傅賢明，劉智晶，蔡淑賢，李　萍，李云騰，陳敬華*

(1.莆田學(xué)院　藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建　莆田　351100；2.福建醫(yī)科大學(xué)　藥學(xué)院

藥物分析學(xué)系，福建　福州　350108)

研究簡報

基于DNA銀鉑雙金屬納米簇的電化學(xué)傳感器用于Hg2+的檢測

傅賢明1，劉智晶2，蔡淑賢2，李萍1，李云騰1，陳敬華2*

(1.莆田學(xué)院藥學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，福建莆田351100；2.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院

藥物分析學(xué)系，福建福州350108)

摘要：以DNA為模板，通過一步法合成了一種銀鉑雙金屬納米簇(DNA-Ag/Pt NCs)，其粒徑為2～4 nm，并表現(xiàn)出較強的過氧化物模擬酶活性，能催化H2O2氧化TMB使溶液變藍色?；诖颂匦?，結(jié)合Hg2+可與胸腺嘧啶堿基形成T-Hg2+-T結(jié)構(gòu)，設(shè)計研制了一種非標(biāo)記的電化學(xué)傳感器，用于Hg2+的靈敏特異性檢測。實驗結(jié)果表明，在最佳條件下，該傳感器的檢測范圍為0.65～3.5 nmol/L，檢出限達0.17 nmol/L，能較好地識別Hg2+。該傳感器有望用于實際水樣中痕量汞的檢測。

關(guān)鍵詞：DNA模板；雙金屬納米簇；模擬酶；汞離子；電化學(xué)傳感器

隨著我國生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展、工業(yè)化進程的加快及城市人口的迅猛增長，環(huán)境污染日益嚴重，逐漸演變?yōu)橐粋€重大的社會問題，成為人們關(guān)注的焦點。環(huán)境中的重金屬污染，嚴重威脅著人類的健康。汞是對人類健康和環(huán)境最具危害性的劇毒重金屬元素之一。汞進入生物體中很容易被吸收，難降解，易在體內(nèi)積累，并可通過食物鏈不斷富集，當(dāng)達到一定濃度時，會引發(fā)一系列精神和神經(jīng)系統(tǒng)方面的疾病[1-3]。生活中急性或慢性汞中毒并不少見，因此如何方便快速地檢測環(huán)境中的Hg2+顯得格外重要。目前，傳統(tǒng)的測定痕量汞的方法主要有電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[4]、石墨爐原子吸收光譜法[5]、冷蒸氣原子吸收光譜法[6]、熒光光譜法[7]、電化學(xué)發(fā)光法[8-9]等。這些方法雖然可以有效地測定Hg2+，但由于需要昂貴的儀器、復(fù)雜的處理過程或較長的分析周期，不可避免地限制了其實際應(yīng)用。

近年來，Ono團隊[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，Hg2+可選擇性地與胸腺嘧啶(T堿基)結(jié)合，形成T-Hg2+-T發(fā)卡結(jié)構(gòu)。受其啟發(fā)，人們設(shè)計研制了許多基于DNA的Hg2+傳感器，用于分析檢測溶液中的Hg2+，如比色傳感器[12-13]、熒光傳感器[14]、電化學(xué)傳感器[15-16]等。在這些檢測法中，電化學(xué)方法因具有所需儀器成本低、操作方便快速、靈敏度高等優(yōu)點而受到關(guān)注。但痕量汞的電化學(xué)檢測策略和方法往往需要通過一些標(biāo)記措施，如在一端標(biāo)記電化學(xué)活性物質(zhì)二茂鐵Fc[15]或亞甲基藍MB[16]等，通過測定電活性物質(zhì)的氧化還原電流，構(gòu)建“Turn-on”或“Turn-off”型檢測方法。這些標(biāo)記措施，使得操作流程變得復(fù)雜或昂貴，并影響了傳感器的穩(wěn)定性和實用性。因此，簡單易用、價廉、靈敏度高的非標(biāo)記型的電化學(xué)傳感器正成為研究方向。而值得注意的是，人造模擬酶因可用于非標(biāo)記型傳感器的制作正逐漸引起人們的興趣。與天然酶相比，人造酶具有合成簡單、價格低廉、性能穩(wěn)定等優(yōu)點。目前，已發(fā)現(xiàn)一些貴金屬納米粒子[17-19]、金屬氧化物納米材料[20]、碳納米材料[21]及復(fù)合材料[22-23]具有過氧化物模擬酶活性，能催化H2O2氧化3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。但因模擬酶活性較低，使用時產(chǎn)生的電化學(xué)信號較弱，限制了傳感器的靈敏度。本文以DNA為模板，通過一步法合成了一種DNA銀鉑雙金屬納米簇，這種雙金屬納米簇具有較強的過氧化物模擬酶活性。利用這一特性，設(shè)計研制了一種簡單、無標(biāo)記的電化學(xué)傳感器，并將其用于Hg2+的高靈敏檢測。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

