王鵬，苗軍，方成，胡永成，陳曉鵬

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市天津醫(yī)院骨科，天津300211）

論著

可調(diào)控BMP-2表達(dá)的單質(zhì)粒載體構(gòu)建及其在ADSCs中的表達(dá)研究

王鵬1，苗軍2，方成1，胡永成2，陳曉鵬1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)研究生院，天津300070；2.天津市天津醫(yī)院骨科，天津300211）

目的：擬構(gòu)建可調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）表達(dá)的單質(zhì)粒慢病毒表達(dá)載體，為研究骨修復(fù)過程中的成骨性能打下基礎(chǔ)。方法：通過基因重組技術(shù)獲取含BMP-2的慢病毒表達(dá)載體，通過菌落PCR和基因測序鑒定；將慢病毒表達(dá)載體與包裝載體pMD2.G和pSPAX在293T細(xì)胞中包裝，收集病毒液，轉(zhuǎn)染大鼠脂肪基質(zhì)干細(xì)胞（ADSCs）。首先，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)和MTT來初步分析誘導(dǎo)劑多西環(huán)素（Dox）不同濃度對(duì)ADSCs活性的影響；其次，縮小Dox濃度范圍，在熒光顯微鏡下通過熒光表達(dá)強(qiáng)度判斷Dox對(duì)ADSCs中基因表達(dá)的誘導(dǎo)效率，相同條件下，qRT-PCR分析BMP-2的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，進(jìn)一步優(yōu)化Dox的誘導(dǎo)濃度；最后，通過Western blot檢測不同Dox濃度下，轉(zhuǎn)染目的基因的ADSCs中BMP-2表達(dá)，Image J軟件進(jìn)行灰度值分析判斷二者之間的劑量依賴關(guān)系。結(jié)果：1%瓊脂糖凝膠電泳證實(shí)pUC57-BMP-2經(jīng)雙酶切后可獲得大小約1 100 bp的目的基因片段，菌落PCR和基因測序證實(shí)含目的基因的慢病毒表達(dá)載體pLVCT-BMP-2構(gòu)建成功。ADSCs對(duì)Dox最大耐受濃度為6 μg/mL，Dox對(duì)ADSCs中目的基因表達(dá)的最大誘導(dǎo)濃度為5 μg/mL，Western blot證實(shí)ADSCs中BMP-2表達(dá)與Dox濃度（0~5 μg/mL）存在劑量依賴關(guān)系。結(jié)論：成功構(gòu)建可調(diào)控BMP-2表達(dá)的單質(zhì)粒慢病毒表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染ADSCs后，BMP-2的表達(dá)與Dox濃度存在劑量依賴關(guān)系。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2；基因調(diào)控；多西環(huán)素；脂肪基質(zhì)干細(xì)胞；慢病毒表達(dá)載體

