陳建宏，徐小元

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丙型肝炎直接抗病毒藥物耐藥相關(guān)變異的研究

陳建宏，徐小元

[摘要]直接抗病毒藥物（direct-acting antiviral agents, DAAs）的應(yīng)用使慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C, CHC）抗病毒治療進(jìn)入了新的時(shí)代，全口服的DAAs聯(lián)合治療方案抗病毒活性強(qiáng)、安全性好且不良反應(yīng)少。耐藥相關(guān)變異（resistanceassociated variants, RAV）的出現(xiàn)削弱了DAAs的抗病毒活性，給DAAs的臨床應(yīng)用帶來了巨大的挑戰(zhàn)。本文將對(duì)臨床試驗(yàn)和體外研究中檢測(cè)到的DAAs RAV及其在CHC患者中的自然發(fā)生率進(jìn)行系統(tǒng)的闡述，以期為DAAs治療效果的預(yù)測(cè)和治療方案的選擇提供有用的信息。

[關(guān)鍵詞]丙型肝炎；直接抗病毒藥物；耐藥相關(guān)變異

[作者單位] 100034，北京大學(xué)第一醫(yī)院感染疾病科（陳建宏、徐小元）

HCV感染是一個(gè)世界性的公共衛(wèi)生問題，是導(dǎo)致慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C, CHC）、肝硬化和肝癌發(fā)生的主要原因。全球約有1.7億人感染HCV，基因1型廣泛分布于世界各地，2型和3型主要見于南美洲和亞洲，4～6型較少見[1]。目前我國(guó)HCV感染人數(shù)約為1000萬，以 1b型（66％）和 2a型（14％）最為常見[2]。以往聚乙二醇干擾素α和利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用是被廣泛采用的CHC抗病毒治療的標(biāo)準(zhǔn)方案，但未能取得令人滿意的療效，且相當(dāng)一部分患者因禁忌證無法應(yīng)用或因明顯的不良反應(yīng)被迫停藥[3]。直接抗病毒藥物（direct-acting antiviral agents, DAAs）的臨床應(yīng)用使CHC的治療進(jìn)入了新的時(shí)代，顯著提高了治療效果，減少了治療的禁忌證和不良反應(yīng)，給難治性CHC患者、存在干擾素和利巴韋林治療禁忌證或不能耐受的CHC患者等特殊人群帶來了新的希望[4]。根據(jù)DAAs的作用部位可以將其分為以下幾類：非結(jié)構(gòu)蛋白（non-structural, NS）3/4A 蛋白酶抑制劑、NS5A抑制劑、NS5B聚合酶抑制劑等[5]。

HCV復(fù)制力強(qiáng)，RNA聚合酶保真度低，導(dǎo)致HCV RNA的變異率很高，因此未經(jīng)DAAs治療患者的病毒準(zhǔn)種中也可能存在耐藥相關(guān)變異（resistance-associated variants, RAV）[6]。DAAs RAV的存在可以損害病毒株的適應(yīng)性，導(dǎo)致復(fù)制力降低，所以大部分RAV是以較低的頻率存在于病毒準(zhǔn)種中，直接測(cè)序很少能檢測(cè)到。在DAAs的作用壓力下，這些低頻的耐藥株可以轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢(shì)株，削弱DAAs的抗病毒活性，甚至導(dǎo)致治療失敗[7]。本文對(duì)在臨床試驗(yàn)和體外研究中發(fā)現(xiàn)的基因1型HCV的DAAs RAV及其在國(guó)內(nèi)外不同CHC人群中的自然發(fā)生率進(jìn)行系統(tǒng)的闡述，以期為DAAs在中國(guó)上市后治療效果的預(yù)測(cè)和治療方案的選擇提供有用的信息。

1　臨床試驗(yàn)和體外研究中發(fā)現(xiàn)的DAAsRAV

由于DAAs作用的部位、機(jī)制和濃度不同，HCV基因型或亞型和產(chǎn)生耐藥的基因屏障不同，以及攜帶不同RAV的病毒株的適應(yīng)性不同，針對(duì)不同HCV基因型或亞型和不同DAAs而產(chǎn)生的RAV也各不相同。

