陳家浩，方海軍，秦 楠，2，段宏泉，2

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究中心，天津300070）

論著

紫羅蘭酮酰胺衍生物的合成與抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性研究

陳家浩1，方海軍1，秦 楠1，2，段宏泉1，2

（1.天津醫(yī)科大學藥學院，天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點實驗室，天津300070；2.天津醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學研究中心，天津300070）

目的：研究紫羅蘭酮酰胺衍生物的合成與抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。方法：以α-紫羅蘭酮為原料，經(jīng)鹵仿反應(yīng)、烯丙位氧化反應(yīng)和酰胺化反應(yīng)得到目標化合物2a-f和4a-f,所有衍生物均評價其抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性。結(jié)果：合成得到兩個系列共12個紫羅蘭酮酰胺衍生物，所有化合物都經(jīng)過1H NMR、13C NMR和ESI-MS表征了化學結(jié)構(gòu)。與陽性對照化合物LY204002相比，化合物4f具有較強的抗腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。結(jié)論：紫羅蘭酮酰胺衍生物中叔胺基團和3位羰基很可能是發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的必需基團。

紫羅蘭酮；酰胺衍生物；抗腫瘤轉(zhuǎn)移

乳腺癌是在女性患者中最常見的惡性腫瘤，是全世界癌癥相關(guān)死亡率的第二大疾病[1-2]。腫瘤轉(zhuǎn)移是乳腺癌死亡的主要誘因[3-4]。轉(zhuǎn)移是一個多步驟的過程，其包括癌細胞從原發(fā)腫瘤脫離、遷移、粘附，進入血液或淋巴循環(huán)系統(tǒng)，外滲出循環(huán)系統(tǒng)，進入組織并形成轉(zhuǎn)移灶[5-6]。因此，深入了解腫瘤轉(zhuǎn)移的基本機制，尋求抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的新策略，發(fā)現(xiàn)抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物是有效預防和治療惡性腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。近年來，隨著研究人員對天然產(chǎn)物成分研究的不斷深入，許多天然產(chǎn)物以及其衍生物顯示了確切的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性[7]。其中生物堿類化合物活性較強，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的發(fā)現(xiàn)提供了苗頭化合物[8]。土家族傳統(tǒng)藥物轉(zhuǎn)筋草中含有大量的生物堿成分。課題組前期活性篩選發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)筋草的乙醇提取物在濃度為1 μg/mL和5 μg/mL時，對人乳腺癌細胞MDA-MB-231趨化遷移作用的抑制率分別達到了66%和95%。為此進一步開展了抗腫瘤轉(zhuǎn)移化學成分研究，并分離得到活性化合物紫羅蘭酮生物堿，該結(jié)構(gòu)骨架為首次發(fā)現(xiàn)的新天然生物堿結(jié)構(gòu)骨架。該化合物具有較強的抑制MDA-MB-231細胞轉(zhuǎn)移活性。其半數(shù)抑制濃度IC50為1.6 μmol/L[9]。本文以α-紫羅蘭酮為原料，在前期研究的基礎(chǔ)上，設(shè)計并合成了一系列紫羅蘭酮酰胺衍生物，并結(jié)合體外活性篩選，期望得到抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性更強的衍生物，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)提供工具化合物。

1 材料與方法

1.1 化合物設(shè)計思路

1.2 儀器和試劑 Bruker Advance III 400MHz核磁共振儀（TMS內(nèi)標）；循環(huán)水式多用真空泵SHB-IIIA；Bruker Esquire 3000離子阱質(zhì)譜儀；IKA?R ETS-D5加熱磁力攪拌器；α-紫羅蘭酮純度為99%，購買于希爾貝思（天津）科技有限公司；柱色譜和薄層色譜用硅膠均系青島海洋化工廠生產(chǎn)，所用試劑均為分析純；氘代試劑系A(chǔ)LDRICH公司生產(chǎn)；人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，購自中國科學院上海細胞庫。

1.3 合成方法

1.3.1 合成路線 目標化合物的合成路線如圖1所示。

圖1 目標化合物的合成路線Fig 1 Synthetic route of target compounds

1.3.2 目標化合物的結(jié)構(gòu) 本文合成的目標化合物結(jié)構(gòu)如表1所示。

表1 目標化合物結(jié)構(gòu)Tab 1 The structure of the title compounds

1.3.3 目標產(chǎn)物2a-f的合成通法 稱取1當量化合物1和1.2當量N,N-羰基二咪唑于反應(yīng)瓶中，加入適量四氫呋喃使其溶解，室溫下攪拌1 h后加入1.1當量原料胺，室溫攪拌過夜。TLC監(jiān)測反應(yīng)完全。向反應(yīng)液中加入1 N稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為中性，二氯甲烷萃取反應(yīng)液。再依次用飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水溶液洗滌后，收集有機相，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮后得粗品。粗品經(jīng)硅膠柱層析得到目標化合物。