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein 2，BMP-2）是骨修復(fù)過程中不可替代的生長因子，其作用的時(shí)間和劑量與骨修復(fù)過程中的成骨性能密切相關(guān)[1-2]。目前多將BMP-2包被入微球、與載體材料混合，通過材料降解控制其釋放從而實(shí)現(xiàn)BMP-2以時(shí)間和劑量依賴的方式作用，而蛋白質(zhì)易降解，如BMP-2在大鼠體內(nèi)的半衰期為16 min，靈長類只有6.7 min[3]。隨著基因調(diào)控技術(shù)的發(fā)展，有望實(shí)現(xiàn)不同生長因子以時(shí)間和劑量依賴的方式表達(dá)，但多將目的基因和調(diào)控元件構(gòu)建在不同的載體上，需要通過多次轉(zhuǎn)染的方式實(shí)現(xiàn)BMP-2的調(diào)控表達(dá)，這種方法的轉(zhuǎn)染效率低，且目的基因在無誘導(dǎo)條件下的背景表達(dá)高[4-5]。為了有效促進(jìn)骨修復(fù)，BMP-2表達(dá)需要一種更為精確、有效的調(diào)控系統(tǒng)。本研究的目的：（1）構(gòu)建可調(diào)控BMP-2表達(dá)的單質(zhì)粒慢病毒載體；（2）優(yōu)化誘導(dǎo)劑對(duì)ADSCs有效作用濃度，研究優(yōu)化后的濃度對(duì)BMP-2表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料 FBS（HyClone公司，美國）；L-DMEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國）；雙抗（青霉素-鏈霉素，GIBCO公司，美國）；MTT、多西環(huán)素（Doxycycline，Dox）、聚凝胺（Polybrene）（Sigma公司，美國）；磷酸鹽緩沖液（PBS）（生工，上海）；rTap DNA聚合酶（寶生物工程有限公司，大連）。293T細(xì)胞由天津醫(yī)科大學(xué)免疫炎癥實(shí)驗(yàn)室張榮信教授惠贈(zèng)；慢病毒表達(dá)載體pLVCT-tTRKRAB（簡稱pLVCT）、包裝質(zhì)粒pMD2.G、psPAX2購自 Addgene（美國）；質(zhì)粒pUC57-BMP-2由金唯智（蘇州，中國）合成。Plasmid抽提試劑盒，聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物回收試劑盒（Qiagen公司，德國），大鼠 BMP-2抗體（ImmunoWay生物公司，美國）。Plus-20離心超濾裝置（Millipore公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）。

1.2 方法

1.2.1 調(diào)控BMP-2的慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定 從 Genebank中提取大鼠 BMP-2基因（NM_017178.1）編碼區(qū)序列，由金維智公司將BMP-2基因合成在質(zhì)粒pUC57中，即pUC57-BMP-2。設(shè)計(jì)合成含PacI酶切位點(diǎn)（TTAATTAA）和MLu I酶切位點(diǎn)(ACGCGT)的一對(duì)引物，引物序列：上游引物5′-CCTTAATTAAATGGTGGCCGGGACCCGC-3′，下游引物5′-CGACGCGTCTAGCGACACCCGCAAC C-3′，以pUC57-BMP-2重組質(zhì)粒為模板，PCR法擴(kuò)增出大鼠BMP-2目的片段，聚合酶鏈反應(yīng)參數(shù)為：預(yù)變性95℃，5 min；循環(huán)變性，94℃，30 s；復(fù)性，55℃，1 min；延伸，72℃，90 s，共32個(gè)循環(huán)，72℃，延伸15 min。經(jīng)雙酶切后在體積分?jǐn)?shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

按聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物回收試劑盒說明回收純化目的片段，與同樣經(jīng)雙酶切、純化的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLVCT定向連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，將轉(zhuǎn)化后的菌落平鋪于含1‰氨芐霉素抗性的培養(yǎng)板中，37℃過夜培養(yǎng)，對(duì)長出的克隆進(jìn)行PCR鑒定，共挑選5個(gè)克隆。其中PCR鑒定為陽性的克隆經(jīng)測序鑒定，證明BMP-2已經(jīng)定向連入pLVCT，命名為pLVCT-BMP-2。

在293T細(xì)胞中包裝慢病毒，根據(jù)pLVCTBMP-2、pMD2.G和psPAX2測得的濃度，算出包裝所需要的體積，分別于包裝后的48 h和72 h收獲病毒液，4℃保存。將1×106個(gè)ADSCs種植于10 cm皿中，待細(xì)胞80%融合后，在8 μg/mL的轉(zhuǎn)染增強(qiáng)劑聚凝胺存在的前體下，用收集的病毒液感染大鼠ADSCs，6 h后更換正常培養(yǎng)基。

1.2.2 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 Dox用于誘導(dǎo)BMP-2表達(dá)，根據(jù)以往的研究報(bào)道，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）耐受Dox的濃度大約為1~10 μg/mL[6-8]。為了評(píng)估Dox對(duì)ADSCs的毒性，將ADSCs種植于6孔板中（1×105個(gè)/孔），首先設(shè)置不同的Dox濃度梯度（0、2、5、6、7 μg/mL），初步篩選誘導(dǎo)劑合適作用濃度，倒置顯微鏡下觀察不同誘導(dǎo)濃度的誘導(dǎo)劑對(duì)ADSCs形態(tài)的影響；同時(shí)，將ADSCs種植于96孔板（1×103個(gè)/孔）中，72 h后采用MTT的方法在490 nm的吸光度下檢測以上不同濃度下細(xì)胞的活性變化。