1.1NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV NS3/4A蛋白酶抑制劑主要作用于NS3/4A蛋白酶的活性區(qū)域，抑制其對(duì)病毒多聚蛋白NS3-NS5的裂解，從而抑制病毒的復(fù)制和包裝[8]。第一代蛋白酶抑制劑boceprevir（BOC）和telaprevir（TVR）抗病毒活性較弱，基因耐藥屏障低，且須與干擾素和利巴韋林聯(lián)合應(yīng)用，不良反應(yīng)重，有較多的藥物相互作用，現(xiàn)已不被推薦使用，RAV主要涉及氨基酸位點(diǎn)V36、T54、V55、R155和A156（表1），其中V36A/M、T54A/S、V55A、R155K/G/T和A156S/ T/V在臨床試驗(yàn)和體外研究中較常見[8-13]。第二代蛋白酶抑制劑simeprevir（SMV）、asunaprevir （ASV）和paritaprevir （PTV）在抗病毒活性和基因耐藥屏障方面都有了提高，RAV主要涉及氨基酸位點(diǎn)Q80、R155和D168（表1），其中Q80K/ R、R155K和D168A/E/V/Y在臨床試驗(yàn)和體外研究中較常見[12-16]。長(zhǎng)期的隨訪研究顯示NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV在準(zhǔn)種中的持續(xù)時(shí)間較短，停藥后很快轉(zhuǎn)換為野生型，且轉(zhuǎn)換速度因HCV基因型和DAAs RAV的不同而不同。V36M、T54A、A156S、I/V170A和V36M轉(zhuǎn)換速度較快，約為0.9年，而T54S、Q80K、R155K和 V55A轉(zhuǎn)換較慢，約為1.1年，基因1b型發(fā)生轉(zhuǎn)換的速度較1a型快[17]。

1.2NS5A抑制劑RAV 已上市的NS5A抑制劑主要有daclatasvir（DCV）、ledipasvir （LDV）和obmitasvir（OMV）。NS5A蛋白參與HCV生活周期的多個(gè)環(huán)節(jié)，NS5A抑制劑通過與NS5A蛋白結(jié)合從而抑制病毒的復(fù)制、包裝和釋放[8]，抗病毒效果強(qiáng)，但耐藥屏障較低，RAV主要涉及氨基酸位點(diǎn)M/L28、Q/R30、L31、H/P58和Y93（表2），其中M/L28T、Q/R30E/H/R、L31M、H/P58D/S和Y93H/C/N在臨床試驗(yàn)和體外研究中較常見[8，12-13，18-20]。NS5A抑制劑RAV在準(zhǔn)種中持續(xù)的時(shí)間較NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV長(zhǎng)且適應(yīng)性強(qiáng)，在治療結(jié)束3年后仍可以檢測(cè)得到[21]。

1.3NS5B聚合酶抑制劑RAV 已上市的NS5B聚合酶抑制劑主要有核苷類聚合酶抑制劑sofosbuvir（SOF）和非核苷類聚合酶抑制劑dasabuvir（DSV）。SOF是RNA聚合酶天然底物的類似物，可與 NS5B 聚合酶的天然底物競(jìng)爭(zhēng)活性位點(diǎn)而被插入到新合成的RNA鏈中，終止RNA的合成[8]，從而抑制病毒的復(fù)制?？舍槍?duì)多種基因型，耐藥屏障較高，抗病毒活性強(qiáng)且藥物相互作用少。目前只是在體外研究中發(fā)現(xiàn)S282T和L320F對(duì)SOF有耐藥作用，但并未從臨床試驗(yàn)中檢測(cè)到[22]。有研究從基因3型治療失敗的CHC患者體內(nèi)檢測(cè)到L159F和V321A，但體外研究未發(fā)現(xiàn)有耐藥作用[23]。最近有研究從基因1型治療失敗的患者中檢測(cè)到C316H/N/Y等變異位點(diǎn)，但是這些變異是否有耐藥作用還須要進(jìn)一步驗(yàn)證[24]。DSV能共價(jià)結(jié)合于NS5B聚合酶催化部位延伸區(qū)域的變構(gòu)位點(diǎn)，干擾其變構(gòu)激活[8]，使NS5B聚合酶失去催化活性從而抑制病毒的復(fù)制，抗病毒活性較強(qiáng)，但耐藥屏障相對(duì)較低，RAV主要涉及氨基酸位點(diǎn)C316、M414、Y448和S556（表2），其中C316H/Y/N、M414I/ T、Y448H和S556G在臨床試驗(yàn)和體外研究中較常見[12，25-27]。