CHI660D電化學(xué)分析儀(上海辰華儀器公司),三電極系統(tǒng)：玻碳電極(GCE，Ф3 mm)為工作電極，Ag/AgCl電極為參比電極，鉑絲電極為對電極；UV-2450型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；Cary Eclipse熒光分光光度計(安捷倫科技有限公司)；KQ116型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；VS-100H型恒溫混勻儀(無錫沃信儀器有限公司)；H1650-W型臺式微量高速離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；pHS-3B型精密酸度計(上海雷磁儀器廠)；BS110S電子分析天平(德國 Sartorius公司)。

硝酸銀(AgNO3)、30%過氧化氫(H2O2)、檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7·2H2O)、二水合磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、硼氫化鈉(NaBH4)、氯化汞(HgCl2)均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；四氯鉑酸鉀(K2PtCl4，Adamas 試劑有限公司)；3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB，Aladdin工業(yè)公司)；3-嗎啉丙磺酸(MOPS，Sigma-Aldrich化學(xué)有限公司)；其它試劑均為分析純。實驗用水為Millipore Milli-Q系統(tǒng)凈化的超純水(18.2 MΩ·cm)。

相關(guān)DNA序列均由生工生物工程(上海)有限公司合成，堿基序列如下：用于合成Ag/Pt NCs的富含C堿基的模板DNA序列(T1)：5′-CCC CCT AAC TCC CCC-3′；含C堿基較少的任意DNA系列(T2)：5′-GCG ACA TGG TAA TGG-3′；富含T堿基的DNA序列(T3)：5′-GGT TGT TTG TT-3′；5′-端氨基標(biāo)記富含T堿基的DNA探針序列(AP)：5′-CCC CCT TCT TTC TTC C-3′；由T1和T3序列相連接的DNA探針序列(TP)：5′-CCC CCT AAC TCC CCC AAA AAG GTT GTT TGT T-3′，TP序列中間插入了一段含有5個A堿基的連接序列。

1.2銀鉑雙金屬納米簇的制備

將10 μL AgNO3(1 mmol/L)溶液、10 μL DNA(100 μmol/L，T1或TP)溶液和20 μL K2PtCl4(3 mmol/L)溶液混合后，加入60 μL檸檬酸三鈉(10 mmol/L)溶液，暗處反應(yīng)10 min后加入100 μL NaBH4(200 μmol/L)溶液，45 ℃金屬浴5 min，冷卻至室溫后得到DNA-Ag/Pt NCs，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3銀鉑雙金屬納米簇的米氏實驗

將10 μL DNA-Ag/Pt NCs(5 μmol/L)溶液和20 μL H2O2(500 mmol/L)溶液加入到130 μL HAc-NaAc(200 mmol/L，pH 4.0)緩沖溶液中，向上述混合液中加入40 μL新鮮配制的不同濃度的TMB溶液，在紫外可見分光光度計上固定波長為652 nm，以時間掃描方式進行動力學(xué)實驗測定。由Michaelis-Menten雙倒數(shù)方程1/v=(Km/Vmax)(1/[S])+1/Vmax(式中v為初始反應(yīng)速率，Km為表觀米氏常數(shù)，Vmax為最大反應(yīng)速率，[S]為底物濃度)，分別計算出酶催化反應(yīng)的Km和Vmax。

