蘇玉萍，薛　鋮，游雪靜,，鐘燕平，顧海峰

1 福建師范大學環(huán)境科學與工程學院，福州　350007　2 福建師范大學福建省污染控制與資源循環(huán)重點實驗室，福州　350007　3 國家海洋局第三海洋研究所，廈門　361005

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九龍江西陂庫區(qū)沉積物甲藻孢囊的分布

蘇玉萍1,2,*，薛鋮1，游雪靜1,3，鐘燕平1，顧海峰3

1 福建師范大學環(huán)境科學與工程學院，福州3500072 福建師范大學福建省污染控制與資源循環(huán)重點實驗室，福州3500073 國家海洋局第三海洋研究所，廈門361005

摘要:孢囊在甲藻的生活史中發(fā)揮重要作用，福建省九龍江從2009年起，暴發(fā)多次擬多甲藻水華事件。采用顯微鏡觀察和單細胞PCR技術，對九龍江西陂庫區(qū)2012—2013年不同月份沉積物中的甲藻孢囊進行種屬判定，并對甲藻孢囊的分布及其影響因素進行分析。結(jié)果表明，西陂庫區(qū)沉積物中的甲藻孢囊主要為擬多甲藻屬，約占80%，其次為裸甲藻屬，發(fā)現(xiàn)了2009年水華的優(yōu)勢種佩式擬多甲藻(Peridiniopsis penardii)孢囊。庫區(qū)沉積物中甲藻孢囊的豐度在(13.7±1.2)—(105.2±8.3)個/g干重之間。多元相關分析結(jié)果顯示甲藻孢囊的豐度與含水率呈現(xiàn)顯著正相關性(P<0.05)，反映了甲藻孢囊沿水流方向逐漸積累。本研究結(jié)果填補了國內(nèi)水庫甲藻孢囊鑒定和萌發(fā)的研究空白，為九龍江甲藻水華的防治提供科學參考。

關鍵詞：甲藻孢囊；沉積物；分布；九龍江

隨著經(jīng)濟和社會發(fā)展的需要，福建省多數(shù)河流建設梯級水電站，大壩的建設使得水流變緩，氮、磷等營養(yǎng)物質(zhì)滯留，尤其是在作為飲用水源的水庫暴發(fā)藻類水華事件[1- 2]。國際上20世紀對淡水甲藻水華事件已有報道，近年來，我國頻頻發(fā)生甲藻水華事件引起了人們廣泛關注和眾多學者的研究。國內(nèi)外淡水甲藻水華事件主要是由多甲藻目(Peridiniales)的擬多甲藻屬(Peridiniopsis) 以及多甲藻屬(Peridinium)的甲藻引起的，其中擬多甲藻屬水華事件最為常見，影響最大[3]。甲藻是一類具有休眠細胞的藻類，其休眠細胞稱為孢囊，目前研究中所提及的“孢囊”多指休眠性孢囊。休眠性孢囊是用于應對長時間的不良環(huán)境所產(chǎn)生的，它由兩個游動的配子互相結(jié)合產(chǎn)生，經(jīng)過有性繁殖后形成一個合子。休眠性孢囊在適宜的環(huán)境條件下，就會迅速啟動萌發(fā)機制，并在短時間內(nèi)大量增殖，甚至形成甲藻水華[4]。甲藻孢囊萌發(fā)為水體提供新的營養(yǎng)細胞，從而為甲藻水華暴發(fā)提供“種源”；而水華后期，環(huán)境條件不適宜時，又會大量形成孢囊，降低水體中營養(yǎng)細胞的數(shù)量。所以，甲藻孢囊在甲藻水華的發(fā)生和消亡中具有重要作用。全球范圍內(nèi)均有暴發(fā)甲藻水華，但多數(shù)研究集中在海洋、海峽或是河口地區(qū)[5- 7]。鄭磊等研究表明，沉積物營養(yǎng)鹽含量對于甲藻孢囊的分布具有一定影響，大鵬灣表層沉積物的甲藻孢囊值水平分布上更趨于分布在活性磷含量高但氮磷比值較低的沉積物中[8]；王朝暉等人發(fā)現(xiàn)甲藻孢囊的種類和數(shù)量在與甲藻孢囊粒徑相仿的沉積物中較多出現(xiàn)[9]；Anderson等人提出，甲藻孢囊的分布與所研究區(qū)域的水動力條件、水文和選擇性沉積條件相關[10- 11]；方琦等人研究了閩江口海域表層沉積物的甲藻孢囊分布情況，沉積物的主要類型為砂-粉砂-粘土，砂質(zhì)的沉積物中幾乎沒有甲藻孢囊[12]；黃海燕等通過對長江口表層沉積物進行分析，得出沉積物類型是影響甲藻孢囊分布的重要因素[13]；Posepelova研究了溫度、鹽度、生產(chǎn)力以及近海上升流作用下的東北太平洋表層沉積物的甲藻孢囊分布，通過CCA分析得出，海底沉積物溫度、生產(chǎn)力是甲藻孢囊分布的主要影響因素[14- 16]。多項研究表明，甲藻孢囊的分布是多種因素綜合影響的結(jié)果[13,15,17-18]。

