薛原，王曉菲，牛鑫鑫，廖聰，孫穎,田麗紅

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

雞源沙門氏菌中磺胺類藥物耐藥基因的檢測(cè)*

薛原，王曉菲，牛鑫鑫，廖聰，孫穎,田麗紅

(東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱150040)

采用K-B法檢測(cè)35株黑龍江省雞源沙門氏菌對(duì)磺胺類藥物的耐藥基因。根據(jù)耐藥基因的流行情況，指導(dǎo)臨床合理用藥。結(jié)果表明，35株雞源沙門氏菌對(duì)sulⅠ基因的陽性率為100%，sulⅡ基因的陽性率為68.6%，sulⅢ基因的陽性率為94.3%。

沙門氏菌；磺胺類藥物；sulⅠ基因；sulⅡ基因；sulⅢ基因

隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌耐藥性很快出現(xiàn)。遏制沙門氏菌耐藥性的傳播和蔓延，防止沙門氏菌耐藥菌株傳播給人類已經(jīng)成為世界關(guān)注的焦點(diǎn)。磺胺類藥物是一類古老的化學(xué)合成抗菌藥物，它們至今仍廣泛用于細(xì)菌、原生動(dòng)物和真菌的感染，具有抗菌譜廣和價(jià)廉易得等特點(diǎn)[1]?；前奉愃幬锸嵌淙~酸合成酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。這個(gè)酶是葉酸合成的關(guān)鍵性酶。由于磺胺類的濫用導(dǎo)致大量耐藥菌株的出現(xiàn)，這給臨床治療帶來很大困難。抗微生物藥作為促生長(zhǎng)劑在食源性動(dòng)物中的廣泛應(yīng)用產(chǎn)生的抗菌藥選擇壓力，促進(jìn)了微生物耐藥性的出現(xiàn)和傳播。許多編碼耐藥性的基因可在動(dòng)物和人類病原菌間水平傳播，危害養(yǎng)殖業(yè)和人類健康。因此對(duì)沙門氏菌的耐藥性檢測(cè)在獸醫(yī)和公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義。

在雞沙門氏菌耐藥基因的研究方面有相關(guān)報(bào)道[2-4]，但是我國(guó)大多停留在耐藥表型上的研究[5-6]。本研究對(duì)35株雞源沙門氏菌進(jìn)行的磺胺類藥物的耐藥基因進(jìn)行了擴(kuò)增，比較了細(xì)菌的耐藥性和耐藥基因之間的關(guān)系。

1 材料

1.1 菌株質(zhì)控菌:大腸桿菌ATCC25922，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；臨床菌株：來源于黑龍江省養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 儀器和試劑質(zhì)粒小量提取試劑盒、Taq酶寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；凝膠成相分析系統(tǒng)，美國(guó)Alpha Imager2200公司產(chǎn)品；PCR儀，德國(guó)Biometra公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 藥敏試驗(yàn)將經(jīng)鑒定的菌株接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯，振蕩培養(yǎng)，在MH平板上涂抹均勻，用K-B瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，置于37℃培養(yǎng)18h。抑菌圈直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)的標(biāo)準(zhǔn)，每次試驗(yàn)均以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。

2.2 耐藥基因檢測(cè)PCR擴(kuò)增的模板為菌株質(zhì)粒DNA和菌落。引物序列引自參考文獻(xiàn)[2]，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析，sulⅠ基因目的片段為425bp，sulⅡ基因目的片段為435bp，sulⅢ基因目的片段為792bp。

3 結(jié)果

3.1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果35株菌對(duì)磺胺類藥物復(fù)方新諾明的耐藥率為72%。

3.2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果以35株臨床分離的雞源沙門氏菌的質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因的檢測(cè)。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因檢測(cè)結(jié)果顯示：sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因PCR擴(kuò)增陽性，其擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段相符。sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ基因PCR檢測(cè)電泳結(jié)果見圖1、2、3。35株雞源大腸桿菌中，sulⅠ基因檢出的陽性例數(shù)為35例，陽性率為100%；sulⅡ基因檢出的陽性例數(shù)為24例，陽性率為68.6%；sulⅢ檢出的陽性例數(shù)為33例，陽性率為94.3%。

圖1 sulⅠ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 sulⅡ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 sulⅢ基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

4 討論

沙門氏菌是一種廣泛分布的食源性病原體，是嚴(yán)重危害人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展的一類人畜共患病原菌。它寄生于人和動(dòng)物的腸道內(nèi)，在動(dòng)物與人之間可通過直接或間接的途徑進(jìn)行傳播，不需要中間宿主。不同國(guó)家和地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)由于其臨床用藥習(xí)慣、飼養(yǎng)管理水平、衛(wèi)生條件及自然環(huán)境存在差異，因此致病性沙門氏菌的耐藥表型特征也不相同。

