李 靜，孫保存，2，孫 冉，趙秀蘭，2，董學(xué)易，2，趙 楠，2，古 強(qiáng)，2，張丹芳，2，劉鐵菊，2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，天津300052；3.天津市南開(kāi)醫(yī)院外科，天津300100）

論著

環(huán)氧合酶2通過(guò)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換促進(jìn)胃癌的侵襲與轉(zhuǎn)移

李 靜1，孫保存1，2，孫 冉3，趙秀蘭1，2，董學(xué)易1，2，趙 楠1，2，古 強(qiáng)1，2，張丹芳1，2，劉鐵菊1，2

（1.天津醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院病理科，天津300052；3.天津市南開(kāi)醫(yī)院外科，天津300100）

目的：探討環(huán)氧合酶2（COX-2）及Snail在胃癌組織中的表達(dá)及臨床意義，研究COX-2轉(zhuǎn)染對(duì)人胃癌細(xì)胞侵襲遷移能力的影響并探討其機(jī)制。方法：免疫組化檢測(cè)COX-2及Snail在100例胃癌組織中的表達(dá)情況，分析其與臨床資料的關(guān)系；篩選構(gòu)建COX-2穩(wěn)定表達(dá)的MKN74、MKN45細(xì)胞系；觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)、功能及相關(guān)蛋白的改變。結(jié)果：COX-2的表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、不良預(yù)后密切相關(guān)（P＜0.05）；Snail的表達(dá)與分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)（P＜0.05）；COX-2的表達(dá)與Snail之間存在相關(guān)性（P＜0.01）。與對(duì)照組相比，MKN74/COX-2細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)EMT形態(tài)學(xué)改變，E-cadherin表達(dá)下調(diào)、Vimentin表達(dá)上調(diào)，遷移侵襲能力明顯增強(qiáng)；MKN45/shCOX-2細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形變?yōu)殇伮肥瘶?，E-cadherin表達(dá)上調(diào)、Vimentin表達(dá)下調(diào)，遷移侵襲能力減弱。結(jié)論：COX-2可以通過(guò)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

胃癌；環(huán)氧合酶2；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換；細(xì)胞遷移；細(xì)胞侵襲

胃癌是我國(guó)常見(jiàn)的消化道腫瘤，臨床就診時(shí)大都已屬于中晚期，術(shù)后5年生存率在20%左右，而腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致患者預(yù)后較差的重要原因。環(huán)氧合酶（Cyclooxygenase，COX）是前列腺素合成過(guò)程中的一個(gè)重要的限速酶，其有兩種同工酶：COX-1和COX-2。COX-1屬于管家酶，主要存在于人正常組織中，催化產(chǎn)生前列腺素E2，在調(diào)節(jié)外周血管阻力、維持腎臟和胃的正常功能中起重要作用，COX-1不存在于炎癥部位。COX-2是誘導(dǎo)酶，在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或很少表達(dá)，在各種炎癥因子、腫瘤因子的刺激下迅速產(chǎn)生，并且在炎癥演變成腫瘤的過(guò)程中扮演著重要角色[1]。流行病學(xué)研究表明，規(guī)律且長(zhǎng)期的服用COX-2抑制劑減少了結(jié)腸癌的發(fā)病率，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)COX-2的表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生都有密切的關(guān)系[2-3]。為了探討COX-2在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系，本研究采用免疫組化檢測(cè)胃癌組織中COX-2、Snail的表達(dá)與臨床病理資料的關(guān)系，并利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡釋了COX-2促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，為采用COX-2抑制劑應(yīng)用于胃癌的預(yù)防與臨床治療提供借鑒意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 組織標(biāo)本 選取天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院和天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2004-2008年經(jīng)手術(shù)切除隨訪資料完整的100例胃癌患者的癌組織標(biāo)本作為研究對(duì)象，100例胃癌患者年齡為31~82歲，其中男性69例，女性31例。腫瘤最大者為20cm×6cm×3cm，最小者1 cm×1 cm×0.8 cm。根據(jù)Lauren分型將胃癌組織分為腸型和彌漫型，其中腸型52例（52%），彌漫型48例（48%）。根據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟、美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（UICC/AJCC）2010年分期標(biāo)準(zhǔn)，將胃癌組織分為Ⅳ期，其中Ⅰ/Ⅱ期51例（51%），Ⅲ/Ⅳ期49例（49%）。入組患者術(shù)前均未接受化療和放療。