1.3.4 目標產(chǎn)物4a-f的合成通法

1.3.4.1 目標產(chǎn)物4a-c的合成通法：稱取1當量原料和0.2當量無水氯化鈣于反應(yīng)瓶中，加入適量乙腈和5當量過氧叔丁醇，于60℃反應(yīng)數(shù)小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后，向反應(yīng)液中加入10%硫代硫酸鈉水溶液，以二氯甲烷萃取，再用飽和食鹽水洗滌有機相，收集有機相，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮后得粗品。粗品經(jīng)硅膠柱層析得到目標化合物4a-c。

1.3.4.2 目標產(chǎn)物4d-f的合成通法：稱取1當量化合物3和1.2當量N，N-羰基二咪唑于反應(yīng)瓶中，加入適量四氫呋喃使其溶解，室溫下攪拌1 h后加入1.1當量原料，室溫攪拌數(shù)小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)完全后向反應(yīng)液中加入1 N稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為中性，二氯甲烷萃取反應(yīng)液。再依次用飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水溶液洗滌后，收集有機相，有機相用無水硫酸鎂干燥，過濾，濃縮后得粗品。粗品經(jīng)硅膠柱層析得到目標化合物4d-f。

1.4 抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性篩選實驗

1.4.1 MTT法篩選衍生物對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的非細胞毒濃度 首先測定各化合物對人乳腺癌細胞的毒性，選擇非細胞毒性的濃度進行抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性篩選（細胞毒性測定結(jié)果省略）[10]。

1.4.2 Transwell Chemotaxis方法篩選衍生物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性

1.4.2.1 趨化小室濾膜包被：置于10 μg/mL濃度的Fibronectin中（溶于無血清RPMI1640培養(yǎng)液）4℃包被過夜，室溫晾干，光面朝下，左上剪角后，備用。1.4.2.2 化合物樣品與細胞共培養(yǎng)：將MD-MBA-231細胞鋪于6孔板，在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h使其貼壁，24 h后6孔板內(nèi)加入化合物樣品，并在37℃、5%CO2孵箱內(nèi)共孵育24 h。

1.4.2.3 趨化實驗：將用化合物樣品處理過的細胞分別用0.25%的胰蛋白酶消化液消化后，用含10% FBS培養(yǎng)液停止消化，該細胞懸液1 000 r/min離心5 min。棄去上清，加入0.1%的BM液將細胞混勻后，再次1 000 r/min離心5 min后，計數(shù)，將細胞密度調(diào)成5×105個/mL，置于孵箱內(nèi)備用。配制趨化因子（EGF）溶液，加于趨化小室的下室，每孔30 μL。蓋上包被好的膜，左上剪角光面向下，鋪于下室。放置膠墊，固定上室。在上室加入之前準備好的細胞懸液，每孔50 μL。每個化合物樣品濃度3個復孔，加好后置于 37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)3.5 h。3.5 h后取出下室，刮去沒有穿過的細胞。把膜置于培養(yǎng)皿中干燥，然后用三步染色試劑盒進行固定與染色。之后將膜用石蠟油固定，顯微鏡下計數(shù)，每孔3~5個視野，各視野細胞數(shù)求平均值，3個孔求平均值。計算公式為：抑制率=（1-化合物樣品處理的細胞的趨化細胞數(shù)/正常細胞的趨化細胞數(shù)）×100%

2 結(jié)果

2.1 目標化合物的結(jié)構(gòu)表征 化合物2a為無色油狀物，產(chǎn)率為45.0%。1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 6.66(dd,J=15.2 Hz,9.6 Hz,1H),5.87(br s,1H),5.76 (d,J=15.2 Hz,1H),5.46 (br s,1H),2.88 (d,J=4.8 Hz,3H),2.94(d,J=9.6 Hz,1H),2.01(m,2H),1.56(d, J=1.2 Hz,3H)。1.47(m,1H),1.18(m,1H),0.90(s, 3H),0.85(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ 166.6, 145.0,132.3,124.7,122.2,53.8,32.4,31.1,27.7,26.8, 26.3,23.0,22.8。ESI-MS m/z:207.3[M+H]+。

