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510317 廣州，廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運(yùn)動傷害康復(fù)研究所,廣東省第二人民醫(yī)院

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TNF-α與ERK1/2在心臟毒素誘導(dǎo)的肌損傷再生修復(fù)中的作用研究

陳睿佘燕玲周珊瑤史華彩黎程

510317 廣州，廣東省傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)與運(yùn)動傷害康復(fù)研究所,廣東省第二人民醫(yī)院

【摘要】目的探討TNF-α與細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶 1/2 (ERK1/2)在骨骼肌損傷修復(fù)過程中的作用。方法將雄性C57BL6小鼠72只隨機(jī)分為6組，正常組(1個組)和損傷修復(fù)組(5個組)，于損傷修復(fù)組右側(cè)脛骨前肌注射心臟毒素(10 μM、100 μl)，分別于注射藥物后1、3、5、7、14 d處死5個損傷修復(fù)組，分離其脛骨前肌。用蘇木素-伊紅染色觀察脛骨前肌損傷修復(fù)情況，測定肌纖維橫切面積，用蛋白免疫印跡檢測肌組織蛋白中TNF-α、總ERK1/2、磷酸化ERK1/2、肌生成調(diào)節(jié)因子MyoD表達(dá)水平的變化。結(jié)果注射心臟毒素1 d后可觀察到脛骨前肌溶解、斷裂，14 d后損傷得到修復(fù)，后者與正常組的肌纖維橫切面積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(1 658.5±118.3)μm2vs.(1 625.2±151.7) μm2，P>0.05)]。蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，TNF-α和MyoD在損傷第1日及第3日表達(dá)水平上升，磷酸化ERK1/2于第5日表達(dá)水平上升。結(jié)論TNF-α與磷酸化ERK1/2可能分別于骨骼肌損傷修復(fù)的初期與后期發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。

【關(guān)鍵詞】骨骼肌；損傷修復(fù)；腫瘤壞死因子-α；細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2

Extracellular regulated kinase1/2

TNF-α主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是啟動抗菌炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵細(xì)胞因子，被認(rèn)為是運(yùn)動損傷、挫傷、肌肉減少癥、多肌炎、惡性肌萎縮等骨骼肌疾病的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[1]。隨著對TNF-α研究的不斷深入，近年來有學(xué)者認(rèn)為TNF-α可能通過不同信號途徑影響肌肉再生過程，但機(jī)制尚未明確[2-3]。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)作為TNF-α下游因子，可參與細(xì)胞的增殖、分化[4]。本研究采用心臟毒素誘導(dǎo)骨骼肌損傷，通過觀察骨骼肌損傷修復(fù)過程中TNF-α、總ERK1/2 、磷酸化ERK1/2及肌生成調(diào)節(jié)因子MyoD的表達(dá)，研究TNF-α及ERK1/2在骨骼肌損傷修復(fù)中的作用，探討其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

6～8周齡雄性C57BL6小鼠72只，SPF級，體質(zhì)量18～22 g，購買并飼養(yǎng)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心。將72只小鼠隨機(jī)分為6組，每組12只。本研究對動物的處理方法符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》。

二、主要試劑

心臟毒素(Cardiotoxin，中鑫東泰納米基因生物技術(shù)有限公司)，蘇木素、伊紅(廣州市凱秀貿(mào)易有限公司)，ERK1/2抗體 (1∶1 000，美國CST公司)，磷酸化ERK1/2抗體 (1∶1 000，美國CST公司)，TNF-α(1∶500，美國CST公司)，成肌分化抗原抗體(1∶500，德國默克密理博)，α微管蛋白(α-Tubulin，1∶1 000，美國Abclonal公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔(1∶5 000，美國Abclonal公司)，全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)。

三、方法

1. 動物造模

6組小鼠分為正常組(1個組)及損傷修復(fù)組(5個組)。損傷修復(fù)組采用戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，分別于小鼠右側(cè)脛骨前肌局部注射100 μl的10 μM心臟毒素[5]。心臟毒素可選擇性地破壞細(xì)胞膜，藥物注射到脛骨前肌后，若觀察到小鼠該側(cè)后肢五爪提起呈彎曲勾狀，則判斷為造模成功。造模后5組損傷修復(fù)組分別于1、3、5、7、14 d麻醉取材后處死，每組12只小鼠中6只用于形態(tài)學(xué)觀察、6只用于蛋白免疫印跡檢測，5組損傷修復(fù)組分別標(biāo)為D1、D3、D5、D7、D14組。

