呂國天　王爽　王慶坤

321000 東陽，東陽市廣福醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(呂國天，王慶坤)；310009 杭州，浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王爽)

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微小RNA-146a rs2910164及微小RNA-499 rs3746444與缺血性腦卒中的關(guān)系

呂國天王爽王慶坤

321000 東陽，東陽市廣福醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(呂國天，王慶坤)；310009 杭州，浙江大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(王爽)

【摘要】目的探討微小RNA(miR)-146a rs2910164和miR-499 rs3746444單核苷酸多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系。方法采用基因直接測序技術(shù)及Taqman-PCR基因分型技術(shù)檢測378例缺血性腦卒中患者(病例組)及378名健康人(對照組)miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位點的等位基因和基因型的頻率分布，采用條件Logistic回歸分析其與缺血性腦卒中的關(guān)系。結(jié)果病例組的miR-146a rs2910164位點等位基因G頻率分布高于對照組(P=0.003, OR=1.412, 95%CI=1.121～1.716)，基因型GG及CG+GG 的頻率分布也高于對照組(GG：P=0.002, OR=2.080, 95%CI=1.330～3.250；CG+GG：P=0.011, OR=1.488, 95%CI=1.110～2.012)。2組miR-499 rs3746444位點的等位基因與基因型頻率分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。 結(jié)論miR-146a rs2910164單核苷酸多態(tài)性可能與缺血性腦卒中相關(guān)，miR-499 rs3746444則可能與缺血性腦卒中無關(guān)。

【關(guān)鍵詞】微小RNA-146a；微小RNA-499；單核苷酸多態(tài)性；缺血性腦卒中

缺血性腦卒中是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用所致的一種多基因遺傳性復(fù)雜疾病，此病發(fā)病過程與多基因之間和基因與環(huán)境之間的相互作用等有關(guān)，與此病相關(guān)的基因在其發(fā)病過程中發(fā)揮單一或聯(lián)合作用，它們還可與環(huán)境因子共同作用增加此病的發(fā)病風(fēng)險[1]。吸煙、飲酒、高脂飲食、高血壓病、糖尿病等已被證實是此病重要的致病因素[2]。除此之外，大量研究顯示，遺傳因素如相關(guān)基因的突變、缺失、遺傳多態(tài)性都與缺血性腦卒中的發(fā)病相關(guān)[3]。研究表明微小RNA(miR)-146a與miR-499參與血管損傷應(yīng)答過程，可調(diào)控血管循環(huán)系統(tǒng)中血栓形成或炎癥信號通路中的重要基因的表達，其變異可引起靶基因的功能異常[4-5]。我們推斷其單核苷酸多態(tài)性可能是影響缺血性腦卒中的風(fēng)險因子，故對缺血性腦卒中患者與正常人miR-146a rs2910164及miR-499 rs3746444位點的等位基因及基因型頻率分布情況進行了分析，以初步探討其遺傳多態(tài)性與缺血性腦卒中發(fā)病的關(guān)系。

對象與方法

一、研究對象

將2012年1月至2014年12月在東陽廣福醫(yī)院急診科和神經(jīng)內(nèi)科就診并經(jīng)臨床和影像學(xué)檢查(CT或MRI)確診的378例缺血性腦卒中患者設(shè)為病例組，并將同期在該院體檢的年齡、性別與之相互匹配的378名健康人設(shè)為對照組。病例組符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》中缺血性腦卒中的診斷標準[6]。對照組排除了新發(fā)或既往腦血管病史，且無家族遺傳病史。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，研究對象均知情同意。

二、方法

用EDTA抗凝2組的外周血樣。采用基因直接測序技術(shù)及Taqman-PCR基因分型技術(shù)檢測2組miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位點等位基因及基因型的頻率分布。

1.DNA提取

采用人類基因組DNA提取試劑盒(北京世紀康為公司)提取各研究對象200 μl EDTA抗凝外周血的人類基因組DNA, 并采用Eppendorf紫外分光光度計檢測提取DNA的濃度和純度，將A260/A280檢測結(jié)果為1.8～2.1的樣本放置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.Taqman-PCR