研究沉積物中甲藻孢囊的種類，有助于全面認識研究區(qū)域中浮游的甲藻，為研究甲藻水華的發(fā)生機理及預測提供參考資料[19]。甲藻孢囊的分布會對甲藻水華暴發(fā)的位置分布造成影響，通過對沉積物中甲藻孢囊豐度和分布的研究，可以摸清環(huán)境條件對于甲藻孢囊的形成及空間分布的影響，有助于掌握當?shù)丨h(huán)境的變化，用于指示人類活動對環(huán)境的影響[20- 23]。近年來，福建省主要飲用水源地山仔水庫、東張水庫、安砂水庫、山美水庫、東圳水庫等均呈現(xiàn)不同程度富營養(yǎng)化趨勢，九龍江北溪流域于2009年暴發(fā)過佩氏擬多甲藻(Peridiniopsispenardii)水華。因此本研究選取九龍江西陂庫區(qū)沉積物作為研究對象，研究沉積物中甲藻孢囊的分布和豐度及影響因素，為防治九龍江甲藻水華提供科學的參考，對保障飲用水安全，實現(xiàn)水資源的可持續(xù)利用具有重要的意義。

1研究區(qū)域概況

九龍江是福建省僅次于閩江的第二大河流，發(fā)源于龍巖市王母山西南的麓孟頭村，干支流流經(jīng)龍巖、漳平、南靖等13縣、市, 由廈門港入海(圖1)，流域面積14741km2，河流干線長度285km。九龍江分北、西、南三溪，北溪為主流，溪流全長274 km，流域面積9640 km2，年均流量為252m3/s，是所經(jīng)流域的重要飲用水源，為近400萬人提供生活必須的飲用水。由于北溪屬于豐水帶河流，水力資源豐富，是開發(fā)的重點。根據(jù)北溪流域綜合規(guī)劃，干流河段從上游到下游共規(guī)劃11個梯級水電站，其中西陂電站位于北溪干流河段上，華安縣湖林鄉(xiāng)西陂村上游1.1 km，距華安縣城約19km，呈狹長型，為徑流式開發(fā)電站，正常蓄水位125.30 m，相應庫容891.3萬m3，總庫容1640萬m3。

2樣品采集與分析

圖1　九龍江西陂庫區(qū)地理位置圖[2]Fig.1　Location ofXiPi Reservoir in Jiulong River

本文于2012年12月，2013年4月、6月、11月，使用抓斗采集西陂電站庫區(qū)表層沉積物，采集斷面采用GPS進行定位，地理位置如圖1，采樣斷面經(jīng)緯位置見表1。對沉積物的TC、TN、TP及各形態(tài)磷進行測定，并分析沉積物中甲藻孢囊的豐度和分布。