2. 取材

麻醉小鼠，仰位固定其四肢。分離小鼠小腿上部緊貼脛骨外側(cè)面肌肉，即為脛骨前肌，用生理鹽水沖洗脛骨前肌殘留的血液后將其迅速投入液氮，轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存或置于10%中性福爾馬林固定液中。

3. 蘇木素-伊紅(HE)染色

樣本于10%中性福爾馬林固定液中固定48 h后進(jìn)行組織修塊、常規(guī)脫水，石蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機(jī)上橫切，切片厚度為5 μm。用二甲苯脫蠟，再使用高濃度到低濃度乙醇脫去二甲苯，最后經(jīng)過蒸餾水。用蘇木素染色3 min，再用1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒。用自來水沖洗至細(xì)胞核呈藍(lán)色。用0.5%伊紅染細(xì)胞漿，常規(guī)脫水，中性樹脂封片[6]。最后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行組織學(xué)觀察。

4. 肌纖維橫切面積測定

樣本經(jīng)HE染色后，將4組置于200倍放大倍數(shù)鏡下采集3張圖像，所得圖像用Image J分析軟件分析，測量每個樣本各視野肌纖維的面積，每個樣本大約選取200個肌纖維進(jìn)行測量，邊緣不完整的肌纖維不納入統(tǒng)計。匯總每組6只小鼠肌纖維橫切面積測量值，計算均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差[7]。由于心臟毒素注射后第1、3 日，肌纖維溶解、斷裂，結(jié)構(gòu)不清，故僅分析正常組、注射后第5、7、14 日4組肌纖維橫切面積。

5. 蛋白提取定量

將組織從-80℃冰箱取出后，置于預(yù)冷的研缽中，邊加液氮邊進(jìn)行研磨，直至將其研磨成粉末狀。隨后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的裂解液中，使用電動勻漿器進(jìn)一步勻漿，使其裂解完全。12 000 rpm、4℃離心10 min，提取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)法進(jìn)行定量，置于100℃變性5 min。

6. 蛋白免疫印跡檢測

取40 μg蛋白樣本加入十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠(SDS-PAGF)上樣孔中進(jìn)行電泳。60 V下樣本跑進(jìn)分離膠后轉(zhuǎn)100 V至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部。制備轉(zhuǎn)印夾層，用220 mA恒流轉(zhuǎn)膜100 min。用5%脫脂牛奶-磷酸鹽緩沖液將樣本置于室溫封閉1 h后加入一抗anti-ERK1/2 (1∶1 000)、anti-磷酸化ERK1/2 (1∶1 000)、anti-TNF-α(1∶500)、anti-MyoD (1∶500)、微管蛋白抗體(anti-Tubulin) (1∶1 000)，于4℃孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液洗膜2次，1% 脫脂牛奶-磷酸鹽緩沖液洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔，1∶5 000)，用1%脫脂牛奶-磷酸鹽緩沖液清洗2次，磷酸鹽緩沖液清洗3次，每次5 min。用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，Tanon天能系列全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)掃描成像。以α-Tubulin作為內(nèi)參，各目的蛋白條帶與內(nèi)參比較作為陽性條帶的相對表達(dá)值[8]。

四、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié)果

一、病理學(xué)觀察

HE染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察各組病理學(xué)改變。結(jié)果顯示：正常組肌細(xì)胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，肌絲排列有序，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞、充血等病理學(xué)改變；D1組可見大量骨骼肌纖維溶解、斷裂，部分肌纖維橫紋消失，出現(xiàn)凝固性壞死，空泡變性，間質(zhì)見炎癥細(xì)胞浸潤，以中性粒細(xì)胞為主；D3組可見大量骨骼肌纖維溶解，結(jié)構(gòu)不清，肌纖維橫紋排列紊亂或消失，部分出現(xiàn)凝固性壞死，空泡變性；D5組可見不同程度的細(xì)胞活化增生，仍可見少部分細(xì)胞壞死，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，血管擴(kuò)張充血；D7組細(xì)胞增生較D5組更加明顯，新增生的細(xì)胞與原有骨骼肌出現(xiàn)較好融合，部分出現(xiàn)肌纖維橫紋；D14組新增生的細(xì)胞逐漸和原有骨骼肌出現(xiàn)較好的融合，肌細(xì)胞形態(tài)清楚，結(jié)構(gòu)正常，肌纖維橫紋排列整齊，間質(zhì)未見炎癥細(xì)胞浸潤，血管未見擴(kuò)張充血(圖1)。

