劉力豪　蔡　琨　王曉敏

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州　貴陽　550002

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純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對人乳腺癌細胞MCF-7的生長影響

劉力豪蔡琨王曉敏

貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽550002

【摘要】目的：研究純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物在體外對人乳腺癌細胞MCF-7的生長影響。方法：用不同劑量組對體外培養(yǎng)的MCF-7細胞分別干預(yù)12、24、36、48、72h后，用MTT法觀察其對MCF-7細胞的生長影響。結(jié)果：①純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞12、24、36h，其濃度5、10、20、40mg/L(除24h 10mg/L外)均表現(xiàn)出對MCF-7細胞穩(wěn)定的抑制作用，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；②純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮對人乳腺癌MCF-7細胞抑制作用，在一定濃度、作用時間有依賴關(guān)系，與大豆異黃酮抑制作用相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論：純種發(fā)酵淡豆豉有明確的抗乳腺癌的作用，其24h IC(50)為(7.58±1.57)mg/L。

【關(guān)鍵詞】純種發(fā)酵；淡豆豉；異黃酮；MTT；MCF-7細胞；乳腺癌

淡豆豉是一味以大豆為原材料經(jīng)發(fā)酵而成的傳統(tǒng)中藥，始載于《名醫(yī)別錄》，有解表除煩、宣發(fā)郁熱之功效，適用于感冒、寒熱、頭痛、煩躁、胸悶及虛煩不眠等癥[1]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于成藥之中，如維C銀翹片、銀翹解毒片等。傳統(tǒng)制作淡豆豉的方法見于藥典，使用桑葉、青蒿的煎煮液浸泡大豆晾干后，再用桑葉、青蒿覆蓋初步發(fā)酵，再放入容器發(fā)酵近20d后得淡豆豉，其制法繁瑣、耗時，缺乏劑量標(biāo)準，量產(chǎn)需要制作經(jīng)驗，且發(fā)酵中易受其他微生物的干擾導(dǎo)致失敗、甚至產(chǎn)生毒素，這些都直接影響淡豆豉的品控、量產(chǎn)。本實驗前期分離得到高效淡豆豉發(fā)酵菌株，量化并優(yōu)化發(fā)酵工序，僅需7d即能高效、安全、穩(wěn)定獲得大量純種發(fā)酵淡豆豉[2-3]。乳腺癌作為女性三大惡性腫瘤之一，嚴重危害婦女健康。大量流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，亞洲人群經(jīng)常食用富含植物雌激素的食物，其乳腺癌發(fā)病率較歐美人群明顯降低，而大豆及其相關(guān)制品如豆豉、納豆等則是植物雌激素的主要膳食來源[4-5]，植物雌激素主要包含異黃酮類如大豆苷元、染料木素、木酚類等。有眾多文獻指出[6-8],大豆異黃酮對體外癌細胞有抗腫瘤作用。進一步研究顯示大豆異黃酮中游離形式生物活性相對非游離型要高，但僅占大豆總異黃酮的2%～3%。大豆發(fā)酵后的淡豆豉總異黃酮量與大豆相當(dāng)，但游離形式苷元是大豆中的10～40倍[9]。因此，淡豆豉可能具有更加理想的防治乳腺癌作用。

目前國內(nèi)外學(xué)者對中藥淡豆豉抗腫瘤功能的研究相對不多，對于純種發(fā)酵淡豆豉對人乳腺癌細胞(MCF-7)的研究更加少見，純種發(fā)酵淡豆豉對MCF-7細胞的生長影響如何則需進一步研究。本研究選用前期分離的高效淡豆豉發(fā)酵菌株，并采用前期得出的優(yōu)化發(fā)酵條件發(fā)酵得到純種發(fā)酵淡豆豉，通過一定的提取方法獲得單位質(zhì)量活性物質(zhì)較高的純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物，用高效液相色譜法測定提取物主要有效成分含量，以大豆異黃酮作為陽性藥物，使用MTT法檢測其對MCF-7癌細胞的生長影響，為進一步擴展純種發(fā)酵淡豆豉的臨床應(yīng)用提供理論和實踐依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞人乳腺癌MCF-7細胞株，購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2試劑DMEM-H培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(FBS)(浙江天杭生物科技股份有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)(Solarbio公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)(Solarbio公司)；0.02%EDTA/0.25%胰蛋白酶(M&C Gene Technology)；實驗所使用其他化學(xué)試劑均為分析純級，購于化學(xué)試劑公司。