1.4探針修飾電極的制備

將玻碳電極(GCE)依次用直徑為0.3，0.05 μm的Al2O3和水的混合物拋光至鏡面，并先后用無水乙醇、水超聲清洗5 min，以除去吸附在電極表面上的雜質(zhì)，用水沖洗，氮氣吹干。

將處理后的GCE置于0.01 mol/L多聚賴氨酸(PLLy)溶液中，用循環(huán)伏安法電聚合修飾PLLy膜，再用水沖洗電極后于室溫下干燥，得到PLLy修飾電極(PLLy/GCE)。將電極倒置，在電極表面滴加5 μL偶聯(lián)活化劑(內(nèi)含5 mmol/L EDC和8 mmol/L NHS的pH 7.4磷酸緩沖液)，室溫自然蒸干，用水沖洗，除掉未結(jié)合在修飾電極表面的偶聯(lián)活化劑，氮氣吹干。然后在電極表面滴加5 μL的AP溶液，一定時間后用水沖洗電極并氮氣吹干，最后滴加含不同濃度Hg2+的TP-Ag/Pt NCs溶液，結(jié)合一定時間后再次清洗吹干，得到探針修飾電極(TP-Ag/Pt NCs/Hg2+/AP/PLLy/GCE)。

1.5電化學(xué)檢測

將探針修飾電極(TP-Ag/Pt NCs/Hg2+/AP/PLLy/GCE)插入含有0.8 mmol/L TMB、15 mmol/L H2O2的PB(100 mmol/L，pH 5.0)緩沖溶液中，測量其CV曲線和I～t曲線。CV法的初始電位為-0.20 V，掃描速率為0.10 V/s，采樣間隔為0.001 V，靜置時間為2 s。I～t法的初始電位為-0.10 V，采樣間隔為0.10 s，實驗時間100 s，靜置時間為0 s。

2結(jié)果與討論

2.1電化學(xué)傳感器檢測機理

傳感策略如圖1所示，富含C堿基的T1序列可作為DNA模板用來合成銀鉑雙金屬納米簇，該納米簇具有過氧化物模擬酶活性，能催化H2O2氧化TMB使溶液顯藍色。為了將其催化性能應(yīng)用于電化學(xué)傳感器，進行如下設(shè)計：利用Hg2+可與胸腺嘧啶(T堿基)形成T-Hg2+-T發(fā)卡結(jié)構(gòu)，選用兩條富含T堿基的DNA序列，一條經(jīng)5′-端氨基標(biāo)記后(AP)通過酰胺鍵連接于玻碳電極上，另一條與T1序列相連接(TP)，用來合成銀鉑雙金屬納米簇(TP-Ag/Pt NCs)，當(dāng)目標(biāo)物Hg2+存在時，兩條序列通過T-Hg2+-T發(fā)卡結(jié)構(gòu)雜交起來，從而完成電極的組裝。

將此電極插入含有TMB和H2O2的溶液中掃描I～t曲線，對比無Hg2+存在的情況，可觀察到電流明顯增大，同時溶液的顏色由無色變?yōu)樗{色。電流的大小與Hg2+的濃度成正比，因此可用于Hg2+的定量檢測。

圖2　DNA-Ag/Pt NCs的透射電子顯微鏡圖Fig.2　TEM image of DNA-Ag/Pt NCs

2.2銀鉑雙金屬納米簇的合成表征

Dickson等[24]首次采用短的核苷酸鏈合成銀納米簇。Ag+與胞嘧啶(C堿基)之間存在較強的親合力，通過化學(xué)還原的方法，用NaBH4還原結(jié)合在胞嘧啶周圍的Ag+，被還原的Ag原子位于寡核苷酸的胞嘧啶上。當(dāng)還原出的納米簇的尺寸足夠小時，DNA-Ag NCs會展示出強烈的吸收和發(fā)射性能，具有較好的熒光性質(zhì)。本實驗選用富含C堿基的DNA序列(T1)作為合成模板，并在合成過程中同時加入了Ag+和Pt2+。在NaBH4的還原作用下，Ag+首先與富含C堿基的T1序列生成Ag NCs，而后通過Ag原子和Pt2+離子間的置換反應(yīng)，在Ag NCs的表面上生成Pt NCs，生成的Ag+同時又被NaBH4還原為Ag NCs，如此持續(xù)反應(yīng)，最終生成銀鉑雙金屬納米簇(DNA-Ag/Pt NCs)[25]。