采用Taqman-PCR基因分型技術(shù)對miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444進行基因分型，其中rs2910164位點上游引物為5’-GAACTGAATTCCATGGGTTGTGT-3’，下游引物為5’-GCCCACGATGACAGAGATATCC-3’，探針FAM-5’-TCAGACCTGTGAAATT-3’，探針VIC-5’-TCAGACCTCTGAAA-TT-3’；rs3746444位點上游引物為5’-GCTGTTAAGACTTGCAGTGATGTTT-3’，下游引物為R-5’-CGGGAAGCAGCACAGACTT-3’，探針FAM-5’-CCA-CGTGAACGTCACAG-3’，探針VIC-5’-CCACGTGA-ACATCACAG -3’。Taqman-PCR擴增體系總體積為5 μl, 其含有100 ng的基因組DNA模板，2.5 μl的2×TaqMan PCR MasterMix和2.5 μl的20×SNP Assay (包含上下游引物和FAM/VIC 探針)。其反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min, 92℃變性15 s, 60℃退火和延伸1 min，上述過程持續(xù)40個循環(huán)[4]。為驗證Taqman-PCR技術(shù)基因分型結(jié)果的準確性，本研究采用DNA直接測序技術(shù)隨機篩選2組10%的樣本進行檢測分析[4]。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

計算2組miR-146a rs2910164和miR-499 rs3746444位點的等位基因及基因型頻率，并采用哈代-溫伯格遺傳平衡定律分析抽樣基因型的群體代表性，其中P>0.05時認為抽樣具有群體代表性[7]。采用SPSS 17.0軟件包處理數(shù)據(jù)，用配對t檢驗分析計量資料，配對χ2檢驗分析計數(shù)資料，并采用條件Logistic回歸計算OR。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、病例組與對照組的一般資料

病例組與對照組高血壓病、糖尿病和肥胖癥百分率的比較差異均具有的統(tǒng)計學(xué)意義，且病例組的血脂高于對照組，P均<0.05，見表1。

二、病例組與對照組miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點等位基因和基因型頻率分布

DNA直接測序與Taqman-PCR共同分析miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點的檢測結(jié)果完全一致。miR-146a rs2910164位點的等位基因G在病例組的頻率分布明顯高于對照組，此位點病例組中的基因型GG 、CG+GG 基因型頻率分布也顯著高于對照組(P均<0.05)。miR-499 rs3736444位點的等位基因A、G及基因型AA、AG、GG和AG+GG在2組中的頻率分布比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。 miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點在對照組中的頻率分布均符合哈代-溫伯格遺傳平衡定律(miR-146a rs2910164:χ2=3.085,P=0.079; miR-499 rs3736444:χ2=0.245,P=0.621)。

討論

miR是一類長度為21～23個核苷酸的非編碼RNA分子，其不僅在組織器官的生長和發(fā)育、細胞增殖和分化中發(fā)揮重要作用，而且在多種復(fù)雜疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用[8-10]。此類RNA小分子在人類基因組中所占比例較低，但其可調(diào)控人類大約三分之一的基因。miR基因或其前體分子的遺傳變異可能影響miR分子的成熟或與靶基因結(jié)合的能力，引發(fā)靶基因調(diào)控功能紊亂[11]。大量研究也證實miR的單核苷酸多態(tài)性與復(fù)雜疾病的發(fā)生和進展相關(guān)[9-10,12-13]。缺血性腦卒中也是一類由遺傳因素和環(huán)境因素相互作用誘發(fā)的復(fù)雜疾病, miR-146a和miR-499也參與缺血性腦卒中相關(guān)作用基因的表達調(diào)控[4], 而rs2910164和rs3746444分別位于上述兩前體分子序列中，此兩多態(tài)性位點可能影響miR-146a和miR-499分子的表達或結(jié)構(gòu)異常。因此，上述兩位點可能與缺血性腦卒中存在相關(guān)性。

表1

病例組與對照組的一般資料

表2

miR-146a rs2910164與miR-499 rs3736444位點基因型和等位基因在病例組和對照組中的頻率分布

注：此結(jié)果調(diào)整了糖尿病、高血壓病、肥胖癥和血脂狀態(tài)

