于可響，黃兵，馬秀麗，劉存霞，胡峰，李峰，宋敏訓(xùn)

（山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心，山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250023）

櫻桃谷肉鴨“大舌病”研究簡(jiǎn)報(bào)*

于可響，黃兵，馬秀麗，劉存霞，胡峰，李峰，宋敏訓(xùn)**

（山東省農(nóng)科院家禽研究所禽病研究中心，山東省家禽疫病診斷與免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250023）

2014年下半年以來(lái)，我國(guó)江蘇、山東、安徽、河北、江西等主要養(yǎng)鴨地區(qū)的櫻桃谷肉鴨中暴發(fā)了一種以喙短、舌長(zhǎng)、骨脆、發(fā)育不良為主要臨床特點(diǎn)的疾病，生產(chǎn)中稱為“大舌病”或“長(zhǎng)舌病”，給當(dāng)?shù)氐娜怿嗮B(yǎng)殖造成了很大的沖擊。我們從山東地區(qū)發(fā)病鴨中分離到一株能在番鴨胚和鵝胚繁殖的病毒（命名為YZ15-1），經(jīng)PCR鑒定，確定為小鵝瘟病毒。VP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，YZ15-1與GPV處于同一個(gè)分支，特別與GPVa2006和GPVb1999這兩個(gè)臺(tái)灣分離株的遺傳關(guān)系最近。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)均能檢測(cè)GPV，泄殖腔棉拭子的陽(yáng)性率為78.8%；而發(fā)病鴨群中未出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)病毒檢測(cè)的陽(yáng)性率為58.3%，泄殖腔棉拭子的陽(yáng)性率為37.5%；同時(shí)從10個(gè)不同地區(qū)健康鴨群采集的100份泄殖腔棉拭子中未檢測(cè)到GPV。但是肉鴨回歸試驗(yàn)未復(fù)制出“大舌”癥狀。這些結(jié)果說(shuō)明，鴨“大舌病”可能是以變異的GPV為傳染性因素，其他輔助性因素共同作用的結(jié)果。

櫻桃谷鴨；鴨“大舌病”；小鵝瘟病毒；變異。

2014年下半年開(kāi)始，在江蘇省沛縣及周邊養(yǎng)殖的商品櫻桃谷肉鴨中開(kāi)始出現(xiàn)一種以喙短、舌長(zhǎng)、骨脆、發(fā)育不良為主要臨床特點(diǎn)的疾病，生產(chǎn)中稱為“大舌病”或“長(zhǎng)舌病”，實(shí)際上此命名并不準(zhǔn)確，患鴨是由于喙發(fā)育慢而使得舌頭突出在外，并不是舌頭變長(zhǎng)。隨后該病逐漸蔓延到山東、河北、河南、安徽、江西等主要養(yǎng)鴨地區(qū)。病鴨最早可在6日齡出現(xiàn)舌頭突出的癥狀，隨后每天都會(huì)出現(xiàn)且新發(fā)病鴨的數(shù)量逐漸增多。病鴨在發(fā)病后期喙比正常鴨要短10%～30%，并且一旦發(fā)病很難恢復(fù)正常。剖檢病鴨發(fā)現(xiàn)，除了腸道炎癥外，無(wú)明顯的病變。該病的發(fā)病率差別很大，低的不到0.5%，高的可達(dá)30%，個(gè)別的可達(dá)70%。一般在5%～20%。該病剛開(kāi)始發(fā)生于商品代櫻桃谷肉鴨，后來(lái)波及肉種鴨和番鴨。國(guó)內(nèi)研究人員已證實(shí)該病是由細(xì)小病毒引起，并將其稱為“鴨短喙長(zhǎng)舌綜合征”或“鴨短喙和侏儒綜合征”[1-2]。由于舌頭突出，導(dǎo)致病鴨無(wú)法正常采食，因此病鴨常表現(xiàn)發(fā)育不良，腿、翅膀易斷，很多屠宰場(chǎng)拒收此類殘鴨，使得養(yǎng)殖戶損失嚴(yán)重。目前，該病有愈演愈烈的趨勢(shì)，需要引起足夠的重視。

