楊 碩，張云輝，孫艷玲，周志平，施 明

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程序性死亡受體1、程序性死亡配體1和神經(jīng)生長因子在肝癌組織中的表達(dá)及意義

楊 碩，張云輝，孫艷玲，周志平，施 明

[摘要]目的 檢測肝細(xì)胞癌組織中程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）及其主要配體程序性死亡配體1 （programmed death ligand-1, PD-L1）、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF）的表達(dá)與不同病理分級、肝癌臨床分期、肝功能及AFP的關(guān)系。方法 采用免疫組織化學(xué)法檢測63例肝癌石蠟包埋組織標(biāo)本中PD-1、PD-L1和NGF的表達(dá)量，16例正常供體肝臟石蠟包埋組織標(biāo)本作為正常對照組。比較不同病理分級、不同肝癌臨床分期、不同肝功能及不同AFP水平情況下肝癌組織中PD-1、PD-L1和NGF的表達(dá)差異。結(jié)果 肝癌組織中PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率高于正常對照組（P＜0.05），不同病理分級肝癌組織中PD-1、PD-L1及NGF的陽性表達(dá)率不同，以中分化肝癌最高（P＜0.05）。PD-1、PD-L1及NGF陽性表達(dá)率以肝癌巴塞羅那分期C期升高最為顯著（P＜0.05）。不同肝功能Child分級患者肝癌組織中PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。肝癌組織PD-1、PD-L1、NGF陽性表達(dá)率在血清AFP水平≥400 μg/L與＜400 μg/L患者中差異有統(tǒng)計學(xué)意義，前者高于后者，而在年齡≥50歲與＜50歲患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 肝癌患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率明顯升高。PD-1、PD-L1和NGF在肝癌組織中的表達(dá)可能在肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中可能發(fā)揮一定作用。

[關(guān)鍵詞]癌，肝細(xì)胞；淋巴細(xì)胞活化；淋巴細(xì)胞；評價研究

[作者單位] 100850 北京，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院2012級研究生隊（楊碩），基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所（楊碩、施明）；100039 北京，解放軍第三〇二醫(yī)院醫(yī)學(xué)信息中心（張云輝），肝膽外科二中心（孫艷玲），感染性疾病診療與研究中心（周志平）

肝癌的發(fā)病機制十分復(fù)雜，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與多種基因突變、細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路異常及多種免疫逃避等有關(guān)。在腫瘤免疫應(yīng)答中，腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡是腫瘤免疫逃避的主要機制。已知T淋巴細(xì)胞的活化需要抗原提供的第一信號和協(xié)同刺激分子提供的第二信號。程序性死亡受體1（programmed death 1, PD-1）及其主要配體程序性死亡配體1（programmed death ligand-1, PD-L1）作為免疫球蛋白超家族協(xié)同刺激分子的重要成員，為負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號，近年來被證實與T淋巴細(xì)胞免疫功能缺陷相關(guān)，是導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的重要機制[1-2]。神經(jīng)生長因子（nerve growth factor, NGF）是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白家族的一種，是一種與神經(jīng)細(xì)胞的分化、生長、修復(fù)、再生有關(guān)的細(xì)胞因子。研究顯示，NGF還與腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[3-4]。本研究檢測肝癌組織中PD-1、PD-L1及NGF的表達(dá)，分析與患者不同肝癌病理分級、肝癌臨床分期、肝功能及AFP的關(guān)系，討論其在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1　對象與方法

1.1對象 選取 2011年6月—2015年1月在解放軍第三〇二醫(yī)院住院行手術(shù)治療的HBV相關(guān)肝癌患者63例，其中男57例，女6例，年齡30～70（51.23±5.50）歲。63例均接受核苷（酸）類似物抗病毒治療，入院后檢測HBV DNA均為陰性，HBsAg均為陽性，肝癌標(biāo)本術(shù)后病理檢查結(jié)果均為肝細(xì)胞癌。

采用免疫組織化學(xué)（免疫組化）法檢測63例肝癌石蠟包埋組織標(biāo)本中PD-1、PD-L1和NGF的分布和表達(dá)情況，根據(jù)病理檢查結(jié)果將63例分為3組：高分化組20例，中分化組25例，低分化組18例。對照組來自同院肝膽外科二中心提供的16例正常供體肝臟石蠟包埋組織標(biāo)本，16例供者均為男性，年齡30～42歲。所有標(biāo)本均經(jīng)10％福爾馬林液固定，石蠟包埋切片。

