胡月芳，黃志強，李金芳

(賀州學院　化學與生物工程學院，廣西　賀州　542899)

毛細管電泳-電化學檢測法測定淮山中8種必需氨基酸含量

胡月芳*，黃志強，李金芳

(賀州學院化學與生物工程學院，廣西賀州542899)

摘要：將8種人體內(nèi)必需氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸)與鄰苯二甲醛(OPA)發(fā)生衍生化反應，再采用毛細管電泳-電化學檢測(CE-ED)方法對其含量進行測定?？疾炝搜苌瘯r間、檢測電位、運行緩沖液濃度和pH值、分離電壓及進樣時間等的影響。在優(yōu)化條件下，8種氨基酸在12 min內(nèi)實現(xiàn)了分離，線性范圍為0.1～1 500 μg/L；檢出限為0.01～0.05 μg/L，峰高的相對標準偏差(RSD)為1.3%～1.8%，遷移時間的RSD為0.6%～1.0%。該方法已用于淮山樣品中8種必需氨基酸的測定，加標回收率為96.8%～102.0%，RSD均不大于2.4%。

關(guān)鍵詞：毛細管電泳；電化學檢測；淮山；氨基酸

淮山別名山藥、懷山藥等，含有氨基酸(包括人體必需的8種氨基酸)、活性多糖、薯蕷皂苷、尿囊素、膽堿、黃酮、淀粉等成分，是一種常用藥材和較佳的保健食品[1]。氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，是化學、生物、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、食品等領(lǐng)域的重要物質(zhì)[2-3]。隨著人們對淮山營養(yǎng)成分認識的加深，測定淮山中氨基酸的含量，尤其是8種人體必需的氨基酸含量成為評定淮山營養(yǎng)價值的基本指標之一。

近年來，一般采用傳統(tǒng)的液相色譜法或氨基酸分析儀分離氨基酸[4-6]，但色譜法在樣品分離前需對色譜柱進行預處理或改性，色譜柱價格昂貴，分離效率不高，檢測速度慢，操作較繁瑣；氨基酸分析儀分析成本較高。毛細管電泳方法(CE)具有消耗樣品少、分離效率高，無需昂貴的色譜柱與復雜的前處理等優(yōu)點[7-10]；電化學檢測(ED) 對于電活性物質(zhì)具有較高的靈敏度和選擇性，采用毛細管電泳-電化學檢測(CE-ED)測定氨基酸含量的研究已有報道[11-12]，但對淮山中8種人體必需的氨基酸(蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸)含量同時測定的研究尚未見報道。因大部分氨基酸無電化學活性、熒光發(fā)射及紫外吸收，通常使用衍生化方法使氨基酸在硫醇類化合物存在下與鄰苯二甲醛(OPA) 發(fā)生反應，生成具有電化學活性的強熒光衍生物之后，采用電化學、紫外、熒光、色譜法檢測[13-14]。本文先使所測氨基酸與OPA發(fā)生衍生反應，再采用CE-ED法測定賀州市平桂區(qū)沙田鎮(zhèn)淮山中8種人體必需的氨基酸含量，為進一步研究賀州市平桂區(qū)所產(chǎn)淮山的品質(zhì)，促進淮山資源的開發(fā)與利用提供了依據(jù)。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

毛細管電泳-電化學檢測系統(tǒng)(CE-ED，如圖1)為自組裝[11]，包括可調(diào)高壓電源(±30 kV)，CHI660D電化學工作站(北京華科普天科技有限公司)；石英毛細管長55 cm，內(nèi)徑25 μm(河北永年光導纖維廠)；三維定位調(diào)節(jié)器；三電極體系包括：工作電極(直徑125 μm銅圓盤電極)，對電極(鉑絲電極)，參比電極(Ag/AgCl電極)；0.22 μm的乙酸纖維素濾膜(上海新亞凈化器件廠)。