表1　NS3/4A蛋白酶抑制劑RAVTable 1 Variants resistant to NS3/4A protease inhibitors

2　以往研究中報(bào)道的DAAsRAV的自然發(fā)生率

基線時(shí)DAAs RAV的存在會(huì)影響其治療的效果，由于種族、地域及HCV基因型的不同，DAAs RAV的自然發(fā)生率也有很大的差異。這里我們對(duì)以往研究中直接測(cè)序法檢測(cè)到的基因1型CHC患者中DAAs RAV的自然發(fā)生率[12-13, 25, 28-31]（表3）與我國(guó)1b型CHC患者中DAAs RAV的自然發(fā)生率[32]進(jìn)行了總結(jié)，分析其在國(guó)內(nèi)外CHC患者中的差異。

表2　NS5A抑制劑和NS5B聚合酶抑制劑RAVTable 2 Variants resistant to NS5A inhibitors and NS5B polymerase inhibitors

2.1NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV的自然發(fā)生率 以往研究中基線時(shí)可以檢測(cè)到的NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV主要有V36M、T54A/S、V55A、Q80K/ R、R155K、D168E等（表3），大部分RAV的自然發(fā)生率較低（0％～2％），T54S在1b型CHC患者中較常見，V55A和Q80K/R在1a型CHC患者中較常見。我國(guó)1b型CHC患者中NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV的自然發(fā)生率也大部分處于較低水平（＜1％），第一代NS3/4A蛋白酶抑制劑RAV T54S在我國(guó)1b型CHC患者中的發(fā)生率約為5.5％，但該位點(diǎn)對(duì)二代蛋白酶抑制劑在臨床試驗(yàn)和體外研究中都無耐藥作用[13, 32]；ASV RAV S122G在我國(guó)1b型CHC患者中的發(fā)生率約為56.6％，雖然該變異在體外研究中未見明顯耐藥作用[12, 32]，但由于體內(nèi)外差異，臨床應(yīng)用ASV時(shí)應(yīng)格外注意；對(duì)SMV有明顯耐藥作用的Q80K 在我國(guó)1b型CHC患者中發(fā)生率較低，該變異發(fā)生率因基因型和地域不同而變化較大，美洲人群發(fā)生率較高，歐洲人群發(fā)生率相對(duì)較低[8]；1a型CHC患者發(fā)生率高（4.8％～75.0％），1b型CHC患者發(fā)生率則較低（0.5％～1.2％）[13]。

