馬宏偉　孫緒丁　田汝芳

1.山東金訶藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司，山東　濟(jì)南　250101；2.山東健康藥業(yè)有限公司，山東　濟(jì)南　250022Z

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HPLC法測(cè)定坐珠達(dá)西中西紅花苷的含量

馬宏偉1孫緒丁1田汝芳2

1.山東金訶藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司，山東濟(jì)南250101；2.山東健康藥業(yè)有限公司，山東濟(jì)南250022Z

【摘要】目的：建立測(cè)定坐珠達(dá)西中西紅花含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Waters C(18)(250mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.05mol/L醋酸銨(40∶5∶55)，檢測(cè)波長(zhǎng)為440nm；流速為1ml/min；柱溫為30℃。結(jié)果：西紅花苷Ⅰ的質(zhì)量濃度在6.208μg/ml～62.08μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線(xiàn)性關(guān)系(r=0.9997)；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD<2%；平均加樣回收率為98.31%，RSD=0.86%(n=6)；西紅花苷Ⅱ的質(zhì)量濃度在3.072～30.72μg/ml范圍內(nèi)與其峰面積積分值呈良好線(xiàn)性關(guān)系(r=0.9999)；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性的RSD<2%；平均加樣回收率為97.69%，RSD=0.99%(n=6)。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于坐珠達(dá)西中西紅花苷的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】坐珠達(dá)西；西紅花苷Ⅰ；西紅花苷Ⅱ；高效液相色譜法

坐珠達(dá)西由寒水石、丁香、西紅花、肉豆蔻等35味藥材組成[1]，是藏醫(yī)治療慢性胃炎的常用藥物[2]。坐珠達(dá)西中的西紅花又稱(chēng)藏紅花，為鳶尾科植物番紅花CrocussativusL.的干燥柱頭[3]，為貴重藥材，其主要有效成分為西紅花酸和西紅花苷，藥典以西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的含量來(lái)控制西紅花的質(zhì)量?，F(xiàn)有測(cè)定西紅花中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的方法較多，但均不適用于成分復(fù)雜的藏藥制劑坐珠達(dá)西[4-9]。為此，建立坐珠達(dá)西中西紅花苷的含量測(cè)定方法，為該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高提供參考依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器高效液相色譜儀(日立L-7110泵，日立L-7420紫外檢測(cè)器);KQ-300B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；AUW220D型電子天平(日本)。1.2材料西紅花苷Ⅰ(批號(hào)：111588-201303)、西紅花苷Ⅱ(批號(hào)：111589-201304)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢驗(yàn)研究院;坐珠達(dá)西(批號(hào)：20140501、20140502、20140503金訶藏藥股份有限公司)；甲醇、乙腈均為色譜純(美國(guó)fisher公司)，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Waters C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.05mol/L醋酸銨(40∶5∶55)；檢測(cè)波長(zhǎng)：440nm；流速：1ml/min；柱溫：30℃。理論板數(shù)按紅花苷Ⅰ峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。見(jiàn)圖1。

2.2溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液取西紅花苷Ⅰ對(duì)照品約15mg，精密稱(chēng)定為15.52mg，置10ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得1.552mg/ml的西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液；取西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌芳s7.5mg，精密稱(chēng)定為7.68mg，置10ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得0.768mg/ml的西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤?；精密量取上述西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤焊?ml，置同一50ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含西紅花苷Ⅰ為31.04μg/ml，含的西紅花苷Ⅱ?yàn)?5.36μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液取坐珠達(dá)西樣品，研細(xì)，過(guò)3號(hào)篩，取粉末1g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入60%甲醇25ml，稱(chēng)定重量，冰浴中超聲處理20min，放至室溫，再稱(chēng)定重量，用60%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3線(xiàn)性關(guān)系考察精密量取“2.2.1”項(xiàng)下西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤焊?ml，置于50ml量瓶中，加60%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得含西紅花苷Ⅰ為62.08μg/ml，含西紅花苷Ⅱ?yàn)?0.72μg/ml的混合對(duì)照品溶液，分別精密量取上述混合對(duì)照品溶液1、3、5、8，10ml，置10ml量瓶中，用60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量10μl，記錄色譜峰峰面積。以西紅花苷Ⅰ峰面積(A)對(duì)對(duì)照品濃度(C)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A=22532.96C-1266.18(r=0.9997)；以西紅花苷Ⅱ峰面積(A)對(duì)對(duì)照品濃度(C)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程為A=27149.44C+1868.11(r=0.9999)。結(jié)果表明，西紅花苷Ⅰ在6.208～62.08μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，西紅花苷Ⅱ在3.072～30.72μg/ml濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.4精密度試驗(yàn)取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10μl，記錄峰面積。結(jié)果，西紅花苷Ⅰ峰面積的RSD為0.15%(n=6)，結(jié)果，西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD為0.90%(n=6)，表明儀器的精密度良好。