圖1　自組裝 CE-ED 裝置示意圖

蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸、鄰苯二甲醛(OPA)、 硫醇試劑(Sigma公司)；淮山樣品購于賀州市陽光市場(產(chǎn)于賀州市平桂區(qū)沙田鎮(zhèn))，其他試劑均為分析純。

1.2標準溶液、樣品溶液與衍生試劑的配制

標準溶液：蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸標準儲備液的質(zhì)量濃度均為1.00 g/L，用二次蒸餾水配制，再用運行緩沖液稀釋至所需濃度。

樣品溶液：取新鮮淮山于60 ℃烘干4 h，用研缽研成細粉，準確稱取5.0 g粉末，加入70%乙醇100 mL，在室溫下浸泡24 h。離心過濾，濾渣用70%乙醇10 mL洗滌 2 次，最后用0.10 mol/L的硼砂-H3BO3緩沖溶液定容至250 mL。

衍生化試劑：取50 mg OPA、1 mL(1 mol/L) 硫醇試劑、1 mL甲醇、1.8 mL(0.2 mol/L) Na2CO3和 NaHCO3混合溶液，超聲溶解，配制后立即進行反應。

1.3衍生化反應原理

氨基酸與OPA衍生化反應原理[15]：OPA與硫醇試劑聯(lián)用，堿性條件下(25 ℃)快速與一級氨基酸反應，生成強熒光且具有電化學活性的衍生物1-硫代-2-烷基-異吲哚，可采用電化學、紫外、熒光等法檢測。

1.4實驗方法

衍生化反應：在25 ℃溫度下，取10 μL標準濃度氨基酸溶液，加入20 μL OPA 衍生化試劑，混勻30 s，靜置50 s后進樣。為了保證衍生反應的迅速和完全進行，OPA衍生劑采用過量加入，其加入量約為理論氨基酸含量的2倍。

毛細管用0.1 mol/L的NaOH、二次蒸餾水、緩沖液分別沖洗10,5,15 min后使用；銅圓盤電極用細砂紙打磨，用粒徑0.3 μm的氧化鋁粉末拋光平整，并于0～0.95 V(vs.Ag/AgCl)之間在NaOH溶液中掃描，進行電化學處理。采用自組裝的CE-ED檢測系統(tǒng)，調(diào)節(jié)工作電極與毛細管出口在同一直線上，最大程度靠近毛細管的末端，以0.10 mol/L的硼砂-H3BO3溶液為運行緩沖液，電動進樣，檢測池為陰極電泳槽。所有溶液使用前均用0.22 μm乙酸纖維素濾膜過濾。

2結(jié)果與討論

2.1衍生化反應時間的選擇

由于氨基酸與OPA反應生成衍生物的穩(wěn)定性不高，信號減弱快，故衍生化反應時間必須嚴格控制。實驗考察了衍生化時間在20～100 s之間時對8種氨基酸峰電流的影響。結(jié)果表明，衍生化時間過短，生成的衍生物的峰電流很低，信號很弱，檢測困難，檢出限不理想；而衍生化時間過長時，OPA試劑由透明變?yōu)槲ⅫS色，失去衍生功效，信號緩慢衰弱，也不能提高衍生物的穩(wěn)定性。實驗發(fā)現(xiàn)當衍生化時間為80 s時，衍生物的峰電流較穩(wěn)定，電流值與檢測靈敏度較高，故選擇80 s為最佳衍生化時間。

2.2檢測電位的選擇

考察了不同檢測電位對衍生化反應80 s后8種氨基酸峰高的影響。結(jié)果顯示，在0.55～ 1.0 V 之間隨著檢測電位的增加，8種物質(zhì)的峰高不斷增高，且在0.85 V前增高較快，檢出限減低明顯；0.85 V之后峰高緩慢增高，檢出限變化不大。實驗也表明，隨著檢測電位的增大，本底電流和噪音均增加，當檢測電位高于0.85 V 時，基線很不穩(wěn)定，噪音較大，檢測靈敏度下降。綜合考慮靈敏度及穩(wěn)定性等因素，選擇0.85 V為最佳檢測電位。