1.1.2 細(xì)胞株 人胃癌細(xì)胞株MKN74購(gòu)于廣州吉妮歐有限公司；人胃癌細(xì)胞MKN45購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)，人腎癌293T細(xì)胞株由天津醫(yī)科大學(xué)病理實(shí)驗(yàn)室自存。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 DMED購(gòu)自美國(guó)Neuronbc公司，胎牛血清購(gòu)自Ggibco公司。PReceiver-Lv/COX-2慢病毒表達(dá)載體購(gòu)自GeneCopoeia公司；Transwell小室購(gòu)自FALCON公司。羊抗人多克隆抗體COX-2、兔抗山羊IgG抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。兔抗人多克隆抗體Snail、兔抗人單克隆抗體E-cadherin、兔抗人單克隆抗體Vimentin均購(gòu)自美國(guó)Abcom公司。兔抗人單克隆抗體β-actin購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司，PCR引物購(gòu)自中國(guó)廣州復(fù)能基因公司，RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自北京Tiangen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 胃癌組織石蠟包塊4 μm連續(xù)切片；脫蠟水化后3%過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，枸櫞酸鹽緩沖液微波修復(fù)10 min，血清封閉液室溫下封閉30 min，滴加一抗，4℃過(guò)夜，次日滴加二抗，DAB顯色，蘇木復(fù)染核，中性樹(shù)膠封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。采用Mattern[4]積分法評(píng)定染色結(jié)果：每例標(biāo)本選擇10個(gè)含有陽(yáng)細(xì)胞的高倍視野（400×）分別計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，取其平均值計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率。＜5%為0分，5%~25%為1分，26% ~50%為2分，＞50%為3分。染色強(qiáng)度無(wú)著色、淺黃、深黃、棕黃分別記為0、1、2、3分。陽(yáng)細(xì)胞比例得分和染色強(qiáng)度得分相加，結(jié)果＞3為陽(yáng)性，≤3為陰性。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系MKN74、MKN45在含10%FBS的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，放入37℃、5%CO2孵化箱中孵育，待細(xì)胞融合約90%時(shí)，胰酶消化傳代以保持細(xì)胞活力。

1.2.3 慢病毒包裝 PReceiverLv/COX-2慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建由GeneCopoeia公司協(xié)助完成，使用Stable-3感受態(tài)細(xì)胞擴(kuò)增質(zhì)粒，對(duì)COX-2表達(dá)質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒分別進(jìn)行高純度無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提，并通過(guò)紫外分光光度儀檢測(cè)質(zhì)粒濃度，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收獲上清液，1 000 r/min離心10 min，并用0.45 μm濾器過(guò)濾，收獲病毒液。

1.2.4 細(xì)胞感染和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞篩選 將細(xì)胞以1×105個(gè)的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合時(shí)，換為1 mL含5%滅活血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基，并加入1 mL病毒液，37℃，5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜。吸除含病毒液的培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基，并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的最佳濃度進(jìn)行puromycin篩選，MKN74最佳篩選濃度為0.4 μg/mL，MKN45最佳濃度為0.6 μg/mL，每3 d換液，并每日熒光顯微鏡下觀察熒光分布情況。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)檢測(cè) 在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下，將穩(wěn)轉(zhuǎn)后的細(xì)胞與對(duì)照組在倒置顯微鏡下觀察，比較兩者形態(tài)變化。

1.2.6 Western blot法檢測(cè) 用細(xì)胞裂解液RIPASDS裂解細(xì)胞，提取其總蛋白，使用12%聚丙烯酰胺凝膠80 V電泳2 h,250 mA恒流壓1.5 h，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入相應(yīng)一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日室溫恢復(fù)1 h，TBST洗膜3次，用相應(yīng)二抗室溫孵育2h。TBST洗膜3次，加入發(fā)光液，顯影，拍照。

