石興源 艾亮梅 黃文瑾 聶 豪 余宏偉 蔡隆梅 周同沖 傅文凡

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療四科，廣東 廣州 510095)

·論著·

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞異質(zhì)性研究

石興源*艾亮梅 黃文瑾 聶 豪 余宏偉 蔡隆梅 周同沖 傅文凡

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院放療四科，廣東 廣州 510095)

目的:分析肺癌A549細(xì)胞的異質(zhì)性特征。方法：有限稀釋法分離A549細(xì)胞的單個(gè)克隆細(xì)胞并擴(kuò)大培養(yǎng)，對(duì)親代與子代細(xì)胞進(jìn)行生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等特征的分析，了解A549細(xì)胞內(nèi)部存在的異質(zhì)性特征。結(jié)果：共獲得6個(gè)A549細(xì)胞子細(xì)胞株，與親代細(xì)胞比較，各子代細(xì)胞在細(xì)胞增殖能力和轉(zhuǎn)移特征方面存在明顯差異(P<0.05)。結(jié)論：A549細(xì)胞存在細(xì)胞增殖能力和轉(zhuǎn)移特征的異質(zhì)性，可能與腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移相關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌；腫瘤異質(zhì)性

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占肺癌的85%左右，是一種威脅人類健康的惡性腫瘤之一。手術(shù)、放療、化療和靶向治療是目前NSCLC治療的主要手段，其中后兩種治療方式是NSCLC全身治療的兩種主要方式[1]。對(duì)于化療來說，含鉑兩藥方案為臨床主要使用的化療方案。而對(duì)于靶向治療來說，針對(duì)表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)標(biāo)靶的小分子酪氨酸激酶活性抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor, EGFR-TKI)靶向治療是目前臨床應(yīng)用最多的。然而，對(duì)于這兩種主要的NSCLC全身治療方法，耐藥是一個(gè)難以回避的問題[2-3]。目前的研究顯示，NSCLC的化療與靶向治療耐藥機(jī)制主要包括：多種蛋白、酶和基因綜合作用的結(jié)果,靶分子出現(xiàn)繼發(fā)改變,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)旁路激活,微環(huán)境變化等。除此之外，也有研究顯示腫瘤細(xì)胞的克隆異質(zhì)性也與NSCLC的化療與靶向治療耐藥相關(guān)。

腫瘤的異質(zhì)性是指腫瘤在發(fā)生與發(fā)展過程中，其不同腫瘤子細(xì)胞呈現(xiàn)出分子生物學(xué)或基因方面的改變，從而使腫瘤呈現(xiàn)不同的生長(zhǎng)、侵襲、藥物敏感性、預(yù)后等特性。腫瘤的異質(zhì)性包括空間異質(zhì)性和時(shí)間異質(zhì)性。所謂空間異質(zhì)性主要指在相同時(shí)間點(diǎn)的同一腫瘤內(nèi)或不同腫瘤病灶間的腫瘤子細(xì)胞的差異性，而時(shí)間異質(zhì)性則是指當(dāng)腫瘤在接受藥物治療等情況下出現(xiàn)腫瘤微環(huán)境變化而導(dǎo)致的在不同時(shí)間點(diǎn)的腫瘤子細(xì)胞的差異性。而這不同的腫瘤異質(zhì)性特征導(dǎo)致了同種腫瘤可呈現(xiàn)顯著差異的臨床表型。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果為存在敏感突變的NSCLC患者中，接受TKI治療時(shí)的藥物反應(yīng)性卻存在較大的差異。同時(shí)，當(dāng)TKI治療了一段時(shí)間患者開始出現(xiàn)耐藥表現(xiàn)時(shí)，其具體的表現(xiàn)形式也存在明顯差異，可分為爆發(fā)進(jìn)展、緩慢進(jìn)展和局部進(jìn)展三種模式[4]，而針對(duì)這不同的耐藥模式，臨床也采取了相應(yīng)的不同治療方案來給予患者個(gè)體化治療。因此，發(fā)現(xiàn)更多的NSCLC患者可能存在的腫瘤異質(zhì)性特征對(duì)于腫瘤的療效與預(yù)后預(yù)測(cè)和指導(dǎo)個(gè)體化治療具有重要意義。