抗微生物藥應(yīng)用幾十年來，確實(shí)減少了動(dòng)物的發(fā)病率和死亡率，提高了經(jīng)濟(jì)效益，但是在動(dòng)物生產(chǎn)中，人們應(yīng)慎用抗微生物藥，以免為了一時(shí)的經(jīng)濟(jì)效益而威脅到人類自身的安全，從而付出更大的代價(jià)。沙門氏菌的耐藥性可通過基因突變、外排泵、耐藥基因編碼的鈍化酶和滅活酶產(chǎn)生、可移動(dòng)的細(xì)菌遺傳耐藥基因元件產(chǎn)生及其轉(zhuǎn)移等多種機(jī)制產(chǎn)生和傳遞，影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和公共衛(wèi)生安全。細(xì)菌對(duì)磺胺類藥物容易產(chǎn)生耐藥性，產(chǎn)生的原因是細(xì)菌產(chǎn)生了較多的PABA，或二氫葉酸合成酶結(jié)構(gòu)改變，或者直接利用外源性葉酸。各磺胺類藥之間可產(chǎn)生不同程度的交叉耐藥。

臨床上的革蘭氏陰性腸道菌對(duì)磺胺類藥物的抗性很大程度是經(jīng)質(zhì)粒介導(dǎo)的，主要是由于出現(xiàn)替代性的、對(duì)磺胺類藥物親和力更低的新二氫葉酸合成酶，即有抗性的DHPS。在革蘭氏陰性腸道菌中，目前的研究共有兩種具有對(duì)磺胺類藥物抗性的二氫葉酸合成酶，其基因分別命名為sulⅠ、sulⅡ、sulⅢ。Swedberg等人研究了兩個(gè)由質(zhì)粒介導(dǎo)的酶，這兩個(gè)基因的序列被檢測(cè)出來，分別命為: sulⅠ、sulⅡ[7]。sulⅢ基因同sulⅠ基因和sulⅡ基因相比，只有40%和43.3%的同源率。沙門氏菌對(duì)磺胺類產(chǎn)生耐藥性，除了以上出現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)對(duì)磺胺親和力更低的二氫葉酸合成酶外，其它一些試驗(yàn)證明在染色體上的二氫葉酸合成酶的dhps基因經(jīng)過突變，使二氫葉酸合成酶降低對(duì)磺胺類藥的親和力，從而產(chǎn)生抗性。

本研究的耐藥基因檢測(cè)結(jié)果表明，雞源沙門氏菌磺胺類藥物的耐藥性已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重，必須從細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生的分子機(jī)理方面研究,才能找到消除細(xì)菌耐藥性的根本方法。為控制耐藥性沙門氏菌感染的蔓延，研究畜牧業(yè)中抗菌素的使用造成食源性沙門菌耐藥性變化與臨床分離的耐藥菌株之間的關(guān)系，加大對(duì)沙門氏菌耐藥性監(jiān)測(cè)力度是非常必要的。建議一種藥物不要長(zhǎng)期應(yīng)用，可采取輪換用藥的方式，避免耐藥性的產(chǎn)生。

[1]AlSalim,T,Saeed,MEM,Hadi,JS,Zeino,M,Gany, R,Kadioglu,O,Titinchi,SJJ,Abbo,HS,Efferth,T. Cytotoxicity of Novel Sulfanilamides Towards Sensitive and Multidrug-resistant Leukemia Cells[J]. CURRENT MEDICINAL CHEMISTRY.2014,21(23): 2715-2725.

[2]馬孟根，王紅寧，余勇，等.豬源致病性沙門氏菌耐藥基因的分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,37(1),65-70.

[3]黃凱，陳素娟，黃駿，等.動(dòng)物源性沙門氏菌的耐藥性分析及氟苯尼考類耐藥基因的鑒定[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015,42(2)：459－466.

[4]趙俊利，石瑞麗，李志芳，等.內(nèi)蒙古地區(qū)奶牛源致病性沙門氏菌耐藥性分析及ESBLS基因檢測(cè)[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015,42(8):2150-2159.

[5]譚偉成，盧景.50株鴨源致病性沙門氏菌的分離鑒定及藥物敏感性檢測(cè)[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2011, 2:43-45.

[6]施開創(chuàng)，李鳳梅，鄒聯(lián)斌，等.雞源致病性沙門氏菌的分離鑒定及血清型和藥物敏感性分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015，42(8)：2160－2168.

[7]Swedberg G,Skold O.Plasmid-borne sulfonamide resistance determinants studied by Restriction enzyme analysis[J].J Baeteriol,1983,153(3): 1228-1237.

Source of salmonella in chicken sulfa drug resistance gene detection

XUE Yuan，WANG Xiao-fei，NIU Xin-xin，LIAO Chong，SUN Ying，TIAN Li-hong
(College of wildlife resource o f Northeast Forest University，Harbin 150040，China)

K-B method is used to detect 35 salmonella strains in heilongjiang province chicken the source of sulfa drug resistant genes.According to the prevalence of drug resistant genes,to guide clinical rational drug use.The results show that the source of 35 strains of chicken salmonella to sulⅠgene positive rate was 100%,sulⅡgene positive rate was 68.6%, sulⅢgene positive rate was 94.3%。

salmonella;sulfonamides;sulⅠgene;sulⅡgene;sulⅢgene

Q343.1

B

1673-1085（2016）03-0010-03

編輯部版權(quán)頁聲明：

《家禽科學(xué)》雜志社

2016-02-21

國(guó)家自然科學(xué)基金（31502119）；黑龍江省博士后科研啟動(dòng)金（LBH-Q14002）。

薛原（1978～），女，漢族，黑龍江饒河人，講師，博士，主要從事細(xì)菌耐藥性方面的研究。

**通訊作者，E-mail:xueyuan-1978@163.com。

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