1.2免疫組化檢測 石蠟切片在65 ℃烤箱干烤30 min，在二甲苯中浸泡15 min，然后在無水乙醇、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中分別浸泡各5 min，雙蒸水浸泡5 min。將切片浸入枸櫞酸修復(fù)液（0.01 mol/L，pH值6.0）中進行抗原修復(fù)。室溫下用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，0.3％雙氧水室溫孵育15 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下磷酸鹽緩沖液洗滌3次。滴加正常羊血清封閉液，37 ℃孵育30 min。滴加適當(dāng)1∶200稀釋的第一抗體，4 ℃ 孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液沖洗3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG，37 ℃ 孵育30 min，磷酸鹽吐溫緩沖液沖洗3次，二甲氨基偶氮苯顯色蘇木素復(fù)染，4 min后流水沖洗。分別在70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇和無水乙醇中脫水各3 min。中性樹脂封片，OLYMPUS顯微鏡觀察切片并拍照。

1.3結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 免疫組化切片均由2名資深病理科醫(yī)師雙盲獨立觀察評估，以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃至棕褐色顆粒為陽性顯色。先在低倍鏡下觀察切片整個視野，分別在腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)隨機選擇5個高倍視野（×400），染色強度分級如下：無著色為0分，淡黃色為1 分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞密度分級為：陽性細(xì)胞數(shù)≤10％為1分，10％～50％為2分，＞50％為3分。2項得分相乘結(jié)果≥3分為陽性表達(dá)。腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)內(nèi)任一項陽性均為陽性表達(dá)[5-6]。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用CHISS 2004軟件進行統(tǒng)計分析計量資料呈正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，用±s表示。2組計量資料差異性比較用成組t檢驗（組間方差齊）；多組間計量資料差異性比較用單因素方差分析（組間方差齊），多重比較用q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PD-1、PD-L1、NGF在肝癌組織中的分布及表達(dá)

2.1.1分布 肝癌組織免疫組化染色可見PD-1、PD-L1和NGF分布，而正常肝組織染色較少見到（圖1）。

圖1　肝組織免疫組化染色結(jié)果（×400）Figure 1 Immunohistochemical staining of liver tissue（×400）

2.1.2 PD-1陽性表達(dá)率 PD-1在高分化組、中分化組、低分化組和對照組的陽性表達(dá)率見表1，4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PD-1陽性表達(dá)率在高、中、低分化肝癌組織中明顯高于正常組織（P均＜0.05），其中以中分化肝癌組織陽性率最高（P均＜0.05），但高分化組與低分化組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1.3PD-L1陽性表達(dá)率 PD-L1在高分化組、中分化組、低分化組和對照組的陽性表達(dá)率見表1，4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PD-L1陽性表達(dá)率在高、中、低分化肝癌組織中明顯高于正常組織（P均＜0.05），其中以中分化肝癌組織陽性率最高，其次為高分化組和低分化組（P均＜0.05）。

2.1.4NGF陽性表達(dá)率 NGF在高分化組、中分化組、低分化組和對照組的陽性表達(dá)率見表1，4組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。NGF陽性表達(dá)率在高、中、低分化肝癌組織中明顯高于正常組織（P均＜0.05），其中以中分化肝癌組織陽性率最高，其次為高分化組和低分化組（P均＜0.05）。

表1　不同病理分化肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 1 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens with different pathological differentiation (±s，％)

表1　不同病理分化肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 1 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens with different pathological differentiation (±s，％)

注：多重比較用q檢驗，a. 與高分化組比較，P＜0.05；b. 與中分化組比較，P＜0.05；c. 與低分化組比較，P＜0.05

病理分級　n　PD-1　PD-L1　NGF高分化組　20　3.33±0.47　5.70±1.31　3.00±0.78中分化組　25　32.97±2.87a21.77±1.81a17.77±1.46a低分化組　18　3.46±0.84b2.57±1.71ab8.67±1.07ab對照組　16　1.57±0.19abc1.19±0.32abc2.06±0.26abcF值　1 918.400　863.296　1 030.144 P值　0.000　0.000　0.000

2.2不同年齡患者肝癌組織PD-1、PD-L1、NGF陽性表達(dá)率 年齡≥50歲和＜50歲患者肝癌組織PD-1、PD-L1、NGF陽性表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

表2　不同年齡患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 2 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients at different ages (±s，％)

表2　不同年齡患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 2 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients at different ages (±s，％)

年齡（歲）n　PD-1　PD-L1　NGF ≥50 　39 14.65±8.24　9.24±5.32　10.52±3.21 ＜50 　24 12.92±6.28　7.91±6.65　8.55±4.76 t值　0.882　0.875　1.963 P值　0.381　0.385　0.054

2.3不同肝功能Child分級患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率 PD-1、PD-L1和NGF在不同肝功能Child分級患者肝癌組織表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表3）。

表3　不同肝功能Child分級患者肝癌組織PD-1、PD-L1 和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 3 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients with different Child-Pugh grades(±s，％)