本研究擬以人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，結(jié)合有限稀釋法建立多個(gè)單克隆化的子細(xì)胞株，并對(duì)其進(jìn)行表型和基因型分析，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

美國(guó)Life公司：1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶；美國(guó)Promega公司：MTS；美國(guó)SHELLAB公司：CO2培養(yǎng)箱；德國(guó)徠卡公司：DMI4000B倒置顯微鏡；美國(guó)BioTek公司：Synergy2多功能酶標(biāo)儀。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

A549在中科院上海細(xì)胞所購(gòu)買。細(xì)胞置于1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)中在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 有限稀釋法

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞用胰酶處理后獲得細(xì)胞懸液，利用1640培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至每200 μL生含1個(gè)細(xì)胞的濃度，將稀釋后細(xì)胞按每孔200 μL的量分裝至整塊96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。挑選含單個(gè)細(xì)胞克隆的孔待細(xì)胞長(zhǎng)滿后轉(zhuǎn)6孔板做擴(kuò)大培養(yǎng)以建立子細(xì)胞株。

1.4 大體觀察

顯微鏡下觀察各細(xì)胞克隆形態(tài)特征。

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將待檢細(xì)胞稀釋，其后按400個(gè)細(xì)胞/孔接種6孔培養(yǎng)板，每個(gè)細(xì)胞設(shè)3復(fù)孔，培養(yǎng)8天后棄上清，預(yù)冷甲醇固定30分鐘，結(jié)晶紫染色后清水沖洗、晾干。計(jì)數(shù)克隆數(shù)以及克隆形成率(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%)。

1.6 細(xì)胞增殖曲線

稀釋待檢細(xì)胞，按1000個(gè)細(xì)胞/200 μL/孔濃度接種96孔板，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置5個(gè)檢測(cè)復(fù)孔，在接種細(xì)胞貼壁后分別在0、24、48、72、96、120 h加MTS37 ℃放置3 h后測(cè)吸光度值(A)，利用各時(shí)間點(diǎn)測(cè)量值均值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

稀釋待檢細(xì)胞，取3×105細(xì)胞接種6孔板，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)孔底后更換無血清培養(yǎng)基，其后用小吸頭垂直劃線，0、24、48定位觀察細(xì)胞遷移情況。

1.8 基因突變檢測(cè)

依據(jù)EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(直接測(cè)序法)說明書步驟檢測(cè)各子細(xì)胞克隆的EGFR基因突變情況，觀察是否存在EGFR基因異質(zhì)性情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理相關(guān)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析比較組間差異。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察結(jié)果

通過有限稀釋法自A549細(xì)胞中得到20個(gè)單細(xì)胞培養(yǎng)孔，其中僅6個(gè)孔的單細(xì)胞最終成長(zhǎng)形成克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)獲得子代細(xì)胞(分別標(biāo)記為1-6號(hào)克隆)，占比30%。在單細(xì)胞首次形成克隆時(shí)，不同克隆具有兩種不同的克隆形態(tài)，第一種克隆形態(tài)為緊密型克隆，克隆內(nèi)細(xì)胞結(jié)合緊密，克隆邊界清晰。第二種克隆形態(tài)為散在型克隆，細(xì)胞間結(jié)合松散。見圖1。在所獲得的6個(gè)子克隆中：2、3、5、6號(hào)克隆為緊密型克隆，占66.7%；1、4號(hào)克隆為散在型克隆，占33.3%。

BA

A.緊密型克隆;B.散在型克隆

圖1 A549單細(xì)胞形成的子克隆形態(tài)

2.2 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

A549的克隆形成率為(52.6±3.4)%；1-6號(hào)子細(xì)胞的克隆形成率分別為：(25.3±4.8)%、(70.2±5.4)%、(50.2±4.4)%、(12.2±5.6)%、(44.4±3.4)%、(66.5±3.9),存在明顯差異(P<0.05)。

2.3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

通過生長(zhǎng)曲線可見A549細(xì)胞與2、3、6號(hào)克隆顯示出較強(qiáng)的增殖活性，其中2號(hào)克隆最強(qiáng)，而1、4號(hào)克隆的增殖活性較弱。見圖2。