化合物2b為無色油狀物，產(chǎn)率為40.4%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.72(dd,J=15.0 Hz,9.7 Hz,1H),6.21(d,J=15.0 Hz,1H),5.47(br s,1H),3.05 (s,6H),2.29(d,J=9.7 Hz,1H),2.03(m,2H),1.58(d, J=1.6 Hz,3H),1.50 (m,1H),1.19 (m,1H),0.92(s, 3H),0.87 (s,3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3):δ 166.8,146.8,132.3,122.2,121.3,54.3,32.4,31.2, 27.7,26.9,23.0,22.9。ESI-MS m/z:222.1[M+H]+。

化合物2c為無色油狀物，產(chǎn)率為41.6%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.65(dd,J=14.8 Hz,9.6 Hz,1H),5.71(d,J=14.8 Hz,1H),5.62(d,J=6.8 Hz, 1H),5.44(br s,1H),4.14(m,1H),2.22(d,J=9.6 Hz, 1H),2.00(d,J=1.6 Hz,1H),1.55(d,J=1.6 Hz,3H), 1.47(m,1H),1.17(d,J=6.4 Hz,6H),1.12(m,1H), 0.90(s,3H),0.84(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3): δ 164.9,144.8,132.4,125.1,122.1,53.8,44.3,32.4, 31.1,27.8,26.8,23.0,22.9,22.8。ESI-MS m/z:236.2 [M+H]+。

化合物2d為無色油狀物，產(chǎn)率為26.2%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.67(dd,J=15.0 Hz,9.6 Hz,1H),6.20(d,J=15.0 Hz,1H),5.47(br s,1H),3.56 (m,4H),2.28(d,J=9.6 Hz,1H),2.03(br s,1H),1.66 (m,2H),1.59(br s,6H),1.49(m,1H),1.19(m,1H), 0.92(s,3H),0.87(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3): δ 165.5,146.2,132.5,122.1,121.7,54.3,32.4,31.3, 27.7,26.9,24.7,23.0,22.9。ESI-MSm/z:262.2[M+H]+。

化合物2e為無色油狀物，產(chǎn)率為19.8%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.75(dd,J=15.0 Hz,9.7 Hz,1H),6.15(d,J=15.0 Hz,1H),5.48(br s,1H),3.59 (m,8H),2.28(d,J=9.7 Hz,1H),2.03(br s,2H),1.57 (d,J=1.4 Hz,3H),1.47(m,1H),1.22(m,1H),0.92(s, 3H),0.86(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ 165.6, 147.7,132.1,122.4,120.5,66.8,54.3,32.5,31.2,27.7, 26.9,23.0,22.9。ESI-MS m/z:264.1[M+H]+。

化合物2f為黃色油狀物，產(chǎn)率為18.6%。1H NMR(400 MHz,CDCl3):δ 6.70(dd,J=15.1 Hz,9.6 Hz,1H),6.04(br s,1H),5.75(d,J=15.1 Hz,1H),5.46 (br s,1H),3.40(q,J=5.7 Hz,2H),2.45(t,J=5.9 Hz, 2H),2.25(s,7H),2.02(br s,2H),1.56(d,J=0.92 Hz, 3H),1.46(m,1H),1.17(m,1H),0.91(s,3H),0.85(s, 3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3):δ 165.7,145.2, 132.4,124.7,122.2,57.8,53.8,45.2,36.7,32.5,31.1, 27.7,26.9,23.0,22.9。ESI-MS m/z:265.2[M+H]+。

化合物4a為黃色油狀物，產(chǎn)率為23.2%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.79(dd,J=15.2 Hz,9.4 Hz,1H),5.96(br s,1H),5.91(br s,1H),5.87(d,J= 15.2 Hz,1H),2.89(d,J=4.9 Hz,3H),2.70(d,J=9.4 Hz,1H),2.37(d,J=16.8 Hz,1H),2.10(d,J=16.8 Hz, 1H),1.89(s,3H),1.06(s,3H),1.01(s,3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3):δ 198.8,165.5,160.0,140.4,126.7, 126.6,54.9,47.3,36.7,28.0,27.2,26.4,23.6。ESIMS m/z:222.1[M+H]+。