表3　不同肝功能Child分級患者肝癌組織PD-1、PD-L1 和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 3 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients with different Child-Pugh grades(±s，％)

Child分級　n　PD-1　PD-L1　NGF A級　26　8.12±4.28　6.22±3.23　7.09±4.36 B級　20　10.36±5.24　7.91±2.65　8.54±4.42 C級　17　11.25±4.85　7.74±3.36　10.85±6.35 F值　2.532　1.034　2.923 P值　0.088　0.362　0.062

2.4不同巴塞羅那分期患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率 巴塞羅那分期C期患者PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率最高（P均＜0.05），而A、B、D期患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表4）。

表4　不同巴塞羅那分期患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 4 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients at different Barcelona clinic liver cancer stages (±s，％)

表4　不同巴塞羅那分期患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，％）Table 4 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients at different Barcelona clinic liver cancer stages (±s，％)

注：多重比較用q檢驗，a. 與A期比較，P＜0.05；b. 與B期比較，P＜0.05；c. 與C期比較，P＜0.05

巴塞羅那分期　n　PD-1　PD-L1　NGF A期　16　5.01±5.62　5.65±4.43　4.56±5.98 B 期　21　7.25±3.42　6.35±4.25　6.76±3.58 C期 　15 11.65±6.58ab10.88±7.69ab　9.87±3.23abD期　11　8.27±5.89　6.97±5.38　7.35±3.28 F值　4.203　2.837　4.320 P值　0.009　0.046　0.008

2.5不同血清AFP水平患者PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率 血清AFP水平≥400 μg/L患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率明顯高于＜400 μg/L歲患者（P均＜0.05）。見表5。

表5　不同AFP水平患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，μg/L）Table 5 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients with different AFP levels (±s，μg/L)

表5　不同AFP水平患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率（±s，μg/L）Table 5 Positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens of patients with different AFP levels (±s，μg/L)

AFP（μg/L）　n　PD-1　PD-L1　NGF ≥400　48　13.25±7.12 9.96±7.49　11.05±5.28 ＜400　15　6.58±5.34 5.35±4.76　7.69±4.87 t值　3.339　2.240　2.189 P值　0.001　0.029　0.032

3　討論

細(xì)胞免疫是機體抗腫瘤免疫的主要免疫機制，在細(xì)胞免疫應(yīng)答過程中，T淋巴細(xì)胞充當(dāng)了主要角色。T淋巴細(xì)胞在靜息狀態(tài)下低表達(dá)PD-1，而T淋巴細(xì)胞的激活引起PD-1表達(dá)上調(diào)。PD-1 作為一種抑制共受體，與PD-L1相互作用后能抑制T淋巴細(xì)胞活性，使細(xì)胞阻滯在G0/G1期，從而抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，阻礙其分化為漿細(xì)胞，并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞凋亡。在腫瘤免疫應(yīng)答中，腫瘤抗原特異性T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡是腫瘤免疫逃避的主要機制。機體免疫細(xì)胞的激活或抑制是通過正性信號和負(fù)性信號來調(diào)節(jié)，PD-1/PD-L1是負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號，抑制了腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞的免疫活性，介導(dǎo)了免疫逃逸[7-10]。

目前有研究資料證實，肝癌細(xì)胞能使自身表面抗原修飾和周圍微環(huán)境改變，肝癌組織中PD-1陽性的T淋巴細(xì)胞浸潤也明顯增強。在肝癌組織中，PD-L1可與PD-1結(jié)合，參與肝臟T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受，抑制肝臟組織中細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的功能，逃避機體免疫識別，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞的免疫逃避，從而導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)等。目前PD-1/PD-L1信號通路成為腫瘤免疫研究的熱點之一[9-12]。

近年研究發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1信號通路的異常與腫瘤、自身免疫性疾病以及HIV、HBV和HCV等慢性感染有關(guān)，癌組織高表達(dá)PD-1和PD-L1，造成腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在原發(fā)性肝癌、黑色素瘤、乳腺癌、膠質(zhì)瘤、淋巴瘤、白血病及各種泌尿系腫瘤、消化道腫瘤、生殖系腫瘤等腫瘤組織中已觀察到PD-1和PD-L1的過量表達(dá)[11，13]。但PD-1/PD-L1在肝癌組織中的表達(dá)相關(guān)文獻(xiàn)較少。

NGF在腫瘤中所發(fā)揮的作用及其機制尚不完全明確。有研究認(rèn)為，NGF與腫瘤血管生成關(guān)系密切，NGF可能具有提高血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的功能。NGF通過提高血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)，間接促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進腫瘤血管生成和腫瘤生長。此外，國外研究發(fā)現(xiàn)NGF具有增加腫瘤細(xì)胞肝素酶分泌的作用[12，14]。肝素酶能夠降解硫酸肝素多糖，從而降解基膜，促使細(xì)胞通過基膜，利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移 。因此，NGF可能通過增加腫瘤細(xì)胞肝素酶的分泌而促進腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移[13，15]。