在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，病例組中高血壓病、糖尿病和肥胖癥所占百分率明顯高于對照組，而甘油三酯、膽固醇、LDL和HDL水平與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，提示糖尿病、高血壓病、肥胖癥和血脂代謝異?？赡苁侨毖阅X卒中疾病的風(fēng)險因子。進一步分析等位基因和基因型頻率分布的結(jié)果顯示，miR-499 rs3746444位點G等位基因、AG、GG和AG+GG基因型與缺血性腦卒中均無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性，提示此位點可能未參與此病的發(fā)生過程，此位點等位基因和基因型均不能作為評估缺血性腦卒中發(fā)病的遺傳風(fēng)險因子。而病例組rs2910164位點的G等位基因、GG和CG+GG基因型頻率明顯高于對照組，說明此位點與缺血性腦卒中有關(guān)，提示miR-146可能參與缺血性腦卒中的發(fā)病過程，等位基因G和攜帶有等位基因G的基因型GG、CG+GG可能是缺血性腦卒中的遺傳風(fēng)險因子。本研究結(jié)果與Huang等[14]和Zhu等[15]的報道基本一致，而與Liu等[16]的有關(guān)296例缺血性腦卒中患者和391名健康對照者的研究結(jié)果不同，造成各研究結(jié)果不同的可能原因與樣本量小或納入人群的地域、遺傳背景、環(huán)境等因素差異有關(guān)。rs2910164位點位于前體miR-146分子序列中，其C等位基因與G等位基因的轉(zhuǎn)換，可引發(fā)其成熟miR分子的表達差異，已有研究報道，相對于不攜帶此位點G等位基因的個體，攜帶此位點G等位基因的個體中miR-146的表達水平更低[17]。而高水平的miR-146可以抑制與缺血性腦卒中發(fā)病相關(guān)的促炎NF-κB和MAP激酶信號通路的激活和TNF-α的表達[18-19]。因此攜帶此位點G等位基因的個體表達較低的miR-146分子，而低水平的miR-146未能有效抑制和調(diào)控上述與缺血性腦卒中相關(guān)的促炎通路的激活和調(diào)節(jié)細胞因子的表達，提高了缺血性腦卒中的發(fā)病風(fēng)險。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，miR-499 rs3746444位點與缺血性腦卒中可能無關(guān)，但miR-146a rs2910164等位基因G及基因型GG和CG+GG可能與缺血性腦卒中有關(guān)，可能是缺血性腦卒中的遺傳風(fēng)險易感因子。

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Association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 polymorphisms with risk of ischemic stroke

LyuGuotian,WangShuang,WangQingkun.

DepartmentofNeurology,GuangfuHospitalofDongyangCity,Dongyang321000,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 single nucleotide polymorphisms and ischemic stroke. MethodsTaqman-PCR and DNA sequencing assays were performed to investigate the genotype and allele gene of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 loci in 378 patients with ischemic stroke (ischemic stroke group) and 378 healthy individuals (control group). The association of miR-146a rs2910164 and miR-499 rs3746444 single nucleotide polymorphisms with the risk of ischemic stroke was assessed by logistic regression analysis. ResultsIn the ischemic stroke group, the frequency of allele G (P=0.003, OR=1.412, 95%CI=1.121-1.716), genotype GG (P=0.002, OR=2.080, 95%CI=1.330-3.250), CG+GG (P=0.011, OR=1.488, 95%CI=1.110-2.012) of miR-146a rs2910164 was significantly higher compared with those in the control group. However, the frequency of allele gene and genotype of miR-499 rs3746444 did not significantly differ between the ischemic stroke and control groups (both P>0.05). ConclusionsThe single nucleotide polymorphism of miR-146a rs2910164 rather than miR-499 rs3746444 is probably correlated with the risk of ischemic stroke.

【Key words】miRNA-146a; miRNA-499; Single nucleotide polymorphism;Ischemic stroke

(收稿日期：2015-11-19)(本文編輯：洪悅民)

Corresponding author, Lyu Guotian,E-mail:monkeydygf@sina.com

通訊作者，呂國天，E-mail：monkeydygf@sina.com

DOI:10.3969/j.issn.0253-9802.2016.04.012

·臨床研究論著·