76543210244872960120t/min增殖倍數(shù)NCI-A5491號(hào)克隆2號(hào)克隆3號(hào)克隆4號(hào)克隆5號(hào)克隆6號(hào)克隆

圖2 細(xì)胞增殖曲線

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2號(hào)克隆48小時(shí)劃痕兩側(cè)細(xì)胞相接，A549與其他克隆48 h劃痕兩側(cè)細(xì)胞仍未相接，故存在差異。

2.5 EGFR基因突變檢測(cè)結(jié)果

利用直接測(cè)序法對(duì)A549與1-6號(hào)克隆細(xì)胞的EGFR基因(18-21外顯子)突變狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，所有細(xì)胞的18-21外顯子均為野生型，未見差異。

3 討 論

關(guān)于腫瘤異質(zhì)性的來源有兩種不同假說，其一為克隆演化假說，其二為腫瘤干細(xì)胞假說[5]?？寺⊙莼僬f認(rèn)為雖然大多數(shù)腫瘤在發(fā)生時(shí)多為單克隆起源，但在發(fā)展過程中，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)存在著的克隆演化過程導(dǎo)致了腫瘤產(chǎn)生了異質(zhì)性，也即逐步體現(xiàn)為多克隆性，其中占主導(dǎo)的克隆形成腫瘤的干系，而一些次要克隆則構(gòu)成旁系。干系和旁系的基因型和表型可能存在差異，甚至在染色體層面也存在差別，這就為腫瘤臨床表現(xiàn)和治療反應(yīng)性的差異打下了基礎(chǔ)，并且存在高度的復(fù)雜性。而腫瘤干細(xì)胞假說則認(rèn)為在腫瘤中存在一小群干細(xì)胞樣細(xì)胞，這群細(xì)胞具有無限增殖和多向分化的潛能，因此在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，為適應(yīng)腫瘤微環(huán)境的改變，由干細(xì)胞分化產(chǎn)生了多種不同的差異細(xì)胞，而這些差異細(xì)胞就是腫瘤異質(zhì)性的來源。在該研究中，通過有限稀釋法獲得的單個(gè)A549細(xì)胞并非均能重新生長(zhǎng)形成克隆，其中70%的細(xì)胞死亡，只有6個(gè)細(xì)胞最終生長(zhǎng)為克隆，該結(jié)果提示在A549細(xì)胞中存在部分具有自我更新能力的細(xì)胞。另在已分離且擴(kuò)大培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞中存在兩種形態(tài)差異明顯的細(xì)胞克隆，其中以緊密型克隆為主。多項(xiàng)研究表明[6,7]，在不同的細(xì)胞株中分離的單克隆細(xì)胞可有三種類型，包括Holoclones、Paraclones和Meroclones，其中Meroclones是Holoclones和Paraclones的混合體，同時(shí)不同的克隆其克隆形態(tài)特征存在明顯差異，Holoclones因其具有生長(zhǎng)快且具自我更新能力的特征被認(rèn)為是具有干細(xì)胞特性的一類克隆。在該研究中，緊密型克隆其生長(zhǎng)能力普遍強(qiáng)于散在型克隆，故應(yīng)屬于文獻(xiàn)中的Holoclones類型，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相符。但緊密型克隆的比例可達(dá)到66.7%，較文獻(xiàn)報(bào)道偏高，分析其原因?yàn)轱@微鏡下人為依據(jù)大體形態(tài)區(qū)分克隆類型其準(zhǔn)確率較低，但此類劃分可為后續(xù)研究提供有用的線索。

對(duì)于肺癌來說，EGFR基因突變是一種重要的驅(qū)動(dòng)基因改變，其與TKI類靶向藥物的療效取得密切相關(guān)。該研究以EGFR基因突變?yōu)閷?duì)象，分析了A549細(xì)胞及其各子克隆細(xì)胞的EGFR基因突變狀態(tài)，均未發(fā)現(xiàn)存在EGFR基因突變的情況。提示A549細(xì)胞是一種TKI耐藥的肺癌細(xì)胞，在此類耐藥細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)存在EGFR基因突變的提示對(duì)TKI敏感的微克隆。