1.2.7 PCR檢測(cè) 按照Trizol提取試劑盒，對(duì)每組細(xì)胞分別提取總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)定量后，按照cDNA試劑盒說(shuō)明反轉(zhuǎn)錄為cDNA并進(jìn)行PCR反應(yīng)。將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描結(jié)果，用Photoshop軟件進(jìn)行條帶灰度分析，分別計(jì)算與內(nèi)參的灰度值比。人COX-2的引物序列為F:5′-CTATGGGCAGAGAGAAGGAG-3′，R:5′-AGCTTGCA TGACCAGAACCC-3′；人E-cadherin的引物序列為F:5′-GTCACTGACACCAACGATAATCCT-3′，R:5′-GT CACTGACACCAACGATAATCCT-3′；Vimentin的引物序列為F:5′-TGGCACGTCTTGACCTTGAA-3′，R:5′-G GTCATCGTGATGCTGAGAA-3′；Snail的引物序列為F:5′-TTCTTCGCTACTGCTGCG-3′，R:5′-GGGCAG GTATGGAGA GGAAGA-3′；內(nèi)參GAPDH的引物序列為F:5′-CCTGGCCAAGGTCATCCATGAC-3′，R:5′-T GTCATACCAGGAAATGAGCTTG-3′。

1.2.8 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 以適當(dāng)?shù)拿芏葘⒓?xì)胞接種于6孔板，用100 μL移液槍頭對(duì)細(xì)胞表面劃一條痕跡，拍照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h后，在顯微鏡下觀察胃癌細(xì)胞的遷移變化情況并拍照測(cè)量劃痕距離，計(jì)算遷移率。

1.2.9 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 每個(gè)Transwell小室上表面加入稀釋過(guò)的Matrigel（Mstrigel與DMEM體積比1∶3）35 μL，并在培養(yǎng)箱中過(guò)夜，次日消化細(xì)胞，上室內(nèi)接種無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞，下室使用常規(guī)培養(yǎng)基，48 h后取出小室，用預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，棉簽拭去上室內(nèi)細(xì)胞，倒置顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野中細(xì)胞的數(shù)目，計(jì)算平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存率采用Kaplan-Meier法計(jì)算、Log rank檢驗(yàn)，相關(guān)檢驗(yàn)采用Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COX-2、Snail的表達(dá)與胃癌臨床病理資料特征的關(guān)系 COX-2的陽(yáng)性染色表現(xiàn)為癌細(xì)胞胞漿內(nèi)棕黃色顆粒，而癌組織間質(zhì)呈現(xiàn)陰性。100例胃癌標(biāo)本中有60例為陽(yáng)性表達(dá)（60%），胃癌組織中COX-2的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤組織學(xué)類(lèi)型無(wú)關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。COX-2在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌中的陽(yáng)性率為68.18%，而在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率為44.12%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；COX-2在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的組織中陽(yáng)性率為75.00%，而在無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中陽(yáng)性率為51.56%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。生存分析結(jié)果顯示，COX-2陽(yáng)性組較COX-2陰性組的生存時(shí)間短，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。Snail的陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞核，100例胃癌組織中有 70例為陽(yáng)性表達(dá)（70%），其表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤的大小、組織學(xué)類(lèi)型不相關(guān)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，COX-2的表達(dá)與Snail之間存在相關(guān)性（表1、2）。

圖1 COX-2（+）患者與COX-2(-)患者生存時(shí)間比較Fig 1 Comparison of survival time in patients of COX-2（+）and patients of COX-2(-)

表1 COX-2、Snail與胃癌臨床病理資料的關(guān)系Tab 1 Correlation between the expression of COX-2，Snail and clinicopathology in patients with gastric cancer