為了進(jìn)一步優(yōu)化Dox的誘導(dǎo)濃度，再將轉(zhuǎn)染目的基因的ADSCs種植于6孔板中（1×105個(gè)/孔），添加不同濃度的Dox（0、1、3、5、5.5、6 μg/mL），通過在倒置顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)強(qiáng)度來判斷誘導(dǎo)劑調(diào)控基因誘導(dǎo)表達(dá)的效率；同時(shí)，72 h后提取不同濃度下細(xì)胞的RNA，設(shè)計(jì)合適的引物（表1），采用qRTPCR檢測不同誘導(dǎo)濃度下，目的基因的表達(dá)變化。

表1 qRT-PCR引物設(shè)計(jì)Tab 1 The design of qRT-PCR primer

1.2.3 BMP-2表達(dá)調(diào)控研究 將1×106個(gè)轉(zhuǎn)染目的基因的ADSCs種植于10 cm皿中，添加不同濃度的 Dox，72 h后提取不同誘導(dǎo)濃度下總蛋白，Western blot研究 Dox濃度梯度調(diào)控 BMP-2在ADSCs中表達(dá)的劑量依賴關(guān)系，采用Image J軟件通過灰度值分析，描繪誘導(dǎo)劑濃度與BMP-2相對(duì)表達(dá)量的關(guān)系。

1.2.4 調(diào)控BMP-2的慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建和鑒定 慢病毒表達(dá)載體pLVCT的作用原理：如圖1，pUC57-BMP-2重組質(zhì)粒經(jīng)克隆限制性內(nèi)切酶Pac I和MLu I酶切后可獲得長度為1 100 bp的片段產(chǎn)物（圖2A）?；厥漳康幕蚱魏兔盖泻蟮穆《颈磉_(dá)片段，將二者在室溫下經(jīng)酶聯(lián)、轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5α，接種于瓊脂培養(yǎng)板上，隨機(jī)挑選5個(gè)單克隆菌落行PCR鑒定，均為陽性，片段大小約為1 100 bp（圖2B）?；驕y序與Genbank中的參考序列一致，提示成功構(gòu)建HO-1基因慢病毒載體。再將陽性克隆的菌落通過搖菌、提質(zhì)粒的方式可大量獲得含目的基因的慢病毒表達(dá)載體。

圖1 pLVCT作用模式圖Fig 1 The pattern action of pLVCT

圖21 %瓊脂糖凝膠電泳Fig 2 1%agarose gel electrophoresis

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17．0統(tǒng)計(jì)軟件（SPSS公司，美國）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以s表示，兩組之間比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)0．05。

2 結(jié)果

2．1 誘導(dǎo)劑濃度的優(yōu)化 Dox濃度梯度為7 μg/mL時(shí)，ADSCs的形態(tài)發(fā)生改變（圖3），活性降低（圖4）。因此，筆者縮小Dox的誘導(dǎo)濃度，倒置熒光顯微鏡下觀察誘導(dǎo)劑濃度與熒光表達(dá)的劑量關(guān)系，發(fā)現(xiàn)Dox濃度梯度為5．5 μg/mL時(shí)，熒光強(qiáng)度較5 μg/mL沒有明顯增強(qiáng)（圖5）；以Dox濃度為0 μg/mL測得的BMP-2的mRNA為參照，其它不同濃度組BMP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較發(fā)現(xiàn)：Dox濃度為5 μg/mL時(shí)，mRNA的表達(dá)量較3 μg/mL增多，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），而與5．5 μg/mL差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）（圖6）。因此選擇Dox為（0、1、2、3、4、5 μg/mL）作為接下來的研究對(duì)象。