2.2NS5A抑制劑RAV的自然發(fā)生率 以往研究中基線時(shí)可以檢測(cè)到的NS5A抑制劑RAV主要有M28A/T/V、R30Q、L31M、L31I/F/V、P58S、A92T、Y93H等（表3）。M28A/T/V和A92T在1a型CHC患者中較常見，而R30Q、L31M、P58S 和Y93H在1b型CHC患者中較常見。我國(guó)1b型CHC患者中DCV RAV P58S的發(fā)生率約為2.0％，對(duì)NS5A抑制劑均有耐藥作用的Y93H的發(fā)生率約為10.1％，但未檢測(cè)到DCV RAV L31M的存在[32]。DCV/ASV聯(lián)合治療臨床試驗(yàn)顯示：基線時(shí)存在L31M和Y93H變異的患者對(duì)治療不敏感，持續(xù)病毒應(yīng)答（sustained virological response, SVR）率明顯低于不存在耐藥位點(diǎn)的患者（43％ vs 87％）[33]。并且有研究發(fā)現(xiàn)Y93H變異株的復(fù)制力增強(qiáng)，并與T83M的發(fā)生成明顯的相關(guān)性，推測(cè)T83M可能作為補(bǔ)償變異而增強(qiáng)了Y93H的適應(yīng)性[34]。鑒于LY93H較強(qiáng)的耐藥性和適應(yīng)性，及在1b人群中較高的自然發(fā)生率，有研究建議DCV/ASV聯(lián)合治療前進(jìn)行耐藥檢測(cè)，防止治療的失敗。

2.3NS5B聚合酶抑制劑RAV的自然發(fā)生率S282T僅在體外研究中對(duì)核苷類聚合酶抑制劑SOF有耐藥作用，但是在臨床試驗(yàn)和預(yù)存耐藥的研究中均未發(fā)現(xiàn)該變異。以往研究中基線時(shí)可以檢測(cè)到的非核苷類聚合酶抑制劑DSV RAV主要有C316H/N/Y、A553I/T/V、S556G等（表3）。A553I/ T/V在1a型CHC患者中較常見，C316H/N/Y和S556G在1b型CHC患者中較常見。我國(guó)1b型CHC患者中S556G發(fā)生率較低，而C316N在我國(guó)人群中發(fā)生率卻高達(dá)94％[32]，但由于種族和地域性差異，該變異是否會(huì)對(duì)DSV的臨床應(yīng)用產(chǎn)生影響還有待研究。

表3　以往研究中報(bào)道的DAAs RAV的自然發(fā)生率（％）Table 3 Natural prevalence of variants resistant to DAAs reported in the previous studies(％)

3　小結(jié)

DAAs帶動(dòng)了CHC治療方案的不斷革新，最近在美國(guó)、歐洲和日本批準(zhǔn)的全口服DAAs聯(lián)合治療方案可以將SVR率提高到90％以上，但RAV的出現(xiàn)給DAAs的臨床應(yīng)用帶來了許多挑戰(zhàn)[35]?；€DAAs RAV的存在可以顯著影響基因耐藥屏障相對(duì)較低的NS3/4A蛋白酶抑制劑和NS5A抑制劑的治療效果。雖然直接測(cè)序顯示大部分DAAs RAV的自然發(fā)生率較低，但是深度測(cè)序顯示它們幾乎存在于所有CHC患者的準(zhǔn)種中，為了實(shí)現(xiàn)徹底消滅CHC的最終目標(biāo)，基因耐藥屏障更高和覆蓋基因型更廣的DAAs還有待被研發(fā)。DAAs在一些國(guó)家取得了較好的治療效果，在中國(guó)DAAs還處于臨床試驗(yàn)階段。由于HCV基因型、種族和地域的差異，我國(guó)CHC患者中部分DAAs RAV的自然發(fā)生率相對(duì)較高，其是否會(huì)影響DAAs的治療效果及治療前是否應(yīng)進(jìn)行RAV的檢測(cè)目前仍存在爭(zhēng)議，還有待更多臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)來衡量。

【參考文獻(xiàn)】

[1] Bartenschlager R, Lohmann V, Penin F. The molecular and structural basis of advanced antiviral therapy for hepatitis C virus infection［J］. Nat Rev Microbiol, 2013, 11(7):482-496.

[2] 李杰，陳杰，莊輝. 丙型肝炎的流行病學(xué)［J］. 實(shí)用肝臟病雜志，2012，15(5):379-381.

[3] European Association for Study of Liver. EASL recommendations on treatment of hepatitis C 2015 ［J］. J Hepatol, 2015, 63(1):199-236.

[4] 饒慧英. 慢性丙型肝炎直接作用抗病毒藥物的臨床應(yīng)用［J］.傳染病信息，2015，28(5):266-269.