圖2　緩沖溶液濃度對8個標準物遷移時間的影響Fig.2　Effect of buffer concentration on migration time of 0.5 mg/L eight standards

2.3運行緩沖溶液濃度與pH值的選擇

實驗驗證了硼砂-H3BO3電泳緩沖體系的基線較平穩(wěn)，檢測靈敏度較Tris-H3BO3高，故選擇硼砂-H3BO3作為運行緩沖溶液?？疾炝瞬煌瑵舛鹊呐鹕?H3BO3溶液對分離效果的影響。如圖2所示，緩沖溶液濃度較低時，電泳電流低，8種氨基酸因遷移時間較短未能得到較好的基線分離；濃度太高時，分離時間隨遷移時間的延長而增加，使檢測變得耗時，且電泳電流增大導致基線噪音增大，從而降低檢測的靈敏度與峰高。綜合考慮，選擇0.10 mol/L的硼砂-H3BO3為最優(yōu)運行緩沖溶液。

固定硼砂-H3BO3緩沖液濃度為0.10 mol/L，考察了其pH值在7.5～ 10.0范圍內(nèi)對分離檢測效果的影響。結(jié)果表明，當pH值小于8.0時，8種氨基酸不能實現(xiàn)基線分離，隨著pH值的增加，8種氨基酸的遷移時間增長，分離效果提高，但峰形變寬，噪音增大，檢測時間變長，檢測靈敏度有所降低。綜合考慮8種氨基酸的分離效果、檢測時間和檢測靈敏度，選擇硼砂-H3BO3溶液的最佳pH值為8.0。

2.4分離電壓與進樣時間的選擇

考察了分離電壓在13～ 23 kV范圍內(nèi)對分離檢測的影響。結(jié)果表明，分離電壓太低會使遷移時間變長，檢測時間變長，電泳峰形變寬，出現(xiàn)電泳峰重疊現(xiàn)象；隨著分離電壓的升高，則遷移時間逐漸縮短，可較快檢出分析物，但過高的分離電壓會使分離效果降低。因此，綜合考慮各物質(zhì)的分離度、靈敏度、檢測時間及焦耳熱等對分離檢測的影響，選擇17 kV為最優(yōu)分離電壓。

在選定最優(yōu)運行緩沖溶液濃度、pH值和分離電壓條件下，考察了不同進樣時間對峰高的影響。實驗結(jié)果顯示，峰高隨著進樣時間的增長而增高，檢出限降低。但進樣時間超過8 s后峰高增加不明顯，且電泳峰展寬，峰形拖尾，各分析物的分離效果降低，重現(xiàn)性差。綜合考慮，選擇8 s為最佳進樣時間。

2.5重復性、線性范圍與檢出限

配制一系列不同濃度的8種氨基酸混合標準溶液，在最優(yōu)條件下進行分離檢測，8種氨基酸的濃度分別在一定范圍內(nèi)與電泳峰電流呈線性關(guān)系，線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限如表1所示。以0.5 mg/L 的8種氨基酸混合標準溶液連續(xù)進樣6次，電泳圖如圖3A所示。峰高的相對標準偏差(RSD)為1.3%～1.8%，遷移時間的RSD為0.6%～1.0%，表明方法的重復性良好。為了進一步驗證該方法的優(yōu)勢，將本方法的檢測結(jié)果與其他方法進行比較，相關(guān)數(shù)據(jù)表明，本方法的靈敏度較高，檢出限較低(見表2)。