圖2為DNA-Ag/Pt NCs的透射電子顯微鏡圖，從圖中可以看出，銀鉑雙金屬納米簇的直徑為2～4 nm，形狀近似球形且分布較均勻，如此小的粒徑歸功于DNA模板提供了一個狹窄的納米級的生長空間。DNA-Ag NCs具有顯著的熒光特性，而DNA-Ag/Pt NCs卻觀察不到任何熒光現(xiàn)象，這可能是因為生成雙金屬簇時鉑簇覆蓋在銀簇的表面，從而導(dǎo)致了銀簇的熒光猝滅。

2.3銀鉑雙金屬納米簇的模擬酶活性

DNA-Ag/Pt NCs具有過氧化物模擬酶活性，能催化H2O2氧化底物TMB，使溶液顯藍色。而相同反應(yīng)條件下合成的DNA-Ag NCs卻沒有模擬酶活性。因此，DNA-Ag/Pt NCs的過氧化物酶活性應(yīng)該來源于堆積在Ag NCs表面上的Pt NCs，而Ag NCs對Pt NCs的生成起到了協(xié)同促進作用[25]。為了驗證這一結(jié)論，做了如下兩個實驗：①在相同反應(yīng)條件、不加AgNO3情況下進行合成，所得產(chǎn)物并不能使H2O2/TMB體系變色，說明產(chǎn)物并非Pt NCs；②在相同的實驗條件下，將DNA模板T1系列更換為含C堿基較少的T2系列和含T堿基較多的T3系列進行同樣合成，所得產(chǎn)物也不能使H2O2/TMB體系變色，說明T2和T3系列并不能作為Ag/Pt NCs的合成模板。這兩個實驗結(jié)果證明了Pt NCs的生成有賴于Ag NCs的存在作為支持，而選擇一條有利于Ag NCs生成的富含C堿基的DNA系列作為合成模板是DNA-Ag/Pt NCs合成成功的關(guān)鍵。同時，這也說明對于TP系列(由T1和T3相連接而成)，T3序列的存在并不影響T1序列作為合成的模板，符合上述傳感策略設(shè)計的思想。

為了獲得最佳的催化活性，在相同實驗條件下比較了一系列不同銀鉑比的雙金屬納米簇催化氧化TMB后在652 nm處的吸收峰強度。發(fā)現(xiàn)當(dāng)c(AgNO3)∶c(K2PtCl4)= 1∶6時，652 nm處具有最強的吸收峰，故合成實驗中AgNO3和K2PtCl4的濃度比固定為1∶6。

為了更進一步明確DNA-Ag/Pt NCs的催化性能，利用動力學(xué)方法求得其酶促反應(yīng)的米氏方程，得到DNA-Ag/Pt NCs的表觀米氏常數(shù)Km=136 μmol/L。與同樣具有過氧化物模擬酶活性的其它物質(zhì)(如：DNA-Pt NPs的Km=4.88 mmol/L[26]；Pd NPs的Km=650 μmol/L[27]；PtPdNAs/GNs的Km=0.33 mmol/L[28]；H-GNs的Km=5.1 mmol/L[29]；Hemin的Km=4.84 mmol/L[29]；Fe0.5Co0.5NPs的Km=1.79 mmol/L[30]。底物均為TMB)相比，DNA-Ag/Pt NCs的Km值更小，說明DNA-Ag/Pt NCs與底物TMB的親合性更強。同時DNA-Ag/Pt NCs具有易合成、價廉、易標(biāo)記、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，有望應(yīng)用于不同的生物傳感器，用于對小分子、蛋白質(zhì)或DNA的比色法分析。