2.1表層沉積物樣品的采集

采集獲得的表層沉積物均勻混合后迅速裝入自封袋中，排氣后密封，運回后4℃避光冷藏以備后期實驗分析。全過程保持黑暗、低溫。每次測試分析取樣前，將表層沉積物樣品再次混合均勻，以消除取樣誤差。沉積物采集的同時，用德國WTW多功能水質(zhì)分析儀測量同斷面同點位上覆水水溫、溶解氧含量、pH值。

2.2表層沉積物的含水率測定

沉積物含水率測定采用烘干法，稱取沉積物樣品，放入已知重量的稱量瓶內(nèi)烘干后取出干燥冷卻再次稱重，重復操作至恒重。沉積物樣品含水率[24]為稱量瓶與樣品烘干前后重量差與樣品烘干前重量之比。

2.3表層沉積物各形態(tài)磷和沉積物碳、氮含量測定

各形態(tài)磷采用SMT法分級提取[25]，經(jīng)處理后，用鉬銻抗分光還原光度法進行含量測定[26]，數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標準偏差表示。表層沉積物碳、氮含量的測定使用元素分析儀(德國Elementar Vario EL III)進行測定。

表1　九龍江西陂庫區(qū)采樣斷面經(jīng)緯位置

2.4甲藻孢囊豐度與分布分析

稱取一定量均勻混合后的沉積物，加入一定量的蒸餾水后經(jīng)超聲波細胞粉粹機(JY96-Ⅱ)粉碎1 min，均勻倒在100 μm孔徑的篩絹上，用滅菌后的蒸餾水反復沖洗篩上物，收集過篩后的液體均勻倒在20m孔徑篩絹上，反復沖洗多次，收集篩上物，即得到甲藻孢囊富集樣品[27]。

對甲藻孢囊形態(tài)進行判斷，并進行計數(shù)統(tǒng)計。甲藻孢囊的豐度分析采用顯微鏡鏡檢法，分次吸取已完成預處理的甲藻孢囊富集樣品1 mL置于1 mL(20 mm×40 mm)計數(shù)框內(nèi)，利用倒置顯微鏡(NikonTS100)在10×40倍下進行全視野計數(shù)，每個樣品作3次平行處理。以樣品中總甲藻孢囊數(shù)除以沉積物干重計算得到該斷面的表層沉積物的甲藻孢囊豐度。根據(jù)淡水甲藻孢囊圖譜以及結(jié)合孢囊萌發(fā)后營養(yǎng)細胞的PCR結(jié)果對甲藻孢囊的種屬進行判定[28]。

2.5甲藻孢囊萌發(fā)實驗分析2.5.1甲藻單個孢囊萌發(fā)

將孢囊富集樣品置于倒置顯微鏡下觀察，通過毛細吸管將周圍的雜質(zhì)清理后吸取單個孢囊。在顯微鏡(Olympus BX51，400倍)下觀察形態(tài)并保存圖片。將單個孢囊吸到96孔培養(yǎng)板中，板內(nèi)每個孔提前加入300 μL Carefoot′s medium[29]，放入培養(yǎng)箱中進行孢囊孵化，溫度設置為20℃、光照強度為2500lx、光暗比為12h∶12h，定期觀察孢囊萌發(fā)情況。

2.5.2單細胞PCR(LSU)

利用毛細吸管吸取萌發(fā)后的單個營養(yǎng)細胞到干凈的載玻片上，加入滅菌后的蒸餾水，用干凈的尖頭鑷子對細胞進行物理破碎，使得孢囊內(nèi)的遺傳物質(zhì)流出，將破碎的細胞吸出后放于PCR管中直接進行PCR擴增[30]。PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上跑電泳，產(chǎn)物用1%EB染色，電泳結(jié)束后，將膠放在紫外燈下檢測是否有目的條帶。

