液中提取的物質(zhì)具有防治根結(jié)線蟲的作用。但是多粘類芽胞桿菌中對分枝桿菌有抑制作用的蛋白類代謝產(chǎn)物還未見報道。

鑒于此，作者從80株深海細(xì)菌和425株植物根際細(xì)菌中篩選出抗恥垢分枝桿菌菌珠，研究其活性物質(zhì)的理化性質(zhì)，并進(jìn)行初步純化，評價其抑菌活性，擬為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1實驗

1.1菌種與培養(yǎng)基

病原指示菌：恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis)MC2 155，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)何正國教授課題組提供。

植物根際細(xì)菌：多粘類芽胞桿菌(Paenibacillus polymyxa)KM2501-1，分離自江西湖口有機(jī)復(fù)合污染地區(qū)植物毛茛根際，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)張吉斌教授課題組分離并鑒定。

植物根際細(xì)菌培養(yǎng)基(KMB)：20g胰蛋白胨，1.5gK2HPO4，1.5gMgSO4·7H2O，10mL甘油，定容至1L，pH值調(diào)至7.4。

恥垢分枝桿菌液體培養(yǎng)基(7H9)：稱取0.47g7H9肉湯基礎(chǔ)至100mL蒸餾水中，添加0.2mL甘油和0.05mL吐溫80。

恥垢分枝桿菌固體培養(yǎng)基(7H10)：稱取3.8g7H10瓊脂基礎(chǔ)至200mL蒸餾水中，添加1mL甘油。

1.2方法

1.2.1抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選

將深海細(xì)菌和植物根際細(xì)菌分別接種于對應(yīng)的培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，離心取上清液；向2 mLOD600值為0.1左右的恥垢分枝桿菌懸液中加入0.5 mL過濾除菌的發(fā)酵上清液，于37 ℃、180 r·min-1共培養(yǎng)40 h，測定終止OD600值并判斷抑菌活性，每個實驗重復(fù)3次。以終濃度為100 μg·mL-1的異煙肼作陽性對照，加入相同體積的培養(yǎng)基作陰性對照。

1.2.2多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質(zhì)的理化特性分析

(1)溫度處理

取KM2501-1發(fā)酵上清液，分別在溫度為4 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃和100 ℃的條件下處理60 min，然后冷卻至室溫(25 ℃)，測試抑菌活性。

(2)酸堿處理

室溫下取KM2501-1發(fā)酵上清液，用鹽酸或氫氧化鈉將pH值分別調(diào)至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，溫育3 h，然后用鹽酸或氫氧化鈉將各組樣品的pH值復(fù)調(diào)到初始值5.6，測試抑菌活性。

(3)紫外線照射處理

取0.5 mL KM2501-1發(fā)酵上清液至2 mL離心管中，在距紫外燈(24 W)50 cm處分別照射處理30 min、60 min、90 min、120 min，測試抑菌活性。

(4)蛋白酶處理

分別用終濃度為1 mg·mL-1的蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理KM2501-1發(fā)酵上清液3 h后，將pH值全部調(diào)至6，測試抑菌活性。其中蛋白酶K處理條件為pH值8.0、37 ℃；胰蛋白酶處理條件為pH值8.0、37 ℃；胃蛋白酶處理條件為pH值4.5、37 ℃。

(5)超濾管處理

取KM2501-1發(fā)酵上清液5 mL，用100 kDa的超濾管超濾處理后分別測試截留液和濾過液的抑菌活性；然后將100 kDa的濾過液用50 kDa的超濾管超濾處理，分別測試截留液和濾過液的抑菌活性；用同樣的方法依次用30 kDa、10 kDa和3 kDa的超濾管超濾處理。以原始上清液作對照，測試抑菌活性，并判斷活性物質(zhì)的分子量范圍。

(6)硫酸銨沉淀

取KM2501-1在28 ℃、180 r·min-1發(fā)酵48 h的發(fā)酵上清液，采用梯度鹽析法，分別收集0%～30%、30%～70%硫酸銨沉淀物和70%硫酸銨沉淀上清液，并以恥垢分枝桿菌為指示菌，采用牛津杯法測量抑菌圈直徑。

1.2.3多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質(zhì)的初步分離純化

(1)分離純化

硫酸銨沉淀：取KM2501-1在28 ℃、180 r·min-1發(fā)酵48 h的發(fā)酵上清液，收集70%硫酸銨沉淀物，用蒸餾水復(fù)溶后透析。

高溫處理：取上述70%硫酸銨沉淀物復(fù)溶透析液，于100 ℃高溫處理60 min后離心，取上清液。

(2)抑菌活性和蛋白純度的測定

按1.2.1所述的共培養(yǎng)法測試活性物質(zhì)的抑菌活性；取分離純化上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，測定活性物質(zhì)的蛋白純度。