2．2 BMP-2表達(dá)調(diào)控研究 從Western blot結(jié)果中可知，Dox在0、1、2、3、4、5 μg/mL范圍內(nèi)，隨著Dox濃度的逐漸增加，BMP-2的表達(dá)逐漸增加（圖7A）；灰度值分析發(fā)現(xiàn)，Dox的誘導(dǎo)濃度與BMP-2的表達(dá)量存在一定的線性關(guān)系（圖7B），BMP-2在Dox為5μg/mL條件下，較0μg/mL表達(dá)明顯增多（P＜0．05）。

圖3 不同Dox濃度下，ADSCs細(xì)胞形態(tài)變化Fig 3 The cell morphological changes of ADSCs at different concentrations

圖4 不同Dox濃度下，細(xì)胞活性檢測Fig 4 The cell activity assay at different Dox concentrations

圖5 不同Dox濃度（0、1、3、5、5.5、6 μg/mL）下，熒光誘導(dǎo)強(qiáng)度變化Fig 5 At different Dox concentration(0，1，3，5，5.5，6 μg/mL),the change of the fluorescence induced intensity

圖6 不同Dox濃度下，BMP-2的mRNA表達(dá)變化Fig 6 The expression changes of mRNA of BMP-2 at different Dox concentrations

圖7 不同Dox濃度下，BMP-2在ADSCs中的誘導(dǎo)表達(dá)分析Fig 7 The analysis of the induced expression of BMP-2 in ADSCs at different Dox concentrations

3 討論

骨修復(fù)是細(xì)胞遷移、增殖、分化、基質(zhì)合成、礦化有序發(fā)生高度協(xié)調(diào)的過程[9]。研究發(fā)現(xiàn)，去除BMP-2可以阻止骨折的早期修復(fù)，即便補(bǔ)充上調(diào)BMP-4和-7也不能逆轉(zhuǎn)[3]，故BMP-2在骨修復(fù)中具有不可替代的作用。Gurkan等[10]研究骨髓提取物體外成骨分化過程中發(fā)現(xiàn)BMP-2在不同階段表達(dá)變化規(guī)律不同：BMP-2在2～7 d間高表達(dá)，上調(diào)Runx2、Smad4，使得細(xì)胞轉(zhuǎn)向成骨分化，隨后，BMP-2表達(dá)逐漸降低并維持在一定水平，在此過程中，成骨分化的細(xì)胞逐漸成熟。因此，調(diào)節(jié)BMP-2在骨修復(fù)中作用的時(shí)間和劑量是目前骨組織工程中研究的重點(diǎn)[2，4，11]。而基因調(diào)控技術(shù)的進(jìn)步為實(shí)現(xiàn)生長因子以時(shí)間和劑量依賴的作用方式提供有效途徑[12]。

3．1 基因調(diào)控技術(shù)的研究現(xiàn)狀 基因調(diào)控技術(shù)包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，前者包括細(xì)胞特異性調(diào)控系統(tǒng)、條件調(diào)控系統(tǒng)以及二者結(jié)合的調(diào)控系統(tǒng)[12]。目前，骨組織工程中基因精確調(diào)控的研究多利用條件調(diào)控系統(tǒng)，該系統(tǒng)通過影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA序列結(jié)合實(shí)現(xiàn)下游目的基因表達(dá)開放或關(guān)閉，它根據(jù)對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的作用原理不同，又可分為兩種：一種是通過添加生物小分子作為配體改變轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)象或結(jié)構(gòu)，即配體調(diào)控系統(tǒng)，包括四環(huán)素（Tetracycline,Tet）調(diào)控系統(tǒng)和雷帕霉素調(diào)控系統(tǒng)等；另一種是根據(jù)生理環(huán)境的變化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的功能狀態(tài)而影響目的基因表達(dá)，即生理調(diào)控系統(tǒng)，包括低氧調(diào)控系統(tǒng)和氧化應(yīng)激調(diào)控系統(tǒng)。