表2PCR擴增的引物及其序列

Table 2Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing

引物代碼PrimerCode序列Sequence(5'→3')SR1TACCTGGTTGATCCTGCCAGLSUR2ATTCGGCAGGTGAGTTGTTAC30ACCCGCTGAATTTAAGCATA31CCTTGGTCCGTGTTTCAAGA

PCR反應體系為5U ExTaq酶，250 μmol/L dNTP，1×PCR Buffer。大亞基先用引物(表2)SR1和LSUR2[31]進行第一步擴增，程序為94℃預變性3 min 30 s ，94℃變性45 s，55℃退火60 s，72℃延伸2 min 30 s，34個循環(huán)后72℃延伸6 min。以第一步PCR產(chǎn)物為模板，用引物30和31進行第二步擴增，程序為94℃預變性3 min 30 s ，94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸2 min 30 s，30個循環(huán)后72℃延伸6 min。

2.5.3系統(tǒng)發(fā)育分析

將序列導入網(wǎng)站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/，點擊BLAST進行序列的比對。使用Dnaman 5.2.2.0軟件對測序得到的結(jié)果進行編輯，并與基因庫中相關種的LSU序列通過Mafft(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)進行比對。比對后生成的文件通過Bioedit 7.0.9.1軟件進行編輯剪切再進行最大相似度(ML)及貝葉斯(Bayesian)分析。在ML分析中，使用JModelTest[32]程序中的AIC功能選擇最適合的分子進化模型，測試結(jié)果選擇GTR+G模型。使用MEGA 5.05[33]構(gòu)建ML樹，bootstrap值設置為1000?；谪惾~斯的數(shù)據(jù)矩陣的構(gòu)建是使用MrBayes 3.1.2[34]，選擇的最適合替換模型為GTR+G。四條MCMC鏈運行1000000代，每10000代進行一次取樣。

3實驗結(jié)果與討論

3.1九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊種屬3.1.1九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊的主要形態(tài)

在九龍江西陂庫區(qū)的表層沉積物中發(fā)現(xiàn)不同形態(tài)的孢囊(圖2)，主要種屬為擬多甲藻屬(圖2a—f)，所占比例約為80%，其他主要為裸甲藻屬(圖2g—h)。

TSJL01：孢囊為橢圓形，長寬為40×45 μm，一頭較尖，一頭較圓，深褐色，孢囊壁明顯，有小橫溝，孢囊表面覆蓋著許多長10 μm左右的刺狀突起，長短不一，刺的末端較鈍。

GEJL01：孢囊為圓形，平均直徑為29 μm，白色，孢囊的非中央位置有明顯的色素體，為紅褐色，另有許多明顯的小顆粒。

圖2　九龍江西陂庫區(qū)沉積物主要甲藻孢囊形態(tài)Fig.2　Main dinoflagellates cysts in the sediments of XiPi Reservoir in Jiulong Rivera: PSJL01, b:PSJL02, c:PSJL03, d:PSJL04, e: PSJL05, f: PSJL06, g:TSJL01, h:GEJL01 Scales: 10 μm

3.1.2九龍江西陂庫區(qū)擬多甲藻屬孢囊系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)單細胞PCR結(jié)果判定，6種孢囊屬于擬多甲藻屬(圖2a—f)，以其營養(yǎng)細胞的LSU序列進行ML和BI分析，建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。此系統(tǒng)發(fā)育樹以Karlodiniummicrum作為outgroup，按比例繪制分枝長度，比例尺表示每個位點的堿基替換數(shù)。分枝上的數(shù)據(jù)是聚類的數(shù)據(jù)支撐，左側(cè)值是ML bootstrap，右側(cè)為貝葉斯分析的pp值。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，6種形態(tài)的擬多甲藻屬孢囊萌發(fā)出來的營養(yǎng)細胞分成了4個分支，其中PSJL04和PSJL05聚在一個小分支上，支持度很高，為100/1.00，序列相似度為98.40%(相差9bp)，而PSJL02和PSJL03聚在同一個小分支上，支持度為85/0.98，序列相似度為99.37%(相差1bp)。PSJL01和PSJL06分別聚在一個小分支上。從系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以判定，這6種形態(tài)的擬多甲藻孢囊至少可以分成4種擬多甲藻屬孢囊。具體種的判定還需根據(jù)萌發(fā)增殖的營養(yǎng)細胞的板塊數(shù)量及板塊排列，具體分類信息有待進一步研究。