1 材料與方法

1.1 病料采集本研究的病料來(lái)自于山東省兗州市某肉鴨養(yǎng)殖場(chǎng)21日齡的有“大舌”癥狀的病鴨。該養(yǎng)殖場(chǎng)從5日齡開(kāi)始陸續(xù)出現(xiàn)腿瘸、喜臥、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩的病鴨，10日齡左右開(kāi)始出現(xiàn)舌頭突出喙外的病鴨。

1.2 病毒分離無(wú)菌采集發(fā)病鴨的脾臟，加入5倍體積PBS（pH 7.2）和終濃度1000U/ml的雙抗，剪碎后充分研磨，然后分裝、反復(fù)凍融2次，3000rpm離心20min，取上清經(jīng)菌檢無(wú)菌后分別接種9日齡SPF雞胚、10日齡SPF鴨胚、10日齡肉鴨胚、10日齡番鴨胚和12日齡鵝胚，0.1ml/枚。收集接種后2～6d死亡的胚胎尿囊液或接種后6d未死的胚胎尿囊液，繼續(xù)盲傳5代，觀察并記錄接種胚胎死亡及病變情況，收集疑似病毒的尿囊液和胚胎凍存?zhèn)溆谩７蛛x的毒株命名為YZ15-1。

1.3 病毒鑒定

1.3.1 血凝特性按常規(guī)方法進(jìn)行血凝試驗(yàn)，分別測(cè)定分離毒對(duì)雞、鴨、鵝、鴿、鼠和兔紅細(xì)胞的血凝性。

1.3.2 PCR鑒定根據(jù)NCBI中已發(fā)表的小鵝瘟病毒（GPV）YZ99-6株的序列（登錄號(hào)：KC996730），設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物用于GPV的檢測(cè)。引物序列為：上游引物P1：5' CTTGAACACGACAAGGCC3'；下游引物P2：5 'GTCGGTAAGCTTCCCTGTATTT3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為234bp，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

提取鵝胚分離毒的RNA，分別用A型鴨肝炎病毒（DHV-A）、C型鴨肝炎病毒（DHV-C）、番鴨呼腸孤病毒（MDRV）、新型鴨呼腸孤病毒（NDRV）、鴨坦布蘇病毒（DTMUV）的特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒定；提取鵝胚分離毒的DNA，分別用鴨腸炎病毒（DEV）、番鴨細(xì)小病毒（MDPV）、鵝細(xì)小病毒（GPV）的特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。

1.4 VP3基因分析根據(jù)NCBI中已發(fā)表的GPV YZ株的序列（登錄號(hào)：KR091960），設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增病毒的主要抗原基因-VP3基因。引物序列為：上游引物P1：5'CGGGAGGTGGCAGTAGTG 3'；下游引物P2：5'CGCCAGGAAGTGCTTTATT 3'，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為1716 bp，引物由上海立菲生物技術(shù)有限公司合成。

提取病毒的DNA，按照常規(guī)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。取5μl反應(yīng)產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖中電泳進(jìn)行檢驗(yàn)。按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5ɑ。挑菌提取質(zhì)粒，分別進(jìn)行PCR和酶切鑒定，鑒定為陽(yáng)性的菌落送上海立菲生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，并與GenBank中發(fā)表的相關(guān)序列進(jìn)行比較。

從NCBI中獲取GPV和MDPV的VP3基因序列（表1），通過(guò)MEGA軟件將YZ15-1的VP3基因序列與GPV、MDPV做比對(duì)，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 本研究所選用毒株的背景