配體調(diào)控系統(tǒng)中小分子誘導(dǎo)劑與基因表達(dá)之間存在嚴(yán)格的劑量依賴關(guān)系，更能滿足BMP-2的表達(dá)特點(diǎn)，其中Tet調(diào)控系統(tǒng)最有前景，已在動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到初步驗(yàn)證[11]。該系統(tǒng)由Tet阻遏蛋白（Tet repressor protein,TetR） 或反義 TetR(reverse TetR,rTetR)、Tet操縱子序列（Tet operator，TetO）與四環(huán)素衍生物Dox組成，Dox的濃度對(duì)rTetR或TetR構(gòu)象改變存在劑量反應(yīng)關(guān)系，從而改變與TetO結(jié)合的強(qiáng)弱，根據(jù)rTetR或TetR對(duì)TetO結(jié)合后目的基因的轉(zhuǎn)錄方式不同可以分為Tet-On和Tet-Off兩大類，前者在添加Dox時(shí)改變r(jià)TetR構(gòu)象，使其與TetO結(jié)合增強(qiáng)，從而誘導(dǎo)下游BMP-2表達(dá)，且BMP-2表達(dá)量與誘導(dǎo)劑存在劑量依賴型關(guān)系；而Tet-Off系統(tǒng)中添加Dox時(shí)導(dǎo)致TetR構(gòu)象改變，與TetO結(jié)合增強(qiáng)，抑制下游BMP-2表達(dá)，后期當(dāng)需要BMP-2持續(xù)低表達(dá)時(shí)，Dox的持續(xù)添加會(huì)減低骨代謝率，因子Tet-On系統(tǒng)應(yīng)用范圍更廣[13]。為了實(shí)現(xiàn)BMP-2的調(diào)控表達(dá)，傳統(tǒng)的方法多采用兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染MSCs的方式，一個(gè)載體表達(dá)BMP-2，另一個(gè)載體表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子，調(diào)節(jié)BMP-2的表達(dá)，本研究中采用的慢病毒表達(dá)載體為單質(zhì)粒，既包含表達(dá)BMP-2的載體，又具有可調(diào)控BMP-2表達(dá)的激活因子；再將具有轉(zhuǎn)錄抑制作用的KRAB（Krüppelassociated box）基因序列整合到TetO上游，在未添加Dox時(shí)KRAB可以促進(jìn)TetR與TetO結(jié)合，故新得到的Tet-On系統(tǒng)降低目的基因的背景表達(dá)，即不添加Dox時(shí)無或僅有少量目的基因表達(dá)，同時(shí)單質(zhì)粒慢病毒轉(zhuǎn)染的方法提高了目的基因的轉(zhuǎn)染效率。

3.2 誘導(dǎo)劑濃度與目的基因表達(dá)的劑量依賴關(guān)系 該研究中構(gòu)建的單質(zhì)粒慢病毒Tet-On系統(tǒng)中，Dox作為誘導(dǎo)劑可在一定范圍內(nèi)通過濃度大小來控制目的基因的表達(dá)[14]，而骨修復(fù)后Dox的持續(xù)添加會(huì)影響骨代謝率[15]，因此，需要對(duì)Dox的誘導(dǎo)濃度進(jìn)行篩選。本研究中，在Dox小于6 μg/mL條件下，ADSCs培養(yǎng)72 h后，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生明顯改變，說明ADSCs可以耐受6 μg/mL的Dox。ADSCs這種耐受Dox藥理毒性的作用較軟骨細(xì)胞大[15]?？赡苁歉杉?xì)胞具有相對(duì)較強(qiáng)的增殖能力，可以抵抗細(xì)胞凋亡引起的數(shù)量的減少，而隨著Dox濃度的增加，當(dāng)Dox濃度為7 μg/mL時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，伴隨著細(xì)胞增殖能力的減弱。