化合物4b黃色油狀物，產(chǎn)率為22.4%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.82(dd,J=14.8 Hz,9.6 Hz,1H), 6.36(d,J=14.8 Hz,1H),5.98(s,1H),3.10(s,3H), 3.05(s,3H),2.74(d,J=9.6 Hz,1H),2.40(d,J=16.8 Hz,1H),2.12(d,J=16.8 Hz,1H),1.92(d,J=1.2 Hz, 3H),1.08(s,3H),1.02(s,3H)。13C NMR(100 MHz, CDCl3):δ 169.8,165.7,159.8,142.0,126.7,123.5, 55.4,47.4,36.7,28.0,27.2,23.6。ESI-MS m/z:236.1 [M+H]+。

化合物4c為無色油狀物，產(chǎn)率為21.7%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6.80 (dd,J=15.2 Hz,9.2 Hz,1H),5.97 (s,1H),5.81 (d,J=15.2 Hz,1H),5.46 (d,J=6.4 Hz,1H),4.15(m,1H),2.70(d,J=9.2 Hz, 1H),2.38 (d,J=16.8 Hz,1H),2.10 (d,J=16.8 Hz, 1H),1.91(d,J=0.8 Hz,3H),1.21(d,J=5.6 Hz,6H), 1.08(s,3H),1.03(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3): δ 198.8,163.8,160.0,140.4,127.0,126.7,54.9,47.3, 41.6,36.8,28.0,27.2,23.7,22.8。ESI-MS m/z:250.2 [M+H]+。

化合物4d為無色油狀物，產(chǎn)率為37.9%。1HNMR (400 MHz,CDCl3):δ 6．74(dd,J=14．9 Hz,9．5 Hz,1H),6．34(d,J=15．0 Hz,1H),5．93(br s,1H),3．58 (br s,2H),3．45 (br s,2H),2．70 (d,J=9．5 Hz,1H), 2．35 (d,J=16．8 Hz,1H),2．08 (d,J=16．7 Hz,1H), 1．88(s,3H),1．57(br s,6H),1．04(s,3H),0．98(s,3H)。13C NMR (100 MHz,CDCl3):δ 198．7,164．4,159．9, 141．5,126．6,123．9,55．4,47．4,36．6,27．9,27．1,25．5, 24．5,23．6。ESI-MS m/z:276．3[M+H]+。

化合物4e為無色油狀物，產(chǎn)率為37．9%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6．86(dd,J=15．0 Hz,9．4 Hz,1H),6．31(d,J=15．0 Hz,1H),5．98(br s,1H),3．71 (br s,6H),3．55 (br s,2H),2．74 (d,J=9．4 Hz,1H), 2．38 (d,J=16．8 Hz,1H),2．12 (d,J=16．7 Hz,1H), 1．91(s,3H),1．08(s,3H),1．02(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3):δ 198．6,164．5,159．5,143．1,126．8, 122．6,55．4,47．4,36．7,28．0,27．2,23．6,19．2。ESIMS m/z:278．3[M+H]+。

化合物4f為無色油狀物，產(chǎn)率為52．4%。1H NMR (400 MHz,CDCl3):δ 6．81(dd,J=15．1 Hz,9．3 Hz,1H),6．19(br s,1H),5．97(s,1H),5．88(d,J=15．1 Hz,1H),3．42 (q,J=5．6 Hz,1H),2．70 (d,J=9．3 Hz, 1H),2．47(t,J=5．8 Hz,1H),2．38(d,J=16．7 Hz,1H), 2．26(s,6H),2．10 (d,J=16．7 Hz,1H),1．90 (s,3H), 1．07(s,3H),1．02(s,3H)。13C NMR(100 MHz,CDCl3): δ 189．7,164．7,159．8,140．5,126．8,126．7,57．6,54．9, 47．3,45．1,36．8,36．7,28．0,27．2,23．6。ESI-MS m/z: 279．1[M+H]+。

2．2 目標化合物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性評價 各衍生物對EGF誘導的MD-MBA-231乳腺癌細胞趨化轉(zhuǎn)移運動的抑制作用如表2所示。

表2 衍生物對EGF誘導的MDA-MB-231乳腺癌細胞趨化運動抑制作用Tab 2 Inhibiting effects of derivatives on the EGF-induced migration of MDA-MB-231 cells