表2 COX-2、Snail的相關(guān)性分析Tab 2 Spearman analysis of the COX-2 and Snail

2.2 MKN74/control和MKN74/COX-2、MKN45/control和MKN45/shCOX-2細(xì)胞形態(tài)的改變 MKN74細(xì)胞轉(zhuǎn)染COX-2慢病毒載體后，與對(duì)照組比較，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，倒置相差顯微鏡觀察顯示，MKN74/control的細(xì)胞呈現(xiàn)典型上皮細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞排列緊密，而MKN74/COX-2的細(xì)胞連接更加疏松，細(xì)胞拉長(zhǎng)，呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞樣形態(tài)。MKN45/shCOX-2細(xì)胞由原來(lái)的短梭形轉(zhuǎn)變?yōu)殇伮肥瘶有螒B(tài)（圖2）。

2.3 MKN74細(xì)胞和MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后COX-2、Snail、E-cadherin、Vimentin蛋白、mRNA的表達(dá)變化 利用Western blot、PCR檢測(cè)MKN74/control和MKN74/COX-2細(xì)胞COX-2、Snail、E-cadherin、Vimentin蛋白、mRNA的表達(dá)變化情況發(fā)現(xiàn)，MKN74/COX-2細(xì)胞相比較MKN74/control細(xì)胞而言，COX-2表達(dá)上調(diào)，Snial表達(dá)上調(diào)，上皮性標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)性標(biāo)志物Vimentin表達(dá)上調(diào)。在MKN45細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染shCOX-2后，Snail、Vimentin蛋白及mRNA表達(dá)下調(diào)，COX-2、E-cadherin表達(dá)上調(diào)（圖3）。

圖2 MKN74/control、MKN74/COX-2及MKN45/control、MKN45/shCOX-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變(×200)Fig 2 The cells morphology showed significant changes among MKN74/control cells and MKN74/COX-2 cells，MKN45/ control cells and MKN45/shCOX-2 cells(×200)

圖3 MKN74細(xì)胞、MKN45細(xì)胞中COX-2、EMT相關(guān)蛋白、mRNA（E-cadherin、Vimentin以及Snail）的表達(dá)變化Fig 3 The changes in the expression of COX-2 and EMT-related protein，mRNA(E-cadherin，VimentinandSnail)expressionin MKN74 cells and MKN45 cells were detected by Western blot andPCR

2.4 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞遷移能力的比較 采用劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)COX-2過(guò)表達(dá)后對(duì)MKN74、MKN45細(xì)胞遷移能力的影響，實(shí)驗(yàn)表明，與對(duì)照細(xì)胞相比，MKN74/ COX-2細(xì)胞的遷移率顯著高于MKN74細(xì)胞，遷移能力顯著增強(qiáng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。MKN45/shCOX-2細(xì)胞的遷移率低于轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞，差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)定量分析比較MKN74/control與MKN74/COX-2細(xì)胞，MKN45/control與MKN45/shCOX-2細(xì)胞遷移能力變化Fig 4 The changes of migaration ability in MKN74/control and MKN74/COX-2 cells，MKN45/control and MKN45/shCOX-2cells were detected by wound healing assay

2.5 轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞侵襲能力的比較 經(jīng)視野計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)顯示，MKN74/COX-2細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠和濾膜的細(xì)胞數(shù)量明顯多于MKN74/control細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MKN74/COX-2細(xì)胞的侵襲能力明顯強(qiáng)于MKN74/control細(xì)胞。MKN45/ shCOX-2細(xì)胞穿過(guò)Matrigel膠和濾膜的細(xì)胞數(shù)量明顯少于MKN45/control細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。

圖5 比較MKN74/control與MKN74/COX-2細(xì)胞，MKN45/control與MKN45/shCOX-2細(xì)胞侵襲能力的變化Fig 5 ThechangesofinvasionabilityinMKN74/controlandMKN74/ COX-2 cells，MKN45/control and MKN45/shCOX-2 cells were detected by Transwell assay

3 討論

據(jù)2010年統(tǒng)計(jì)，中國(guó)約有404 565名胃癌患者，男性287 844例，女性116 721例，287 851例死亡，發(fā)病率居腫瘤發(fā)病率第3位，死亡率排第3位[5]。由此可見(jiàn)，胃癌仍是威脅人類(lèi)健康的惡性疾病之一，胃癌的高發(fā)病率、高死亡率給個(gè)人和社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