為了進(jìn)一步研究Dox對(duì)目的基因的誘導(dǎo)效率，縮小Dox濃度范圍后，觀察Dox濃度與熒光表達(dá)強(qiáng)弱的關(guān)系，當(dāng)Dox濃度為5 μg/mL時(shí)，ADSCs的熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，約90%；當(dāng)Dox濃度增加至5.5 μg/mL時(shí)，熒光表達(dá)較5 μg/mL并沒有明顯增強(qiáng)，此外，BMP-2的mRNA相對(duì)表達(dá)量也證實(shí)Dox為5 μg/mL可作為轉(zhuǎn)染后ADSCs內(nèi)目的基因表達(dá)的最大誘導(dǎo)濃度。由于熒光表達(dá)基因位于目的基因下游，隨目的基因的表達(dá)而共同表達(dá)，其強(qiáng)度大小可以間接反映目的基因表達(dá)[16]，這些研究提示Dox濃度在5 μg/mL以內(nèi)，與BMP-2的表達(dá)可能存在劑量依賴性。

為了研究Dox誘導(dǎo)調(diào)控ADSCs中BMP-2表達(dá)，本研究采用了目前比較成熟的方法之一，Western blot，它可以通過特異性的抗體檢測細(xì)胞中目的基因的表達(dá)。在相同上樣量和曝光強(qiáng)度條件下，可以通過對(duì)基因表達(dá)的灰度值分析來判斷目的基因表達(dá)強(qiáng)弱[8]。本研究中，我們通過Image J軟件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Dox濃度在0~5 μg/mL之間增加，可誘導(dǎo)BMP-2基因表達(dá)的增多，二者之間存在劑量反應(yīng)關(guān)系。

綜上，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pLVCT-BMP-2表達(dá)載體，除了實(shí)現(xiàn)BMP-2蛋白的調(diào)控表達(dá)之外，還將綠色熒光蛋白作為報(bào)告基因，為體內(nèi)外研究骨修復(fù)過程的示蹤定位和誘導(dǎo)表達(dá)強(qiáng)度提供了一個(gè)重要且方便的工具，為下一步研究多因子聯(lián)合作用奠定基礎(chǔ)。

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（2015-12-06收稿）

Construction of a single vector in BMP-2 expression in a controlled manner and its expression in ADSCs

WANG Peng1,MIAO Jun2,FANG Cheng1,HU Yong-cheng2,CHEN Xiao-peng1
（1.Graduate School，Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Department of Orthopedics,Tianjin Hospital,Tianjin 300211, China）

Objective：To construct a single vector in BMP-2 expression in a controlled manner and investigate its expression in adipose derived stromal cells（ADSCs）.Methods：The lentiviral vector containing BMP-2 gene was constructed through genetic recombination and identified by bacterial PCR and sequence analysis.ADSCs were transfected by lenvirus collected from 293T cell.First,cell viability was analyzed through cell morphology and MTT assay at different induced concentrations of doxycyline(Dox).Second,to estimate the efficiency of the Tet-On and determine the optimal induction concentration of Dox,the strength of fluorescence was detected.The mRNA of BMP-2 was also analyzed through qRT-PCR.Lastly,the capacity of inducing BMP-2 expression in ADSCs by Dox was investigated by Western blot and densitometric analysis.Results：pLVCT-BMP-2 was successfully generated in this research by bacterial PCR and sequence analysis. The results indicated ADSCs from rat could stand up to 6 μg/mL Dox,and Dox of 5 μg/mL was finally determined as the optimal induction concentration.The densitometric analysis of BMP-2 expression showed that BMP-2 expression in ADSCs was in a dose-dependent manner.Conclusion：Lentiviral vector containing BMP-2 could be successfully generated.The conditional BMP-2 expression is regulated by Dox in a dose-dependent manner,providing the opportunity to explore BMP-2 expression and guide the bone healing process in vivo.

bone morphogenetic protein-2;gene controlling;doxycyline;adipose derived stromal cells;lentiviral vectors

R68

A

1006－8147（2016）03-0208-05

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81472140）；天津市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（12JCYBJC16400，14JCTPJC00487）

王鵬（1990-），男，碩士在讀，研究方向：骨外科；通信作者：胡永成，E-mail:yongchenghu@126.com。