2.5穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別于放置0、2、4、6、8h進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量10μl，記錄峰面積。結(jié)果，西紅花苷Ⅰ峰面積的RSD為0.14%(n=6)，結(jié)果，西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD為0.19%(n=6)，表明供試品溶液在12h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.6重復(fù)性試驗(yàn)取同一樣品，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。結(jié)果，西紅花苷Ⅰ峰面積的RSD為0.46%(n=6)，西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD為1.00%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7加樣回收率試驗(yàn)取已知含量的樣品0.5g，共6份，分別加入一定體積的對(duì)照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品含量，并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1　西紅花苷Ⅰ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2　西紅花苷Ⅱ加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.8樣品含量測(cè)定取三個(gè)批號(hào)的樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3討論

坐珠達(dá)西收載于衛(wèi)生部藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)中，原標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有含量測(cè)定項(xiàng)。藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)并未公布坐珠達(dá)西的全部處方，在已知原藥材中，西紅花是貴重藥材，應(yīng)當(dāng)建立含量測(cè)定方法。但由于該產(chǎn)品由35味藥材組成，成分復(fù)雜，現(xiàn)有關(guān)于西紅花中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量測(cè)定方法并不適用，或保留時(shí)間長(zhǎng)，或分離度差。經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，建立了本文所述方法，可以同時(shí)測(cè)定西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ，保留時(shí)間適中，分離度好，操作簡(jiǎn)單，可用于坐珠達(dá)西中西紅花的含量測(cè)定。

參考文獻(xiàn)

[1] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(藏藥第一冊(cè))[S].北京：人民衛(wèi)生出版社，1995：318.

[2] 董紅嬌，曾銳.坐珠達(dá)西組分的定性鑒別研究[J].西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2014，40(6)：853-860.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：129-130.

[4] 張留記，劉欽松，屠萬(wàn)清，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地梔子中梔子苷、西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ的含量[J].中國(guó)藥房，2011，22(7)：630-632.

[5] 候金燕，羅琳，竇志華，等.HPLC-DAD測(cè)定茵陳蒿湯中兒茶素、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，21(6)：48-51.

[6] 朱芳萍，呂偉旗，張青蓮，等.藏紅花有效成分含量比較與相關(guān)性研究[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志，2015，25(4)：345-349.

[7] 李蘭茹，馬慧萍，何蕾，等.蟲(chóng)草保元膠囊中西紅花苷-Ⅰ和西紅花苷-Ⅱ含量測(cè)定[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2014，33(3)：370-372.[8] 袁瑞瑛，歐珠羅布，江春艷，等.二十五味珊瑚丸中西紅花苷Ⅰ&Ⅱ的含量測(cè)定研究[J].西藏大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2012，27(1)：36-39.

[9] 錢(qián)勇，許紀(jì)鋒，諸晨，等.西紅花中西紅花苷Ⅰ和苷Ⅱ的含量測(cè)定[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2015，6(7)：2822-2827.

Content Determination of croci stigma in zuozhudaxi by HPLC

MA Hongwei1SUN Xuding1TIAN Rufang2

1.Shandong Arura Pharmaceutical Research&Development Co.,Ltd.,Jinan 250101,China;2.Shandong Health Pharmaceutical Co., Ltd., Jinan 250022,China

Abstract:Objective To develop a method for the content determination of croci stigma in zuozhudaxi.Methods HPLC method was adopted.The determination was performed on Waters C(18) column (250mm×4.6mm, 5μm) with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-0.05mol/L ammonium acetate (40∶5∶55) at the flow rate of 1ml/min. The detection wavelength was set at 440 nm, and column temperature was 30 ℃.Results The linear range of crocin Ⅰ were 6.208～62.08μg/ml(r=0.9997) with an average recovery of 98.31% (RSD=0.86%,n=6);RSDs of precision, stability and reproducibility tests weve all lower than 2%. The linear range of crocin Ⅱ were 3.072～30.72μg/ml(r=0.9999) with an average recovery of 97.69% (RSD=0.99%,n=6);RSDs of precision,stability and reproducibility tests weve all lower than 2%.Conclusion The method is simple,accurate,and can be used for the content determination of croci stigma in zuozhudaxi.

Key words:zuozhudaxi;crocin Ⅰ;crocin Ⅱ;HPLC

(收稿日期：2016.01.29)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.1

【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】A

【文章編號(hào)】1007-8517(2016)07-0015-02

作者簡(jiǎn)介：馬宏偉，工程師，執(zhí)業(yè)中藥師，主要從事藏醫(yī)藥健康品的研究與開(kāi)發(fā)。E-mail：sdaruratcm@163.com