COX-2是一種炎性介質(zhì)，COX-2在胃癌組織中高表達(dá)，并成為判斷胃癌預(yù)后的獨(dú)立因素[6]。有研究表明，長(zhǎng)期且規(guī)律的服用阿司匹林或非甾體類(lèi)抗炎藥可以減低胃癌的發(fā)生率、轉(zhuǎn)移率和死亡率[7-8]。長(zhǎng)期服用COX-2抑制劑雖然增加了患心腦血管疾病的危險(xiǎn)，在萎縮性胃炎、腸上皮化生和胃癌癌前病變中，其心腦血管疾病的發(fā)生率卻并沒(méi)有上升[9]。因此，COX-2抑制劑在預(yù)防、治療胃癌的應(yīng)用中被寄予很高的期望。本研究結(jié)果表明，胃癌組織中COX-2蛋白表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在Snail的免疫組化實(shí)驗(yàn)中，其表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及臨床分期有關(guān)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman相關(guān)分析顯示，COX-2蛋白的表達(dá)與Snail蛋白的表達(dá)呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。熊正文等[10]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)Snail mRNA及COX-2 mRNA表達(dá)均與乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌組織中Snail mRNA及COX-2 mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)。以上結(jié)果提示，COX-2與Snail之間可能存在某種關(guān)系。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，它指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，促使靜止的上皮細(xì)胞失去極性，細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-間質(zhì)之間的黏附性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白重新排列，使細(xì)胞獲得更強(qiáng)遷移和侵襲能力[11]。其最主要的標(biāo)志是上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)的降低。E-cadherin屬于Ⅰ型跨膜糖蛋白，對(duì)維持細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)及粘附有重要作用[12]。Vimentin是中間絲蛋白家族的主要成員，幾乎表達(dá)于所有正常的間質(zhì)細(xì)胞，在維持細(xì)胞完整性和抵御外界應(yīng)急的損傷起了重要的作用[13]。Vimentin已經(jīng)成為發(fā)生EMT的重要標(biāo)志。在本實(shí)驗(yàn)中，上調(diào)COX-2表達(dá)后，MKN74細(xì)胞變?yōu)槎趟笮危珽-cadherin表達(dá)顯著降低，而Vimentin表達(dá)升高。細(xì)胞發(fā)生EMT，細(xì)胞間黏附連接和緊密連接破壞，最主要的標(biāo)志是上皮標(biāo)志E-cadherin表達(dá)的減少或丟失，并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化。因此，我們認(rèn)為轉(zhuǎn)染COX-2后的MKN74細(xì)胞發(fā)生了EMT。在惡性腫瘤中，E-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞間粘附功能減弱或丟失，使惡性腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶向周?chē)M織侵襲并向遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，這是腫瘤細(xì)胞獲得侵襲和轉(zhuǎn)移能力的第一步。在劃痕實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)中也證明了MKN74/COX-2細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)和侵襲能力增強(qiáng)，更進(jìn)一步說(shuō)明上調(diào)COX-2的表達(dá)能增強(qiáng)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力。而MKN45細(xì)胞下調(diào)COX-2表達(dá)后，E-cadherin表達(dá)增多，Vimentin表達(dá)減少，細(xì)胞由原來(lái)的短梭形轉(zhuǎn)變?yōu)殇伮肥瘶咏Y(jié)構(gòu)。說(shuō)明下調(diào)COX-2后的MKN45細(xì)胞間的黏附能力增強(qiáng)。劃痕及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明MKN45/shCOX-2細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)及侵襲能力減弱。以上結(jié)果說(shuō)明，COX-2表達(dá)增高能抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)EMT的發(fā)生，COX-2表達(dá)降低能促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)，從而抑制胃癌細(xì)胞EMT的發(fā)生。