1.1.3藥物陽性藥物大豆異黃酮購于江萊生物公司(精密級，80%)，批號：JL 150208005；純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物由本課題組制備及提取。

1.1.4儀器CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司USA3131型)；離心機(Thermo公司X1R型)；自動酶標(biāo)儀(Thermo公司1510型)；倒置顯微鏡(DSZ2000X型)；全自動高壓滅菌鍋(TOMY公司SX-700型)；高效液相色譜儀HPLC(Agilent公司1260型)；色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；水浴振蕩器；水浴鍋；分析天平；烘箱；96孔培養(yǎng)板及T25細胞培養(yǎng)瓶(Corning公司)；移液器(大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1純種發(fā)酵淡豆豉的制備購于市場的干大豆，經(jīng)篩選、室溫清水浸泡(12h)后，使干黃豆充分吸收水分膨脹，晾干，按一定質(zhì)量分裝到大三角燒瓶內(nèi)，經(jīng)15min，115℃處理后冷卻，在超凈臺內(nèi)無菌操作，接種高效淡豆豉發(fā)酵菌液(按大豆30g∶菌液10ml比例)充分混勻后，于25℃溫箱培養(yǎng)發(fā)酵7d，獲得純種發(fā)酵淡豆豉。

1.2.2純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物的制備將純種發(fā)酵淡豆豉于60℃干燥回收，粉碎，過40目篩，稱取粉末200g，用石油醚脫脂，減壓干燥得到粉末，取100g加入pH=5緩沖液1000ml(由0.2mol/L檸檬酸鈉與0.1mol/L檸檬酸配制成)，加入10mg β-葡萄糖苷酶、1000ml乙酸乙酯，45℃、超聲60min，減壓干燥得異黃酮粗品，按粗品、大孔樹脂1∶40比例上AB-8大孔樹脂柱乙醇反復(fù)洗脫，濃縮、干燥得純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物。

1.2.3純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物主要成分含量測定參照文獻[10]，使用高效液相色譜(HPLC)法測定提取物異黃酮含量，色譜柱：ZORBAX SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，大豆苷元測定條件：流動相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶55∶1；檢測波長:250nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進樣量：10μl。染料木素測定條件：流動相∶甲醇∶水∶乙酸=45∶65∶1；檢測波長:262nm；柱溫：30℃；流速1ml/min；進樣量：10μl。精密稱取標(biāo)準品大豆苷元(daidzein,5.25mg)、染料木素(genistein,5.55mg)，加80%甲醇溶解，定容至50ml，得0.105 mg/ml 大豆苷元對照品溶液、0.111 mg/ml染料木素標(biāo)準品溶液。

分別精密稱取精密稱取純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物0.5g，用10ml含有2mol/L鹽酸的80%乙醇溶解大豆苷元樣品，用10ml 80%乙醇溶解染料木素樣品，均超聲15min，4000r/min 離心5min，重復(fù)兩次，分別合并提取液，水浴蒸干，用80%的乙醇定容至10ml并經(jīng)0.45μm膜過濾備用。