ComponentLinearrange(μg/L)Regressionequation*(mg/L)rDetectionlimit(μg/L)Threonine0.1～1000y=4.578x+8.9670.99970.04Taline0.2～1200y=3.872x+5.0230.99960.05Methionine0.1～1300y=3.437x+2.7540.99980.03Isoleucine0.5～1500y=3.691x+2.8730.99970.01Leucine0.3～1200y=4.884x+9.8910.99950.01Phenylalanine0.4～1200y=3.975x+5.8170.99980.02Lysine0.1～1200y=3.878x+4.9870.99960.04Tryptophan0.2～1400y=3.789x+4.1870.99980.02

*x:analyte concentration;y:peak current

表2　本實驗方法與其他方法檢測結(jié)果的比較

* not specified

2.6樣品測定與回收率

取淮山樣品超聲提取液100 μL，添加衍生化試劑OPA 20 μL，并進行80 s衍生化反應，加硼砂-H3BO3溶液定容至1.00 mL，搖勻,進樣檢測淮山中8種必需氨基酸的含量，電泳圖如圖3B。與標準溶液的電泳圖相比，1，2，3，4，5，6，7，8，x峰分別為蘇氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、色氨酸和未知物的電流峰，表明8種必需氨基酸可在12 min 內(nèi)實現(xiàn)基線分離，且分離效果良好。8種必需氨基酸的含量見表3，結(jié)果與文獻[16]相當。

為再次驗證CE-ED方法的可靠性，在淮山提取液中添加0.500 mg/g 8種必需氨基酸標準溶液進行加標回收率實驗，重復6次對樣品進行檢測，結(jié)果見表3。實驗結(jié)果表明，8種必需氨基酸的加標回收率為96.8%～102.0%，相對標準偏差(RSD)均不大于2.4%，由此可見用CE-ED方法檢測淮山中氨基酸含量準確、重現(xiàn)性好，可成為淮山中氨基酸分析的可行方法。

表3　淮山中8種氨基酸的含量及加標回收率(n=6)

3結(jié)論

本文以鄰苯二甲醛(OPA)為衍生劑與氨基酸發(fā)生衍生化反應，采用CE-ED 法檢測淮山中8種必需氨基酸的含量。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，8種氨基酸在12 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，被測物濃度與峰電流呈良好的線性關(guān)系。該方法簡單可靠、準確、靈敏度高、重現(xiàn)性好，為淮山中氨基酸的測定提供了一種有效方法?；瓷街?種氨基酸含量的測定結(jié)果也表明，淮山具有較高的營養(yǎng)價值，有良好的開發(fā)前景。

參考文獻：

[1]Hu Y F.J.Anal.Sci.(胡月芳.分析科學學報)，2014，30(4):533-536.

[2]Zhu Y L,Xu M Y,Zhou X Q.Chem.World(朱銀玲，徐美奕，周興起.化學世界)，2015，(3):129-130.

[3]Zheng X F,Shen J T,Duan C,Niu S C,Zhang Q,Duan X H.J.Instrum.Anal.(鄭希帆，沈江濤，段超，牛書操，張倩，段學輝.分析測試學報)，2015，34(6):670-675.

[4]Ren H B.Horticulture&Seed(任紅波.雜糧作物)，2003，23(4):246-247.

[5]Bu W,Ma Y J,Yu H.J.Instrum.Anal.(卜文，馬亞杰，于泓.分析測試學報)，2014，33(2):203-207.

[6]Zhang H,Wu S F,Yao H Y.FoodFerment.Ind.(張暉，吳勝芳，姚惠源.食品與發(fā)酵工業(yè))，2003，29(10):50-52.[7]Xi J,Fan B A,Wei C L.Chin.J.Anal.Lab.(郗娟，樊丙安，魏春龍.分析試驗室)，2012，31(10)：72-76.

[8]Dong L,Weng L,Qian Y Q,An D,Ping T T,Wang L.J.Chin.Inst.FoodSci.Technol.(董樂，翁凌，錢勇強，安冬，平婷婷，王力.中國食品學報)，2014，14(8)：248-255.