本研究結(jié)果顯示，肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率顯著高于健康人肝臟組織；PD-1 和PD-L1陽性率在高、中和低分化肝癌組織中以中分化肝癌組織陽性率最為明顯，提示肝癌組織中PD-1和PD-L1高表達(dá)可能與PD-1/PD-L1信號通路激活有關(guān)；巴塞羅那分期C期患者PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率最高（P均＜0.05），而A、B和D期患者之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；血清AFP水平≥400 μg/L患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率明顯高于＜400 μg/L歲患者（P＜0.05）。另外，PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率與肝細(xì)胞癌患者的年齡（以50歲為界值）、肝功能Child分級無關(guān)（P均＞0.05）。

本研究提示PD-1和PD-L1在肝癌組織中高表達(dá)，與近年研究結(jié)果一致[10，14-15]。PD-1/PD-L1與肝癌的免疫逃逸有關(guān)，可能與肝癌組織微環(huán)境中PD-1/PD-L1信號通路激活，抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，阻礙其分化為漿細(xì)胞，并誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡，利于肝癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞免疫逃逸。PD-1/ PD-L1陽性率在高、中和低分化肝癌組織中以中分化肝癌組織陽性率最為明顯，機制尚不清楚，但提示中分化肝癌患者是PD-1/PD-L1抗體治療的合適人群[15]。

巴塞羅那分期是一種肝癌臨床分期系統(tǒng)，是目前被認(rèn)為最好的分期系統(tǒng)并在大量的臨床研究中得到證實。本研究提示NGF在肝癌組織中高表達(dá)，NGF陽性率在高、中和低分化肝癌組織中以中分化肝癌組織陽性率最為明顯。NGF與巴塞羅那分期有關(guān)，隨著巴塞羅那分期升高，NGF陽性表達(dá)率也逐級升高，提示NGF與肝癌生長及轉(zhuǎn)移有關(guān)。

綜上，肝癌患者肝癌組織PD-1、PD-L1和NGF陽性表達(dá)率明顯升高，PD-1、PD-L1和NGF在肝癌組織中的表達(dá)可能在肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮一定作用。這些結(jié)論是否可以用于肝癌的診斷、治療和患者疾病進展的判斷，有待于大樣本量研究的進一步探索。

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（2015-12-27 收稿 2016-02-27 修回）

（責(zé)任編委 張玲霞 本文編輯 陳玉琪）

Expressions of programmed death 1, programmed death ligand-1 and nerve growth factor in liver cancer tissues and their significance

YANG Shuo, ZHANG Yun-hui*, SUN Yan-ling, ZHOU Zhi-ping, SHI Ming*
2012 Graduate Squad of Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*Corresponding author, SHI Ming, E-mail: shiming_amms@sina.cn; ZHANG Yun-hui,E-mail: zh_302@163.com

[Abstract]Objective To detect the protein expressions of programmed death 1 (PD-1), programmed death ligand-1 (PD-L1) and nerve growth factor (NGF) in hepatocellular carcinoma (HCC) tissue and investigate their relationships with different pathological classification, clinical liver cancer stages, liver function and AFP level. Methods Immunohistochemistry (IHC) was used to detect the protein expressions of PD-1, PD-L1 and NGF in the paraffin-embedded tissue specimens of 63 HCC patients. Paraffin-embedded liver tissue specimens from 16 healthy donors were used as the controls. The expressions of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissues of different pathological classification, clinical liver cancer stages, liver function and AFP level were compared. Results The positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens were significantly higher than that in the controls (P＜0.05). The positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens with different pathological classification varied, being the highest in moderately differentiated HCC tissues (P＜0.05). The positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens with Barcelona clinical liver cancer stage C increased (P＜0.05). The differences in the positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens with different Child-Pugh grades were not significant. The differences in the positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens were significant between patients with AFP level ≥400 μg/L and those with AFP level ＜400 μg/L, and the rates in the former were significantly higher than those in the latter. There was no significant difference in the positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissue specimens between patients aged over and equal to 50 and those aged less than 50. Conclusions The positive expression rates of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissues increase significantly. The expressions of PD-1, PD-L1 and NGF in HCC tissues may play a role in the occurrence, development and metastasis of HCC.

[Key words]carcinoma, hepatocellular; lymphocyte activation; lymphocytes; evaluation studies

[通訊作者]施明，E-mail：shiming_amms@sina.cn；張云輝，E-mail：zh_302@163.com

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.008

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國圖書資料分類號] R512.62 A

[文章編號]1007-8134(2016)02-0092-05