1.5 流行病學(xué)調(diào)查收集山東省的齊河、高唐、兗州、嘉祥、安丘、單縣、青州、沂南、東阿、臨邑、陽(yáng)谷等11個(gè)地區(qū)、157份發(fā)病鴨群的泄殖腔棉拭子或病料，其中有大舌癥狀的病料35份、棉拭子70份；無(wú)大舌癥狀的病料12份、棉拭子30份；另外收集了10個(gè)地區(qū)的健康鴨的泄殖腔棉拭子100份，利用PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 肉鴨攻毒試驗(yàn)1日齡櫻桃谷肉鴨90只，經(jīng)瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)無(wú)相應(yīng)的母源抗體。分別用鵝胚分離毒和發(fā)病鴨脾臟病料通過(guò)肌肉注射（0.5ml/只）加口服（1ml/只）的方式感染，30只/組，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組30只，觀察并記錄實(shí)驗(yàn)鴨發(fā)病及死亡情況，并于試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)實(shí)驗(yàn)鴨進(jìn)行稱重。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離通過(guò)番鴨胚和鵝胚分離到一株對(duì)胚胎有致死性的病毒，我們命名為YZ15-1。初次分離時(shí)，胚胎均未出現(xiàn)死亡，從第3代開(kāi)始，少部分番鴨胚和鵝胚胚胎出現(xiàn)死亡，死亡時(shí)間集中在接種后4～6d，死亡胚胎表現(xiàn)為絨毛尿囊膜水腫，胚胎頭部、翅、趾有出血點(diǎn)。而通過(guò)SPF雞胚、SPF鴨胚和肉鴨胚未分離到對(duì)胚胎有致病性的病毒。盡管病毒能在番鴨胚和鵝胚繁殖，但病毒滴度普遍不高。

2.2 病毒鑒定

2.2.1 血凝特性該分離毒對(duì)雞、鴨、鵝、鴿、鼠和兔紅細(xì)胞均無(wú)血凝性。

2.2.2 PCR鑒定利用幾種常見(jiàn)鴨病毒病的特異性引物對(duì)分離毒株進(jìn)行PCR鑒定，檢測(cè)結(jié)果顯示，只有鵝細(xì)小病毒為陽(yáng)性。

2.2.3 VP3基因分析通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，YZ15-1的VP3基因長(zhǎng)1605bp，與GPV、MDPV的VP3基因長(zhǎng)度一致。通過(guò)DNAStar軟件將YZ15-1的VP3基因序列與GPV和MDPV相比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)YZ15-1的VP3基因序列與GPV的同源性最近，達(dá)到93.1%～98.2%；與MDPV的同源性為81.5%～91.4%。通過(guò)MEGA軟件繪制了VP3基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖1），結(jié)果顯示，YZ15-1與GPV處于同一個(gè)分支，特別與GPVa2006和GPVb1999這兩個(gè)臺(tái)灣分離株的遺傳關(guān)系最近。

圖1 水禽細(xì)小病毒VP3基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.3 流行病學(xué)調(diào)查采集11個(gè)地區(qū)的129份發(fā)病鴨群的泄殖腔棉拭子或病料，通過(guò)PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)均能檢測(cè)GPV（27/27），而泄殖腔棉拭子的陽(yáng)性率為78.8%（52/66）；而發(fā)病鴨群中未出現(xiàn)大舌癥狀的鴨子體內(nèi)病毒檢測(cè)的陽(yáng)性率為58.3%（7/12），泄殖腔棉拭子的陽(yáng)性率為37.5%（9/24）。同時(shí)從10個(gè)不同地區(qū)健康鴨群采集的100份泄殖腔棉拭子中未檢測(cè)到GPV。

2.4 雛番鴨攻毒試驗(yàn)分別用鵝胚分離毒和發(fā)病鴨脾臟病料回歸1日齡雛鴨，觀察至35日齡，實(shí)驗(yàn)鴨未出現(xiàn)死亡，也未發(fā)現(xiàn)有“大舌”癥狀。但鵝胚分離毒攻毒組和脾臟病料攻毒組的平均體重分別比正常對(duì)照組降低4.25%和9.32%。

3 討論

水禽的細(xì)小病毒病主要有番鴨細(xì)小病毒病和鵝細(xì)小病毒病（小鵝瘟），這兩種病毒在形態(tài)特征、理化特性、基因組結(jié)構(gòu)等方面非常相似[3]。兩者具有一定的抗原交叉保護(hù)性，它們的共同抗原主要在核衣殼蛋白VP3，而VP1和VP2蛋白存在抗原性差異[4]。自然條件下，番鴨細(xì)小病毒只能感染番鴨，不能感染鵝，而鵝細(xì)小病毒不僅可以感染鵝，還可以感染番鴨。這兩種病毒病主要感染雛番鴨或雛鵝，以發(fā)病率高、死亡率高為主要特征[5]，與此次在肉鴨中流行的“大舌病”在發(fā)病特點(diǎn)上有很大的不同。