1.2.4藥物組的配置精密稱取1mg純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物，充分溶解于5ml無水乙醇中，加入20ml DMEM-H(不加FBS)培養(yǎng)液稀釋上述液體，得20%乙醇混合液,經(jīng)0.22μm膜過濾，用DMEM-H(不加FBS)培養(yǎng)液稀釋得到濃度為40、20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125mg/L共8個濃度異黃酮提取物溶液，同樣方法精密稱取1mg大豆異黃酮制備以上8個濃度，全部密封、4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5MCF-7細胞的體外培養(yǎng)將貼壁生長的MCF-7細胞經(jīng)0.02%EDTA/0.25%胰酶(2∶1)混合液消化脫壁后按一定量接種至DMEM-H培養(yǎng)液(含10%FBS)中吹散均勻，移入新細胞培養(yǎng)瓶，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3～4d傳代1次，每日于倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀況，及時剔除污染、死亡的細胞，本次實驗選用第四代細胞。

1.2.6MTT實驗實驗設(shè)對照組、空白組、不同濃度陽性對照組、不同濃度藥物組。取對數(shù)生長期的MCF-7細胞，倒出培養(yǎng)液，用適量PBS(磷酸鹽緩沖液)沖洗培養(yǎng)瓶底壁后吸出丟棄，加入0.02%EDTA/0.25%胰酶1ml，混勻，于37℃消化2～3min，倒置顯微鏡下觀察約80%細胞變圓時加入DMEM-H(含10%FBS)培養(yǎng)液3ml，輕輕反復(fù)吹打沖洗培養(yǎng)瓶底壁，經(jīng)收集離心后用DMEM-H(含10%FBS)培養(yǎng)液調(diào)整單細胞懸液濃度為4×104個/ml。以每孔100μl接種96孔板，培養(yǎng)12h使細胞貼壁生長鋪滿底部，然后給以不同濃度藥物組各100μl，對照組加入100μl 20%乙醇(DMEM-H培養(yǎng)液稀釋，不含F(xiàn)BS)，空白組則加入100μL DMEM-H培養(yǎng)液(含10%FBS)，每組設(shè)3個平行孔，于37℃、5%CO2孵化箱培養(yǎng)。分別培養(yǎng)12、24、36、48、72h后，取出，每孔加入5mg/ml MTT(由PBS配成5mg/ml濃度) 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸出培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，于低速搖床10min，靜置20min，于酶標(biāo)儀測490nm各孔吸光度OD值。

生長抑制率(IR)=(1-藥物組OD值/對照組OD值)×100%

公式中藥物組為給予不同濃度的藥物實驗組，對照組為不加藥物處理的對照組。

2結(jié)果

2.1純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物含量測定結(jié)果通過HPLC法檢測得到兩種異黃酮標(biāo)準品與樣品HPLC分離色譜圖(圖1～4)，根據(jù)兩種標(biāo)準品的線性范圍配制樣品溶液濃度，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，每樣品3針。用外標(biāo)法計算并換算純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的平均含量為(26.06±0.82)mg/g、(54.65±0.74)mg/g，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物的異黃酮含量約為(8.07±0.09)%。

2.2純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對MCF-7細胞的生長影響純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞12、24、36h后，其濃度5、10、20、40mg/L(除24h 10mg/L外)均表現(xiàn)出對MCF-7細胞穩(wěn)定的抑制作用，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨藥物濃度升高，作用時間的延長，其抑制作用逐漸增強。在作用MCF-7細胞48h后，藥物組對MCF-7細胞抑制作用出現(xiàn)反復(fù)，作用MCF-7細胞72h后抑制率反而整體上升。(圖5～6)(表1～2)。

表1　純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對MCF-7細胞作用12h、24h、36h的生長影響

±s)

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

表2　純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物對MCF-7細胞作用48h、72h的生長影響　±s)

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3兩種藥物對MCF-7細胞生長影響的比較根據(jù)2.2分析結(jié)果，采用純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物4個濃度(5、10、20、40mg/L)與同濃度陽性藥物大豆異黃酮在不同時段(12、24、36h)對MCF-7細胞抑制率的研究，采用重復(fù)測量設(shè)計資料的方差分析。實驗數(shù)據(jù)滿足Mauchly球形假設(shè)(P>0.05)，直接采用重復(fù)測量方差分析。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物組與大豆異黃酮組相比較，兩者對MCF-7細胞的抑制作用組間之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F= 1.167，P=0.373)。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物組與對照組相比，兩者對MCF-7細胞的抑制作用組間之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.327，P=0.004)。即在上述濃度范圍，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物有與大豆異黃酮類似的作用，對MCF-7細胞增殖有抑制作用(圖7)。