圖3　不同電極的CV圖Fig.3　Cyclic voltammograms(CVs)of different electrodesa.bare electrode,b.PLLy membrane electrode,c.blank electrode(without Hg2+),d.modified electrode(Hg2+3.5 nmol/L)；insert:photographs of TMB oxidation catalyzed by blank electrode(colorless) and modified electrode(blue)

2.4電化學(xué)傳感器測定Hg2+

2.4.1CV圖表征通過掃描裸電極(GCE)、膜電極(PLLy/GCE)、空白電極(不含Hg2+)和修飾電極(TP-Ag/Pt NCs/Hg2+/AP/PLLy/GCE)在含有H2O2/TMB的PB緩沖溶液(以下簡稱顯色液)中的CV圖，對傳感過程進行表征。圖3中觀察到TMB的兩組特征氧化還原峰。圖3曲線a為裸電極的CV圖，峰電流很小。曲線b和曲線c為膜電極和空白電極的CV圖，峰電流有所增大，但相對較小。曲線d為修飾電極的CV圖，峰電流明顯增大，這是因為當(dāng)目標(biāo)物Hg2+存在時，電極連接上TP-Ag/Pt NCs，可催化氧化顯色液中的TMB，從而產(chǎn)生放大的氧化還原峰電流，并可使顯色液變藍。以上研究結(jié)果與實驗設(shè)想一致。

2.4.2實驗條件的優(yōu)化為了獲得相對較大的電流，對實驗條件進行了一系列的優(yōu)化。在不同起始電位條件下掃描I～t曲線，確定最佳起始電位為-0.1 V；固定Hg2+的濃度不變，對電極的組裝濃度比進行優(yōu)化，確定AP和TP-Ag/Pt NCs的最佳濃度比為0.1 μmol/L∶0.1 μmol/L；在最佳濃度比條件下，對Hg2+的結(jié)合時間進行優(yōu)化，確定結(jié)合時間為60 min。

圖4　傳感器對不同離子的電流響應(yīng)Fig.4　Specificity investigation of the sensor for Hg2+against other ions(3 nmol/L for each)

Added(nmol/L)Detected(nmol/L)Recovery(%)RSD(%)0-*1.21.1696.75.72.22.31105.06.53.23.27102.26.9

* no detected

2.4.3Hg2+的定量檢測在選定的最佳實驗條件下，將結(jié)合不同濃度Hg2+的修飾電極插入顯色液中，掃描I～t曲線。結(jié)果顯示，隨著Hg2+濃度(c)的增加，電流(I)逐漸增大，且ΔI與c在0.65～3.5 nmol/L范圍內(nèi)呈較好的線性關(guān)系。線性回歸方程為：ΔI(nA)=239.86c(nmol/L)+2.99(r2=0.991 6)，檢出限(3σ/n)為0.17 nmol/L。Lee等[12]和Kanayama等[13]分別報道了一種基于金納米粒子的比色法檢測Hg2+，檢出限分別為100 nmol/L和0.5 μmol/L；Xia等[14]報道了一種標(biāo)記型的熒光方法檢測Hg2+，檢出限為100 nmol/L；Liu等[15]報道了一種二茂鐵Fc標(biāo)記的電化學(xué)傳感器用來檢測Hg2+，檢出限為0.5 nmol/L；Jiang等[16]報道了一種MB標(biāo)記的檢測Hg2+的電化學(xué)傳感器，檢出限為8.2 nmol/L。與上述文獻方法對比，本實驗研制的新型傳感器對Hg2+具有更高的分析靈敏度。另外，用濃度為1.5 nmol/L的Hg2+重復(fù)8次實驗，相對標(biāo)準偏差(RSD)為6.5%，說明該傳感器具有較好的重現(xiàn)性。