擬多甲藻屬營養(yǎng)細胞的LSU序列建立的基于ML和BI分析的系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出PSJL06與Peridiniopsispenardii聚在同一個大分支上[35]，支持度為91/1.00。PSJL06聚在PeridiniopsispenardiiNW(HM596558)、PeridiniopsispenardiiSZ(HM596557)、PeridiniopsispenardiiJLJ(HM596556)之間。PSJL06與PeridiniopsispenardiiJLJ(HM596556)序列相似度為94.57%，與PeridiniopsispenardiiSZ(HM596557)序列相似度為94.69%，與PeridiniopsispenardiiNW(HM596558)序列相似度為93.81%。從PSJL06的孢囊和營養(yǎng)細胞形態(tài)上，發(fā)現(xiàn)它與Peridiniopsispenardii的形態(tài)較為相似[36]，因此判定PSJL06為九龍江2009年暴發(fā)的甲藻水華的優(yōu)勢種Peridiniopsispenardii。

圖3　擬多甲藻屬營養(yǎng)細胞的LSU序列建立的基于ML和BI分析的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　Phylogeny of the Peridiniopsis cell from LSU rDNA sequences based on maximum-likelihood (ML) and Bayesianinference (BI) analyses

圖4　2012—2013年九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊豐度與分布Fig.4　Distribution and abundance of dinoflagellate cysts in Xipi Reservoir in Jiulong River from 2012 to 2013

3.2九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊的豐度與分布3.2.1九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊豐度與分布差異性分析

2012—2013年，九龍江西陂庫區(qū)沉積物甲藻孢囊豐度與分布如圖4所示，甲藻孢囊豐度在(13.7±1.2)—(105.2±8.3)個/g干重之間。通過對4個月份進行兩兩比較，2013年11月的甲藻孢囊豐度與2012年12月、2013年4月、6月的甲藻孢囊豐度都有顯著的差異(P<0.05)，而另外3個月份間的甲藻孢囊豐度沒有顯著差異，由于本研究未測定水體懸浮物質(zhì)的沉積速率，甲藻孢囊的豐度是否有顯著季節(jié)差異有待進一步的研究確定。 從空間分布上看，甲藻孢囊在沿水流方向上的總體趨勢是增加，最高值出現(xiàn)在2013年4月壩前800米斷面。2013年4月份最高，2013年11月最低，高值是低值的5.6倍。

3.2.2九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊豐度影響因素分析

為研究甲藻孢囊的豐度環(huán)境影響因素，使用“SPSS 17.0”軟件對甲藻孢囊與表層沉積物樣品的TP、IP、OP、Fe/Al-P、Ca-P、TN、TC、含水率以及上覆水的水溫、pH、溶解氧等進行雙變量相關性分析。結(jié)果表明(表3)：含水率與甲藻孢囊豐度呈現(xiàn)顯著的相關性(P<0.05)，相關系數(shù)為0.629。當含水率高時甲藻孢囊的豐度高。研究表明，該區(qū)域表層沉積物平均粒徑在4—10m之間,大部分為粉砂質(zhì)粘壤土, 當沉積物中粉粒含量較高且砂粒含量低時，該區(qū)域的甲藻孢囊豐度會高于其他區(qū)域，而表層沉積物的含水率也是沉積物粒徑的一個反映，沉積物顆粒物越小，顆粒的比表面積越大，能夠吸附的水量越大，沉積物含水率較高。本研究結(jié)果表明，孢囊分布與沉積物含水率呈現(xiàn)顯著相關，也反映了沉積物粒徑與孢囊的分布的關系。如果表層沉積物斷面主要以細顆粒為主，此處水流速度較慢，有利于孢囊沉降，反映了甲藻孢囊的分布沿水流方向上的積累趨勢。