通過(guò)基因序列和抗原性分析，可以確實(shí)該病的病原實(shí)際上就是小鵝瘟病毒，只是因?yàn)樗拗骷?xì)胞受體結(jié)合部位的某個(gè)或某些位點(diǎn)的氨基酸變異，使其獲得了感染櫻桃谷肉鴨的能力。實(shí)際上，類似肉鴨“大舌病”的病例早在20世紀(jì)70年代法國(guó)的半番鴨中就開(kāi)始出現(xiàn)，稱為“短喙和侏儒綜合征”，之后臺(tái)灣、波蘭也有類似病例的報(bào)道[6-7]。在我國(guó)南方的番鴨養(yǎng)殖中，時(shí)常會(huì)發(fā)現(xiàn)一些因感染過(guò)番鴨細(xì)小病毒而出現(xiàn)類似癥狀的“僵鴨”。近幾年來(lái)，山東個(gè)別肉鴨養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過(guò)程中也會(huì)發(fā)現(xiàn)極少數(shù)類似的“殘鴨”。這些都說(shuō)明了水禽細(xì)小病毒一直在“努力”地變異著，直到最近兩年完全獲得感染肉鴨的能力，從而導(dǎo)致了該病的大暴發(fā)。

我們用鵝胚分離毒和病鴨病料對(duì)無(wú)母源抗體的櫻桃谷肉鴨總共進(jìn)行3次回歸實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)過(guò)程中采取了加大感染劑量、使用不同的感染方式、采用不同發(fā)病場(chǎng)的患鴨病料、選用不同種鴨場(chǎng)的雛鴨、口服環(huán)磷酰胺人為降低實(shí)驗(yàn)鴨的免疫力、人為制造冷應(yīng)激等多種措施，但都未復(fù)制出“大舌”癥狀。盡管有研究報(bào)道該病可以在櫻桃谷肉鴨中復(fù)制出臨床癥狀[1-2]，但我們的回歸試驗(yàn)至少說(shuō)明該病較難復(fù)制，可能需要其他病原或協(xié)同因素的共同作用。

關(guān)于鴨“大舌病”傳播方式目前尚不明確?？梢源_定的是，其橫向傳播能力有限。該病剛開(kāi)始流行時(shí)，生產(chǎn)中常常出現(xiàn)相距不足20m的兩棟鴨舍，一棟舍的鴨群發(fā)病，另一棟舍不發(fā)病的情況。通過(guò)走訪調(diào)研，我們發(fā)現(xiàn)該病發(fā)病有愈來(lái)愈早的趨勢(shì)，目前大多數(shù)感染發(fā)生在7日齡內(nèi)。這可能存在兩種傳播方式。第一種是垂直傳播，由于GPV和MDPV都有垂直傳播的特點(diǎn)，因此該病存在垂直傳播的可能性。但臨床中也會(huì)出現(xiàn)同一種鴨場(chǎng)的同一批鴨苗在同一地區(qū)進(jìn)行飼養(yǎng)，有的養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病，有的養(yǎng)殖場(chǎng)不發(fā)病的情況，這似乎與垂直傳播相矛盾；第二種可能性是病毒一直在養(yǎng)殖場(chǎng)中存在，鴨苗一進(jìn)場(chǎng)即被感染。這種可能性非常大。因?yàn)橥ǔＲ粋€(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)會(huì)出現(xiàn)連續(xù)多批發(fā)病的情況。另外，臨床實(shí)踐證實(shí)，空欄期加強(qiáng)消毒，能大大降低下一批鴨的發(fā)病率。

總之，肉鴨“大舌病”作為一種新發(fā)疫病，其致病機(jī)理、變異機(jī)制、免疫機(jī)制、傳播途徑、防控措施等多個(gè)方面還需要進(jìn)一步的研究。

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S858.32

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1673-1085（2016）03-0013-04

2016-02-21

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系家禽創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（SDAIT-13-011-01）；山東省海外高層次人才（泰山學(xué)者）引進(jìn)計(jì)劃。

作者：于可響，男，博士，副研究員。E-mail：yukx1979@163.com。

**通訊作者：宋敏訓(xùn)，博士，研究員，E-mail：mxsong@aliyun.com。