2.4.4傳感器的特異性在相同實驗條件下考察了該傳感器對其它離子的選擇性(圖4)。結(jié)果顯示，當(dāng)目標(biāo)離子為K+,Ca2+，Na+，Mg2+，Bi3+，Cu2+，Pb2+，Zn2+，Cr3+時，傳感器的電流響應(yīng)值較小，而當(dāng)目標(biāo)離子為Hg2+時，電流響應(yīng)值則大大增加，凈電流強度為其它離子的4.4～54.3倍，說明該傳感器對Hg2+具有很好的選擇性，這主要歸功于傳感策略設(shè)計中使用了富含T堿基的AP和TP序列，它們能特異性識別Hg2+形成T-Hg2+-T發(fā)卡結(jié)構(gòu)，而對其它離子不響應(yīng)。因此，本實驗研制的傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)對Hg2+的特異性識別和檢測。2.4.5水樣的檢測最佳實驗條件下，在自來水中添加Hg2+，用該傳感器進行分析檢測，結(jié)果如表1所示。對相同濃度的水樣進行5次重復(fù)檢測，回收率為96.7%～105.0%，RSD為5.7% ～6.9%，結(jié)果令人滿意。該新型傳感器有望用于實際樣本中痕量Hg2+的測定。

3結(jié)論

本實驗合成了一種DNA銀鉑雙金屬納米簇，這種雙金屬納米簇具有過氧化物模擬酶活性，利用這一特性，結(jié)合Hg2+可與T堿基形成T-Hg2+-T發(fā)卡結(jié)構(gòu)，設(shè)計研制了一種簡單、無標(biāo)記的電化學(xué)傳感器，用于Hg2+的高靈敏、高特異性檢測。實驗結(jié)果表明，該新型傳感器的檢出限可達0.17 nmol/L，并能特異性識別Hg2+。該傳感器有望用于實際水樣中痕量汞的測定。

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Electrochemical Sensor for Detection of Mercury(Ⅱ)Based on DNA-templated Ag/Pt Bimetallic Nanoclusters

FU Xian-ming1,LIU Zhi-jing2,CAI Shu-xian2,LI Ping1,LI Yun-teng1,CHEN Jing-hua2*

(1.College of Pharmacy and Medical Technology,Putian University,Putian351100,China；2.Department of Pharmaceutical Analysis,School of Pharmacy,Fujian Medical University,Fuzhou350108,China)

Abstract：In this paper, a facile one-step approach to synthesize DNA-templated Ag/Pt bimetallic nanoclusters was developed.The obtained DNA-templated Ag/Pt bimetallic nanoclusters(DNA-Ag/Pt NCs) with diameters about 2-4 nm display a high efficient peroxidase-like catalytic activity,which can catalyze hydrogen peroxide(H2O2)-mediated oxidation of the substrate,3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine(TMB),to produce a blue color reaction.Based on this,the hairpin structure of thymine-Hg2+-thymine(T-Hg2+-T) interaction was utilized to design an unlabeled DNA electrochemical sensor for the Hg2+detection with high sensitivity and selectivity.Under the optimum conditions,the sensor showed a good linear relationship in the range of 0.65-3.5 nmol/L with a detection limit as low as 0.17 nmol/L and also exhibited an ultra high discrimination ability for Hg2+.All above properties make the sensor a promising candidate for Hg2+trace detection in real water samples.Key words：DNA template；bimetallic nanoclusters；mimic enzyme；mercury(Ⅱ)；electrochemical sensor

收稿日期：2015-08-14；修回日期：2015-10-15

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(21375017,21105012)；福建省自然科學(xué)基金杰出青年人才項目(2013J06003)；福建省科技廳重點項目(2013Y0045)；福建省高等學(xué)校新世紀優(yōu)秀人才支持計劃資助(JAl3130)；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項目(2014-ZQN-ZD-26)；福建省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(莆田學(xué)院201511498053)

*通訊作者：陳敬華，博士，教授，研究方向：電化學(xué)生物傳感器，Tel:0591-22862016，E-mail:cjh_huaxue@126.com

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.04.009

中圖分類號：O657.1；Q524

文獻標(biāo)識碼:A

文章編號:1004-4957(2016)04-0426-06