表3　2012—2013年九龍江西陂庫區(qū)甲藻孢囊豐度與環(huán)境因子相關分析

**P<0.01，為極顯著相關；*P<0.05 ，為顯著相關

4結(jié)論

本研究采用顯微觀察和單細胞PCR技術，對九龍江西陂庫區(qū)2012—2013年不同月份沉積物中的甲藻孢囊進行種屬判定，結(jié)果表明，庫區(qū)沉積物中的甲藻孢囊主要種屬是擬多甲藻屬，約占80%的比例，其次為裸甲藻屬，并發(fā)現(xiàn)了2009年水華優(yōu)勢種佩式擬多甲藻(Peridiniopsis penardii)孢囊。

九龍江西陂庫區(qū)2012—2013年不同月份沉積物中甲藻孢囊豐度在(13.7±1.2)—(105.2±8.3)個/g干重之間，多元相關分析結(jié)果表明，甲藻孢囊豐度與含水率呈現(xiàn)顯著的正相關性(P<0.05)，當含水率高時，甲藻孢囊的豐度高。從空間分布上看，甲藻孢囊的分布沿水流方向逐漸積累。

致謝：感謝廈門大學生態(tài)與環(huán)境學院陳能汪教授、研究生吳杰忠和陳朱虹在野外采樣工作中給予的支持與幫助。

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Research on the distribution of dinoflagellate cysts in the surface sediments of the XiPi Reservoir in the Jiulong River

SU Yuping1,2,*, XUE Cheng1, YOU Xuejing1,3, ZHONG Yanping1, GU Haifeng3

1EnvironmentalScienceandEngineeringCollegeofFujianNormalUniversity,Fuzhou350007,China2FujianKeyLaboratoryofPollutionControlandResourceRecycling,Fuzhou350007,China3ThirdInstituteofOceanography,Xiamen361005,China

Abstract：Resting cysts play a major role in the life history of dinoflagellates. Peridiniopsis blooms have occurred many times in the Jiulongjiang River (Fujian province) since February 2009. This study investigates the characteristics of dinoflagellate cysts found in the sediments of the Xipi Reservoir in the Jiulongjiang River during different months, from 2012 to 2013. We used microscopy and single-cell Polymerase Chain Reaction (PCR) technology to identify the species of dinoflagellate cysts in a germination experiment. The results show that Peridiniopsis forms the dominant genus among the dinoflagellate cysts found in these sediments, and accounts for 80% of the total population while the rest belong to the genus Gymnodinium. We identified the cysts of Peridiniopsis penardii, the dominant bloom species in 2009. We also assessed the distribution and abundance of dinoflagellate cysts and investigated the driving factors of these population characteristics. The abundances of dinoflagellate cysts in sediments during different months are between (13.7 ± 1.2) to (105.2 ± 8.3) cysts/g DW. The multiple correlation analysis demonstrated that the abundance of dinoflagellate cysts is significantly positively correlated with moisture (P < 0.05). It showed that the distribution of dinoflagellate cysts gradually increased along the direction of the river flow. These results provide new insight into freshwater dinoflagellate cyst characterization and germination in this reservoir, and provide a scientific background for efforts aimed at the prevention of dinoflagellate blooms in the Jiulongjiang River.

Key Words:dinoflagellate cysts; sediment; distribution; Jiulongjiang River

DOI:10.5846/stxb201408041554

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: ypsu@fjnu.edu.cn

收稿日期:2014- 08- 04; 網(wǎng)絡出版日期:2015- 07- 29

基金項目:國家自然科學基金項目(41101060); 福建省自然科學基金項目(2014J01154)

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