3 討論

在抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性篩選中，筆者選擇了文獻和本課題組研究報告[9,11-12]所用的陽性對照化合物LY294002為PI3K抑制劑[13]，對本文合成的紫羅蘭酮酰胺衍生物篩選結(jié)果表明，相比于陽性對照LY294002，化合物4f的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移活性較強，這可能和化合物4f含有堿性叔胺基團有關(guān)，叔胺基團的堿性強于酰胺基團，能與含有酸性氨基酸殘基的蛋白結(jié)構(gòu)域相互作用。同時，化合物4f與2f相比在紫羅蘭酮母核3位多了羰基，羰基可以作為氫鍵受體與蛋白質(zhì)中的氫鍵供體基團，如羥基、氨基等基團發(fā)生氫鍵作用。綜上所述，先導化合物中叔胺基團和3位羰基很可能是發(fā)揮抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用的必需基團。這為該類活性天然產(chǎn)物的深入研究提供了重要實驗依據(jù)。

[1] AL-Hajj M,Wicha M S,Benito-Hernandez A,et al．Prospective identificationoftumorigenicbreastcancercells[J]．ProcNatlAcadSci, 2003,100(7):3983

[2] Davis N M,Sokolosky M,Stadelman K,et al．Deregulation of the EGFR/PI3 K/PTEN/Akt/mTORC1 pathwayinbreastcancer: possibilities for therapeutic intervention[J]．Oncotarget,2014,5(13): 4603

[3] Lu J,Steeg P S,Price J E,et al．Breast cancer metastasis:challenges and opportunities[J]．Cancer Res,2009,69(12):4951

[4] ChiangAC,MassaguJ．Molecular basis of metastasis[J]．NEnglJMed, 2008,359(26):2814

[5] Culhane A C,Quackenbush J．Confounding effects in“A six-gene signature predicting breast cancer lung metastasis”[J]．Cancer Res, 2009,69(18):7480

[6] Ming A J,Kang Y,Serganova I,et al．Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors[J]．J Clin Invest,2005,115(1):44

[7]姜永莉,劉兆鵬．天然多酚衍生物抗腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移研究進展[J]．中國藥物化學雜志，2011，21（1）：60

[8]嚴淑，劉寶瑞．七種天然生物堿抗腫瘤作用研究進展[J]．現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學，2010，18（6）：1227

[9] Jin M N,Ma S N,Zhai H Y,et al．A New megastigmane alkaloid from pachysandra terminalis with antitumor metastasis effect[J]．Chem Nat Compd,2015,51(2):311

[10]Wu J,Zhang B,Wu M,et al．Screening of a PKC zeta-specific kinase inhibitor PKCzI257．3 which inhibits EGF-induced breast cancer cell chemotaxis[J]．Invest New Drugs,2010,28(3):268

[11]Zhai H Y,Zhao C,Zhang N,et al．Alkaloids from Pachysandra terminalis inhibit breast cancer invasion and have potential for developmentasantimetastasistherapeuticagents[J]．JNatProd,2012, 75(7):1305

[12]Wang H L,Qin N,Liu J,et al．Synthesis and antimetastatic effects of E-salignone amide derivatives[J]．Drug Dev Res,2014,75(2):76

[13]Yanamandra M,Mitra S,Giri A．Development and application of PI3Kassaysfornoveldrugdiscovery[J]．ExpertOpinDrugDiscov,2015, 10（2）:171

（2015-11-05收稿）

Study on the ionone amide derivatives synthesis and anti-tumor metastatic effect

CHEN Jia-hao1,FANG Hai-jun1,QIN Nan1,2,DUAN Hong-quan1,2
（1.School of Pharmacy,Tianjin Medical University,Tianjin Key Laboratory on Technologies Enabling Development of Clinical Therapeutics and Diagnostics(Theranostics),Tianjin 300070,China;2.Research Center of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China）

Objective：To study the ionone amide derivatives synthesis and anti-metastatic activities.Methods：Target compounds 2a-f and 4a-f were prepared by haloform reaction,allylic oxidation,amidation reaction from α-ionone as starting material.Results：Twelve ionone amide derivatives were synthesized by organic chemistry reactions.All of the compounds were identified by1H-NMR,13C-NMR and ESI-MS.Compared to the positive control compound LY294002,these results showed that compound 4f had significant anti-metastasis effect.Conclusion：The tertiary amine group and carbonyl group at C-3 position of ionone amide derivatives may be the essential in the anti-tumor metastasis.

ionone;amide derivative;anti-metastasis

R9

A

1006－8147（2016）03-0191-04

國家自然科學基金面上項目基金資助（81373297）

陳家浩（1989-），男，碩士在讀，研究方向：天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)改造；通信作者：段宏泉，E-mail:duanhq@tijmu.edu.cn。