相關(guān)研究顯示[8]，腫瘤細(xì)胞的遺傳不穩(wěn)定性和腫瘤微環(huán)境是影響腫瘤異質(zhì)性的兩種主要因素，同時(shí)各種不同的腫瘤細(xì)胞克隆間又呈現(xiàn)一種競(jìng)爭(zhēng)與協(xié)同的相對(duì)穩(wěn)態(tài)。當(dāng)腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)變化時(shí)(如使用藥物治療)，則具有不同相對(duì)穩(wěn)態(tài)的腫瘤細(xì)胞群體對(duì)于微環(huán)境的改變其反應(yīng)性也存在差異，同時(shí)當(dāng)微環(huán)境改變一段時(shí)間以后，不同于之前的新的腫瘤克隆穩(wěn)態(tài)又可能重新形成[9]。因此腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性差異還可能與腫瘤的藥物治療反應(yīng)性及耐藥機(jī)制相關(guān)。在該研究中，雖未直接進(jìn)行A549細(xì)胞及其各子克隆細(xì)胞的耐藥性分析，但各子克隆細(xì)胞間生長(zhǎng)能力的明顯差異也提示可能存在其對(duì)不同藥物反應(yīng)性的差異。

綜上所述，A549細(xì)胞在細(xì)胞克隆形態(tài)以及生長(zhǎng)特性等表型方面存在異質(zhì)性。

[1] 白玉梅, 盧保華. 非小細(xì)胞肺癌治療進(jìn)展[J]. 山西醫(yī)藥雜志月刊, 2013, 42(7):767-768.

[2] 張 鈺, 周建國(guó), 馬 虎. 非小細(xì)胞肺癌分子靶向治療及其耐藥[J]. 國(guó)際腫瘤學(xué)雜志, 2016, 43(1):45-48.

[3] 付 剛, 潘明佳, 龔 珉, 等. 非小細(xì)胞肺癌化療耐藥相關(guān)的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2011, 26(6):421-425.

[4] 龔承嵐, 張國(guó)偉, 王慧娟, 等. 從EGFR基因突變看肺癌異質(zhì)性[J]. 河南醫(yī)學(xué)研究, 2014, 23(5):155-159.

[5] 楊壹羚, 褚嘉祐, 王明榮. 腫瘤遺傳異質(zhì)性[J]. 遺傳, 2013, 35(1):1-9.

[6] 黃盛東, 劉曉紅, 白辰光, 等. A549肺癌細(xì)胞株中腫瘤干細(xì)胞與克隆形成的關(guān)系 [J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2006, 23(9):1053-1055.

[7] 周 靜, 趙 剛, 劉 濤, 等. 實(shí)體腫瘤干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志, 2006, 23(1):122-123.

[8] 吳克復(fù). 腫瘤微環(huán)境與細(xì)胞生態(tài)學(xué)導(dǎo)論[M]. 北京:科學(xué)出版社, 2009:212-214.

[9] 付秀華，宿利清.肺癌體外藥敏試驗(yàn)與臨床療效的關(guān)系[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志,2011,17(4):318-320.

(本文編輯：鄭 穎)

Heterogeneity of human non-small cell lung cancer cell line A549

ShiXingyuan*,AiLiangmei,HuangWenjin,NieHao,YuHongwei,CaiLongmei,ZhouTongchong，F(xiàn)uWenfan

(FourthDepartmentofRadiationOncology,TumorHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510095,China)

*Correspondingauthor:Email：18549183@qq.com

Objective:To analyze the heterogeneity of lung cancer cell line A549. Methods: Limiting dilution was used to isolate the single clones of A549 cells and expanded for culture. Then, the growth and metastasis of the parental and offspring cells were analyzed to determine the heterogeneity of A549 cells. Results:Six sub-cell lines were isolated. There were significant differences in the proliferation and metastasis between the parental and offspring cells. Conclusion:A549 cells show heterogeneity of cell proliferation and metastasis, and the heterogeneity may be related to tumor metastasis.

non-small cell lung cancer; tumor heterogeneity

10.3969/j.issn.2095-9664.2016.06.001

廣州市醫(yī)藥科技項(xiàng)目(20142A011023)

R734.2

A

2095-9664(2016)06-0001-03

2016-10-27)

*通訊作者：Email：18549183@qq.com