3討論

乳腺癌的病因目前尚未定論，病因?qū)W研究顯示可能與遺傳、免疫、環(huán)境、飲食等因素有關(guān)，比較公認且經(jīng)多年研究證實的，即為乳腺癌為一種雌激素依賴性腫瘤，內(nèi)源性雌激素水平持續(xù)升高或外源性雌激素大量補充，導(dǎo)致雌激素長期暴露都會增加乳腺癌發(fā)生的概率[11]。植物雌激素類物質(zhì)是一類源于植物、活性與雌激素相似的雜環(huán)多酚類天然化合物，能與人體內(nèi)的雌激素受體(ER)結(jié)合從而引發(fā)雌激素效應(yīng)，但其結(jié)合率、效能遠遠低于雌激素，但又占據(jù)雌激素受體，從而消減了雌激素長期暴露作用，起到預(yù)防、治療乳腺癌的作用。

實驗結(jié)果表明，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物中大豆苷元、染料木素的含量達(26.06±0.82)mg/g、(54.65±0.74)mg/g，總異黃酮含量約為(8.07±0.09)% 。與其他類似文獻[12-13]所公布的自然發(fā)酵淡豆豉提取物異黃酮含量相比，純種發(fā)酵淡豆豉提取物所獲得的異黃酮含量遠遠高于其他，說明純種發(fā)酵法與其他類方法相比，更加優(yōu)越，值得推廣。

在作用MCF-7細胞12、24、36h內(nèi)，純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物在5、10、20、40mg/L濃度對MCF-7細胞表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.05)，且其抑制作用與藥物濃度、作用時間呈正相關(guān)。淡豆豉異黃酮提取物作用MCF-7細胞24h的IC50為(7.58±1.57)mg/L(表1)。與大豆異黃酮組對MCF-7細胞的抑制作用無明顯差異(P>0.05))，表明有效含量約8%的純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮提取物與有效含量約80%的大豆異黃酮具有相似的抑制作用，側(cè)面證明純種發(fā)酵淡豆豉所含異黃酮類活性成分較大豆異黃酮高。純種發(fā)酵淡豆豉異黃酮類物質(zhì)與MCF-7細胞接觸后，抑制效果立刻產(chǎn)生，則可能與持續(xù)占據(jù)ER導(dǎo)致MCF-7細胞增殖能力下降有關(guān)。上述結(jié)果說明純種發(fā)酵淡豆豉具有明顯的抗乳腺癌的作用。

實驗中藥物干預(yù)MCF-7細胞48h、72h后出現(xiàn)各藥物組抑制率不再呈類線性關(guān)系，而在72h后各組抑制率反而明顯抬升，并不能說明此時藥物對抑制率產(chǎn)生主導(dǎo)作用。MTT法檢細胞抑制率其本質(zhì)包括了增殖受限細胞和死亡細胞，在96孔板中培養(yǎng)48h、72h的細胞，其生長環(huán)境不再適宜、營養(yǎng)成分殆盡、代謝物積累、壞死細胞內(nèi)容物的釋放等都使細胞增殖受限，同時可誘發(fā)細胞凋亡，因此數(shù)據(jù)分析時，不采用48h、72h的數(shù)據(jù)。

綜上所述，純種發(fā)酵淡豆豉具有明確的抗乳腺癌的作用。其對人乳腺癌MCF-7細胞抑制作用與純種發(fā)酵淡豆豉濃度、作用時間呈正相關(guān)， 24h的IC50為(7.58±1.57)mg/L。純種發(fā)酵淡豆豉發(fā)揮抗乳腺癌作用的機制還需進一步的深入研究。

參考文獻

[1]中國藥典委員會.中國藥典(一部)[S]北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：308.