1.2.4活性蛋白的抑菌活性分析

將得到的活性蛋白凍干，稱量，分別配制成不同濃度，按1.2.1所述的共培養(yǎng)法測定活性蛋白的最小抑菌濃度。

2結(jié)果與討論

2.1抗恥垢分枝桿菌菌株的篩選

對80株深海細(xì)菌和425株植物根際細(xì)菌抗恥垢分枝桿菌進(jìn)行篩選，部分結(jié)果見表1。

表1

抗恥垢分枝桿菌菌株篩選的部分結(jié)果

Tab.1

Partial screening results of the bacteria

注：“-”表示發(fā)酵上清液不能抑制恥垢分枝桿菌生長；“+”表示發(fā)酵上清液能抑制恥垢分枝桿菌生長?！?”表示OD600差值>0.7；“+”表示OD600差值=0.5～0.7；“++”表示OD600差值=0.3～0.5；“+++”表示OD600差值=0.1～0.3；“++++”表示OD600差值<0.1。表4同。

由表1可知，多粘類芽胞桿菌KM2501-1和假單胞菌KY5406的發(fā)酵上清液都對恥垢分枝桿菌有較好的拮抗作用，其中多粘類芽胞桿菌KM2501-1的發(fā)酵上清液的拮抗效果最好，可用于后續(xù)進(jìn)一步研究。

2.2多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質(zhì)的特性分析

2.2.1對溫度的敏感性(圖1)

圖1　不同溫度處理后的KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌效果

由圖1可以看出，KM2501-1發(fā)酵上清液對溫度不敏感，100 ℃處理60 min對抑菌活性有一定影響，但影響不明顯。表明該活性物質(zhì)較穩(wěn)定，在高溫下不易失活。

2.2.2對酸、堿的敏感性(圖2)

圖2　不同pH值處理后的KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌效果

由圖2可以看出，KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌活性在pH值2.0～8.0范圍內(nèi)都是穩(wěn)定的，但pH值達(dá)到10.0以后就沒有抑菌活性了。表明該活性物質(zhì)在堿性環(huán)境下不穩(wěn)定。

2.2.3對紫外線照射的敏感性(圖3)

圖3　紫外線照射不同時間后的KM2501-1

由圖3可以看出，KM2501-1發(fā)酵上清液經(jīng)過120 min的紫外線照射后，其抑菌活性未受到影響。表明該活性物質(zhì)在紫外環(huán)境下較穩(wěn)定。

2.2.4對蛋白酶的敏感性(表2)

由表2可知，KM2501-1發(fā)酵上清液經(jīng)過蛋白酶K和胰蛋白酶處理后失去抑菌活性，而經(jīng)胃蛋白酶處理后仍然保持較高的抑菌活性；該活性物質(zhì)對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感，對胃蛋白酶不敏感。表明該活性物質(zhì)可能是蛋白類物質(zhì)。

表2

不同蛋白酶處理后的KM2501-1發(fā)酵上清液的抑菌效果

Tab.2Antibacterial effect of fermentation surpernatant of

KM2501-1 treated by different proteases

2.2.5分子量大小

梯度超濾處理KM2501-1發(fā)酵上清液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑菌活性物質(zhì)可以通過30 kDa的超濾管，但不能通過10 kDa的超濾管，表明該抑菌活性物質(zhì)的分子量為10～30 kDa。

綜合以上理化特性實驗結(jié)果，可以初步推斷該活性物質(zhì)是一個耐高溫蛋白。

2.2.6硫酸銨沉淀物對恥垢分枝桿菌的抑菌活性(表3)

表3

KM2501-1發(fā)酵上清液的硫酸銨沉淀物的抑菌效果

Tab.3Antibacterial effect of ammonium sulfate precipitation

of fermentation surpernatant of KM2501-1

注：原始發(fā)酵上清液的抑菌圈直徑為11.2 mm。

由表3可知，活性物質(zhì)主要集中在30%～70%的硫酸銨沉淀物中。表明該活性物質(zhì)可以被硫酸銨沉淀下來，可能為蛋白類物質(zhì)。

2.3多粘類芽胞桿菌KM2501-1活性物質(zhì)分離純化后的抑菌活性及純度

通過分析活性物質(zhì)的理化特性，初步鑒定該活性物質(zhì)為耐高溫蛋白，故采用耐高溫蛋白的方法對活性物質(zhì)進(jìn)行分離純化，并進(jìn)行抑菌活性測試。