圖1　各組脛骨前肌病理學(xué)觀察 (HE染色，×200)

二、肌纖維橫切面積測定結(jié)果

D5組及D7組肌纖維橫切面積明顯低于正常組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。恢復(fù)14 d后的D14組肌纖維橫切面積增加，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1、2。

表1

各組肌纖維橫切面積比較±s)　μm2

注：總體比較F=177.565、P=0.922>0.05；與正常組比較，aP<0.05；與D14組比較，bP<0.05；與正常組比較，cP>0.05

表2

正常組與D14組大小肌纖維分布比例比較[中位數(shù)(下，上四分位數(shù)))]

注：2組各6只

三、蛋白免疫印跡檢測結(jié)果

注射心臟毒素后肌組織蛋白中TNF-α表達(dá)水平上升，于第5日開始下降。磷酸化ERK1/2在第5日表達(dá)水平上升。MyoD在正常組中不表達(dá)，注射心臟毒素后其表達(dá)水平先上升后下降，見圖2。

討論

本研究采用心臟毒素肌肉局部注射的方法建立肌損傷模型。心臟毒素是從眼鏡蛇毒腺中提取的一種毒素，有文獻(xiàn)報道，心臟毒素注入小鼠骨骼肌后30 min 即可引起肌肉組織的壞死，可見損傷區(qū)域漿膜斷裂，肌纖維攣縮，線粒體損害等病理改變，24 h 后即可見肌細(xì)胞胞質(zhì)中僅包含有殘存的肌纖維和腫脹的線粒體[9]。骨骼肌受損及修復(fù)包含一系列過程，首先出現(xiàn)炎癥細(xì)胞應(yīng)答，隨后靜止的肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活并表達(dá)成肌調(diào)節(jié)因子重新進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)，在肌源性前體細(xì)胞階段開始增殖分化形成肌管，肌管相互間融合形成新的肌纖維，新的肌纖維成熟伴隨肌肉功能恢復(fù)[10]。本研究組明顯觀察到脛骨前肌注入心臟毒素 1 d后出現(xiàn)肌纖維溶解、斷裂及凝固性壞死的現(xiàn)象，注射心臟毒素后3 d仍有大量的壞死肌纖維，注射后5 d可觀察到再生肌纖維，注射后7 d再生肌纖維取代大部分的壞死肌纖維，部分出現(xiàn)肌纖維橫紋，注射后14 d新增生的細(xì)胞和原有骨骼肌出現(xiàn)較好的融合，與正常組比較無明顯差異，且隨著損傷修復(fù)時間的延長，肌纖維橫截面積增加，注射心臟毒素后14 d肌纖維橫截面積與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

近些年有學(xué)者認(rèn)為TNF-α能通過不同信號途徑影響肌細(xì)胞凋亡及再生修復(fù)過程，對骨骼肌的損傷和修復(fù)可能起重要的調(diào)節(jié)作用。TNF-α在遺傳性及退化性骨骼肌患者血清中長時間表達(dá)水平上升，動物研究亦認(rèn)為高水平TNF-α抑制肌分化融合，與肌萎縮關(guān)系密切[11]。Velders等[12]在大鼠右側(cè)腓腸肌注射虎蛇毒素24 h后觀察到其TNF-α mRNA及蛋白表達(dá)水平上升，而MyoD調(diào)節(jié)因子mRNA水平在3 d后急劇上升。體外研究顯示，在低濃度血清分化液中，原代骨骼肌細(xì)胞及C2C12小鼠成肌細(xì)胞系里，TNF-α表達(dá)水平上升。本研究結(jié)果顯示，在注射心臟毒素后，炎癥因子TNF-α與MyoD同步上升，隨后下降，提示TNF-α可能對生肌調(diào)節(jié)因子MyoD表達(dá)有一定的調(diào)節(jié)作用。