[2]蔡琨，田維毅，韓潔，等.中藥淡豆豉高效發(fā)酵菌株的篩選[J].內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2010,29(24)：51, 57.

[3] 蔡琨，馮華，田維毅.純種發(fā)酵對淡豆豉主要有效成分的影響[J].甘肅中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2006，23(5):39-41.

[4] 朱俊東.大豆異黃酮抗癌作用的研究進展[J].國外醫(yī)學(xué)衛(wèi)生學(xué)分冊，1998，25(5):257-259.

[5] Setchell KDR，Nechemias-Zimmer LZ,Cai J,et al.Exposure of infants to phytoestrogenns from soy infant formulas [J]. The Lancet 1997, 350:23-27.

[6] Setchell KDR, Cassidy A. Dietary isoflavones: biological effects and relevance to human health [J].Nutr, 1999, 129(3):758-767.

[7] Su S J, YehTM, Lei HY, et al. The potential of soybean foods as a chemoprevention approach of human urinary tract cancer [J].Clin Cancer Res, 2000, 6(1):230-236.

[8] 徐春華. MTT法檢測大豆異黃酮對癌細胞的生長抑制作用[J].中央民族大學(xué)學(xué)報，2012,21(1)：58-61.

[9] 霍紅，田明，王秀海，等.大豆與其生物發(fā)酵制品淡豆豉異黃酮含量研究[J].中醫(yī)藥學(xué)報，2011,39(3)：74-76.

[10] 馮果，施曉偉，蔡琨，等.黔產(chǎn)純種發(fā)酵淡豆豉中大豆黃素及染料木素的含量測定[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011,23:118.

[11] KeyT, Appleby P, Barnes I, et al. Endogenous Hormones and Breast Cancer Collaborative Group. Endogenous sex hormones and breast cancer in postmenopausal women: reanalysis of nine prospective studies [J]. J Natl Cancer Inst, 2002, 94(8):606-616.

[12] 張靜，田平芳，葛喜珍，等.淡豆豉、黃大豆及黑大豆中異黃酮苷元的提取與含量比較[J]. 食品科學(xué)，2008,29(04)：214-217.

[13] 譚穎穎，張琪.淡豆豉與黑豆提取物抗癌細胞增殖作用及4種異黃酮成分的含量測定[J]. 中華中醫(yī)藥雜志(原中國醫(yī)藥學(xué)報)，2012,27(6)：1547-1549.

The inhibiting capacity of isoflavones extracts from pure fermented Semen Sojae Praeparatum to MCF-7 cells' reproductive activity

LIU LihaoCAI KunWANG Xiaomin

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China

Abstract:Objective To observe the inhibiting effect on isoflavones extracts from pure fermented Semen Sojae Praeparatum (SSP) to MCF-7 cells′ reproductive activity in vitro.Methods MCF-7 cells were cultured in vitro and interfered by different concentrations of isoflavones extracts from pure fermented SSP for 12,24,36,72 hours respectively. The inhibition of pure fermented SSP to MCF-7 cells were detected by MTT Method.Results (1)The isoflavones extracts from pure fermented SSP show the inhibition to MCF-7 cells compared with the negative control group，by different concentrations of 5mg/L，10mg/L，20mg/L，40mg/L for 12h,24h and 36 h (P<0.05),except 24h 10mg/L. (2) Pure fermented SSP could markedly inhibit proliferation of MCF-7 cell line in a time-dependent and dose-dependent manner. The effects of Pure fermented SSP were no difference compared with those of soy isoflavones(P>0.05).Conclusion The results proved the inhibition of isoflavones extracts from pure fermented SSP show the best inhibiting effect on the proliferation of MCF-7 cells, 24h IC(50)(7.58±1.57)mg/L.

Key words:pure fermented, Semen SojaePraeparatum, isoflavones, MTT, breast cancer

(收稿日期：2016.02.02)

【中圖分類號】R285.5

【文獻標(biāo)志碼】A

【文章編號】1007-8517(2016)07-0023-05