2.3.1抑菌活性(表4)

表4

KM2501-1活性物質(zhì)不同分離純化階段的抑菌活性

Tab.4Antibacterial activity of the active substance of

KM2501-1 at different purification stages

由表4可知，活性物質(zhì)在不同分離純化階段均有很高的抑菌活性。表明該活性物質(zhì)一直在純化樣品中。

2.3.2純度

采用SDS-PAGE檢測活性物質(zhì)分離純化后的純度，結(jié)果見圖4。

M.蛋白質(zhì)標(biāo)記　1.硫酸銨沉淀物復(fù)溶后沉淀　2.硫酸銨沉淀物

由圖4可以看出，硫酸銨沉淀物復(fù)溶高溫處理后離心上清液的SDS-PAGE圖譜中有兩條分子量介于18.4～25.0 kDa之間的蛋白條帶(條帶3)，與理化特性分析中活性物質(zhì)的分子量相吻合。因此，可以推斷該活性物質(zhì)很有可能是這兩個耐高溫蛋白中的某一個或者兩個。

2.4活性蛋白對恥垢分枝桿菌的抑菌活性(表5)

由表5可以看出，當(dāng)初步純化的活性物質(zhì)濃度大于250 μg·mL-1時，對恥垢分枝桿菌具有較高的抑菌活性；當(dāng)活性物質(zhì)濃度小于125 μg·mL-1時，對恥垢分枝桿菌沒有抑菌活性。說明初步純化的活性物質(zhì)的最小抑菌濃度在125～250 μg·mL-1之間，抑菌效果良好。

3結(jié)論

從80株深海細(xì)菌和425株植物根際細(xì)菌中分離得到2株對恥垢分枝桿菌有穩(wěn)定拮抗作用的細(xì)菌，其中多粘類芽胞桿菌KM2501-1的拮抗效果最佳；其發(fā)酵上清液具有穩(wěn)定拮抗恥垢分枝桿菌的活性。對KM2501-1發(fā)酵上清液中的活性物質(zhì)的理化特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，該活性物質(zhì)分子量在10～30 kDa之間，耐高溫，在pH值為2.0～8.0時穩(wěn)定，對部分蛋白酶敏感，能耐受紫外線，能被硫酸銨沉淀；據(jù)此初步判斷該活性物質(zhì)是一個耐高溫蛋白。

對活性物質(zhì)進(jìn)行了初步的分離純化，最終得到了分子量在18.4～25.0 kDa之間的蛋白。該初步純化蛋白的最小抑菌濃度在125～250 μg·mL-1之間，抑菌效果良好。

表5不同濃度初步純化活性物質(zhì)對恥垢分枝桿菌的抑菌活性

Tab.5

Antibacterial activity of different concentrations of

注：“+”表示具有抑菌活性，“-”表示沒有抑菌活性。

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Screening of Bacteria AgainstMycobacteriumSmegmatisand Preliminary Study on Its Active Substance

WANG Mao-lin，CHENG Wan-li，YU Chen，ZHANG Ji-bin

(StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,CollegeofLifeScienceandTechnology,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan430070,China)

Abstract：Two bacteria with stable antagonistic activity against Mycobacterium smegmatis were screened from 80 deep sea bacteria and 425 plant rhizosphere bacteria,in which Paenibacillus polymyxa KM2501-1 had the strongest antagonistic activity.The physicochemical properties of the active substance produced by KM2501-1 were studied.Results showed that,the active substance could be precipitated by ammonium sulfate,it was thermostable,sensitive to some proteases,stable in pH value range of 2.0～8.0 and UV irradiation,and its molecule weight was 10～30 kDa.So the preliminary research results showed that the active substance might be a protein.Then preliminary isolation and purification of the active substance and the SDS-PAGE results showed that there were proteins in the active substance.The minimal inhibitory concentration of the preliminary purified active substance against M.smegmatis was between 125 μg·mL-1and 250 μg·mL-1.It has potential for futher study.

Keywords：Paenibacillus polymyxa;Mycobacterium smegmatis;physicochemical property;minimal inhibitory concentration;high-temperature resistance protein

中圖分類號：Q 939.9

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1672-5425(2016)04-0041-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.011

作者簡介：王茂淋(1989-)，女，貴州六盤水人，碩士研究生，研究方向：微生物工程與制劑，E-mail：wmmmlll@163.com；通訊作者：張吉斌，教授，E-mail：zhangjb05@163.com。

收稿日期：2016-01-21