[9]Wang Y F,Cai Y L,Lin X,Yan J,Li H.Chem.Res.Appl.(王宇飛，蔡元麗，林夏，晏瑾，李暉.化學研究與應用)，2013，25(3)：311-316.

[10]Ding H M,Ge E N,Xu J D.Chin.J.Eep.Trad.Med.Form.(丁紅梅，葛爾寧，許家棟.中國實驗方劑學雜志),2013，19(2)：117-120.

[11]Song Y.StudyonBlackPigmentandAminoAcidsinBlackCorn.Wuxi:Jiangnan University(宋艷.黑玉米中黑色素和氨基酸的研究.無錫：江南大學),2008.

[12]Kong L Y,Wang Y,Cao Y H.J.Instrum.Anal.(孔令瑤，汪云，曹玉華.分析測試學報)，2008，27(5)：527-530.[13]Zhao Y,Hou Y Y,Tang G S,Wang S J,Cai E B,Zhang L X.Chin.J.Pharm.Anal.(趙巖，侯瑩瑩，唐國勝，王士杰，蔡恩博，張連學.藥物分析雜志),2014,34(8):1412-1416.

[14]Wang J,Shen L L,Chao Y X,Qian Y,Zhu D N.Lab.Med.(王錦，沈霖霖，曹銀祥，錢源，朱大年.檢驗醫(yī)學)，2005，20(5):424-427.

[15]Song Z F,Wang L,Ji F,Jin W D.J.JilinAgric.Sci.(宋志峰，王麗，紀鋒，金衛(wèi)東.吉林農(nóng)業(yè)科學)，2004，29(6)：54-58.

[16]Qiu S L,Wang W Y,Zhang S P,Hong J J,Yao Y F,Lin Y X.Chin.J.Trop.Crop.(邱珊蓮，王偉英，張少平，洪建基，姚運法，林一心.熱帶作物學報)，2014，35(11)：2307-2311.

Determination of Eight Essential Amino-acid in Yam by Capillary Electrophoresis with Electrochemical Detection

HU Yue-fang*,HUANG Zhi-qiang,LI Jin-fang

(College of Chemistry and Bioengineering，Hezhou University，Hezhou542899，China)

Abstract：After the derivatization reaction of 8 kinds of essential amino acids(threonine,valine,methionine,isoleucine,leucine,phenylalanine,lysine,tryptophan) in human body with o-phthalaldehyde(OPA),a method of capillary electrophoresis coupled with electrochemical detection(CE-ED) was established for the determination of these eight essential amino-acids.Effects of derivatization time,detection potential,concentration and pH value of running buffer,separation voltage and injection time on the detection were investigated.Under the optimum conditions,a good baseline separation and highly sensitive detection for eight essential amino-acid in yam were achieved in 12 min.The calibration curves of eight essential amino acids were linear in the range of 0.1-1 500 μg/L,with detection limits(S/N=3) of 0.01-0.05 μg/L.The relative standard deviations(RSDs) for peak heights of eight essential amino-acids were in the range of 1.3%-1.8%,and the RSDs for migration times were 0.6%-1.0%.The method was successfully applied in the assay of eight essential amino-acids in samples of yam,with spiked recoveries of 96.8%-102.0% and RSDs not more than 2.4%.

Key words：capillary electrophoresis;electrochemical detection;yam;amino-acid

收稿日期：2015-10-12；修回日期：2015-11-05

基金項目：廣西高?？茖W技術(shù)研究贊助項目(2013YB238)；賀州市科學研究與技術(shù)開發(fā)計劃項目(賀科轉(zhuǎn)1408035)

*通訊作者：胡月芳，碩士，副教授，研究方向：電化學分析，Tel:0774-5271906，E-mail:huyuefang@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.017

中圖分類號：O657.8；O629.7

文獻標識碼:A

文章編號：1004-4957(2016)04-0471-05