EMT相關(guān)因子主要指影響表征蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，主要包括鋅指蛋白家族的Snail、Slug、ZEB1、E12/E47以及SIP1。本實(shí)驗(yàn)前部分的免疫組化實(shí)驗(yàn)也初步證實(shí)了COX-2、Snail與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且COX-2與Snail之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，為了進(jìn)一步說(shuō)明COX-2誘導(dǎo)胃癌EMT的相關(guān)機(jī)制，筆者檢測(cè)了Snail蛋白的表達(dá)量。Snail是一種鋅指蛋白結(jié)合因子，主要通過(guò)識(shí)別并結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子序列中的E-box元件，直接抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致E-cadherin分泌降低，從而影響了上皮間的粘連，促成EMT的發(fā)生[14]。在MKN74細(xì)胞中，上調(diào)COX-2表達(dá)后，Snail的表達(dá)也隨之上調(diào)，而在MKN45/shCOX-2細(xì)胞中，Snail的表達(dá)下降，在PCR實(shí)驗(yàn)中我們也發(fā)現(xiàn)了相同的結(jié)果。這說(shuō)明COX-2的表達(dá)促進(jìn)了Snail的生成，COX-2可以通過(guò)Snail通路誘導(dǎo)胃癌EMT的發(fā)生。Dohadwala等[15]在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的研究中發(fā)現(xiàn)，在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中阻斷COX-2表達(dá)后，Snail的表達(dá)降低，激活COX-2表達(dá)后，Snail的表達(dá)升高。應(yīng)用PGE2對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行干預(yù)，Snail的表達(dá)隨著PGE2劑量的增大而增高，兩者具有明顯相關(guān)性。結(jié)果提示COX-2可能通過(guò)前列腺素（PGE2）直接上調(diào)Snail的表達(dá)，從而調(diào)控E-cadherin的表達(dá)。COX-2是否還通過(guò)其它機(jī)制影響Snail仍不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

本實(shí)驗(yàn)的研究表明，COX-2與胃癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，并且預(yù)示著較差的預(yù)后。在人結(jié)腸癌[16]、肝癌[17]、乳腺癌[18]中，COX-2參與了EMT的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移侵襲能力。COX-2可以通過(guò)Snai/E-cadherin途徑誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，進(jìn)一步促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，這可能為胃癌的診斷、治療和COX-2抑制劑應(yīng)用于胃癌的預(yù)防與治療提供新的思路和啟示。

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（2016-01-25收稿）

Cyclooxygenase-2 promotes gastric cancer invasion and metastasis by inducing epithelial to mesenchymal transition

LI Jing1,SUN Bao-cun1,2,SUN Ran3,ZHAO Xiu-lan1,2,DONG Xue-yi1,2,ZHAO Nan1,2,GU Qiang1,2,ZHANG Dan-fang1,2,LIU Tie-ju1,2
（1.Department of Pathology,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China;2.Department of Pathology,General Hospital,Tianjin Medical University Tianjin 300052,China;3.Department of Surgery,Tianjin Nankai Hospital,Tianjin 300100,China)

Objective：To determine the expressions of Cyclooxygenase-2(COX-2)and Snail in gastric cancer,investigate the effect of COX-2 transduction on invasion and migration of gastric cancer cell lines of MKN74 and MKN45,and explore its related mechanism.Methods：The expressions of COX-2 and Snail were examined by immunohistochemical technique.Lentiviruses carrying COX-2 gene were constructed and transducted into MKN74 and MKN45.The changes in morphology,migration,invasion and protein were detected.Results：The expression of COX-2 was positively correlated with metastasis in lymph node and metastasis in distance（P＜0.05).Snail expression was related to stage,lymph node metastasis and distant metastasis in human gastric cancer（P＜0.05）.There was a positive correlation between COX-2 and Snail expressions（P＜0.01）.The MKN74/COX-2 cells showed EMT changes.The migration and invasion abilities were significantly enhanced.Knockdown of COX-2 resulted in inhibited EMT in MKN45 cells.Migration and invasion abilities were significantly receded in MKN45/shCOX-2 cells.Conclusion：COX-2 plays an important role in the origin and development of gastric cancer,COX-2 through EMT promotes the migration and invasion abilities in gastric cancer cells.

gastric cancer;COX-2;epithelial to mesenchymal transition;migration;invasion

R735.2

A

1006-8147（2016）03-0185-06

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目基金資助（81230050）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目基金資助（81572872）

李靜（1986-），女，碩士在讀，研究方向：腫瘤血管生成；通信作者：孫保存，E-mail：Sunbaocun@aliyun.com。