ERK、c-Jun氨基端激酶(JNK)、P38為有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員，MAPKs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，在將細(xì)胞外刺激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞及其核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)反應(yīng)(如細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化及凋亡等)的過程中具有至關(guān)重要的作用。抑制ERK1/2磷酸化的表達(dá)可減少生肌素Myogenin的表達(dá)，減少單核成肌細(xì)胞融合形成為多核的肌纖維，敲除ERK2可使成肌細(xì)胞系C2C12失去肌融合能力[13]。高濃度TNF-α可抑制細(xì)胞分化融合，某些微小RNA可通過MAPK/ERK通路減少TNF-α對肌融合負(fù)調(diào)節(jié)作用[13-14]。體外實(shí)驗(yàn)證明：在C2C12骨骼肌早期分化過程中，TNF-α和IGF-1經(jīng)過MAPK/ERK信號通路調(diào)節(jié)特定的功能性微小RNA，如hsa-微小RNA-155、微小RNA-351、微小RNA-450b-5p、mmu-微小RNA-133b-3p，增加肌細(xì)胞融合指數(shù)[14]。本研究的結(jié)果顯示：正常組及損傷初期，肌衛(wèi)星細(xì)胞激活及增殖過程中表達(dá)少量的磷酸化ERK1/2，在小鼠損傷恢復(fù)第5日，磷酸化ERK1/2表達(dá)水平明顯上升。結(jié)合形態(tài)學(xué)結(jié)果，損傷后第5日時新形成的肌管逐漸開始融合，形成肌纖維，我們推測磷酸化ERK1/2 可能對肌細(xì)胞融合起促進(jìn)作用。

綜上所述，在骨骼肌損傷初期，靜止的肌衛(wèi)星細(xì)胞被激活，生肌調(diào)節(jié)因子MyoD表達(dá)增加，可能與炎癥因子TNF-α在骨骼肌損傷初期表達(dá)水平上升有關(guān)。隨著損傷修復(fù)進(jìn)程的發(fā)展，TNF-α表達(dá)水平減少，其下游因子磷酸化ERK1/2表達(dá)水平上升。我們推測TNF-α濃度降低可能促使磷酸化ERK1/2表達(dá)來介導(dǎo)肌管融合，促進(jìn)新的肌纖維形成，但兩者間的相互作用需行進(jìn)一步研究確定。

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(本文編輯：洪悅民)

Effect of TNF-α and ERK 1/2 on regeneration and repair of cardiotoxin-induced skeletal muscle injury

ChenRui,SheYanling,ZhouShanyao,ShiHuacai,LiCheng.

TraditionalMedicineandSportsInjuryRehabilitationInstituteofGuangdongProvince,GuangdongNo.2ProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510317,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the role of tumor necrosis factor (TNF)-α and extracellular regulated kinase (ERK)1/2 in repairing the cardiotoxin-induced skeletal muscle injury. MethodsSeventy two C57BL6 male mice were randomly assigned into the normal group and five injury regeneration groups. The mice in the injury regeneration groups were administered with 100 μl of 10 μM cardiotoxin via the tibialis anterior. The tibialis anterior tissue was isolated at 1-, 3-, 5-, 7- and 14-d after cardiotoxin injection. The repair of skeletal muscle injury was observed and the cross-sectional area of muscle fiber was measured under hematoxylin and eosin staining. The expression levels of TNF-α, ERK1/2, phospho-ERK1/2 and MyoD in the muscle tissues were detected by western blot. ResultsThe signs of tibialis anterior myolysis and rupture were noted at 1 d after cardiotoxin injection, which were repaired at 14 d post-injection. The cross-sectional area did not significantly differ between the 14 d post-injection group and normal group,(1 658.5±118.3)μm2vs. (1 625.2±151.7) μm2，P>0.05. The expression of TNF-α and MyoD was up-regulated at 1 and 3 d after injection, and the level of phospho-ERK1/2 was raised at 5 d. ConclusionTNF-α level may play a role in the initial phase of muscle injury repair, whereas phospho-ERK1/2 probably exerts a regulatory effect during the advanced phase.

【Key words】Skeletal muscle; Injury regeneration; Tumor necrosis factor-α;

(收稿日期：2015-12-27)

Corresponding author,Chen Rui

通訊作者，陳睿

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.007

·基礎(chǔ)研究論著·