[5] 李敏然，徐小元. 抗 HCV小分子化合物的研究［J］. 臨床肝膽病雜志，2014，30(6):493-495.

[6] Perales C, Quer J, Gregori J, et al. Resistance of hepatitis C virus to inhibitors: complexity and clinical implications［J］. Viruses, 2015, 7(11):5746-5766.

[7] Kumthip K, Maneekarn N. The role of HCV proteins on treatment outcomes［J］. Virol J, 2015, 12(1):217.

[8] Cento V, Chevaliez S, Perno CF. Resistance to direct-acting antiviral agents: clinical utility and significance［J］. Curr Opin HIV AIDS, 2015, 10(5):381-389.

[9] 張玉，徐小元. 直接抗丙肝病毒藥物耐藥及預(yù)存耐藥的研究［J］. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2015，95(31):2569-2571.

[10] Howe JA, Long J, Black S, et al. Clinical implications of detectable baseline hepatitis C virus-genotype 1 NS3/4A-protease variants on the efficacy of boceprevir combined with peginterferon/ribavirin［J］. Open Forum Infect Dis, 2014, 1(2):ofu078.

[11] Jiang M, Mani N, Lin C, et al. In vitro phenotypic characterization of hepatitis C virus NS3 protease variants observed in clinical studies of telaprevir［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(12):6236-6245.

[12] Lontok E, Harrington P, Howe A, et al. Hepatitis C virus drug resistance-associated substitutions: state of the art summary［J］. Hepatology, 2015, 62(5):1623-1632.

[13] Sarrazin C. The importance of resistance to direct antiviral drugs in HCV infection in clinical practice［J］. J Hepatol, 2016, 64(2):486-504.

[14] Pilot-Matias T, Tripathi R, Cohen D, et al. In vitro and in vivo antiviral activity and resistance profile of the hepatitis C virus NS3/4A protease inhibitor ABT-450［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(2):988-997.

[15] McPhee F, Friborg J, Levine S, et al. Resistance analysis of the hepatitis C virus NS3 protease inhibitor asunaprevir［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2012, 56(7):3670-3681.

[16] Lenz O, Verbinnen T, Lin TI, et al. In vitro resistance profile of the hepatitis C virus NS3/4A protease inhibitor TMC435［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(5):1878-1887.

[17] Howe AY, Long J, Nickle D, et al. Long-term follow-up of patients receiving boceprevir for treatment of chronic hepatitis C［J］. Antiviral Res, 2015, 113:71–78.

[18] Lawitz EJ, Gruener D, Hill JM, et al. A phase 1, randomized, placebo-controlled, 3-day, dose-ranging study of GS-5885, an NS5A inhibitor, in patients with genotype 1 hepatitis C［J］. J Hepatol, 2012, 57(1):24-31.

[19] Nelson DR, Cooper JN, Lalezari JP, et al. All-oral 12-week treatment with daclatasvir plus sofosbuvir in patients with hepatitis C virus genotype 3 infection: ALLY-3 phase III study［J］. Hepatology, 2015, 61(4):1127-1135.

[20] Krishnan P, Beyer J, Mistry N, et al. In vitro and in vivo antiviral activity and resistance profile of ombitasvir, an inhibitor of hepatitis C virus NS5A［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(2):979-987.

[21] Wang C, Sun JH, O’Boyle DR, et al. Persistence of resistant variants in hepatitis C virus-infected patients treated with the NS5A replication complex inhibitor daclatasvir［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2013, 57(5):2054–2065.

[22] Tong X, Le Pogam S, Li L, et al. In vivo emergence of a novel mutant L159F/L320F in the NS5B polymerase confers low-level resistance to the HCV polymerase inhibitors mericitabine and sofosbuvir［J］. J Infect Dis, 2014, 209(5):668-675.

[23] Svarovskaia ES, Dvory-Sobol H, Parkin N, et al. Infrequent development of resistance in genotype 1-6 hepatitis C virusinfected subjects treated with sofosbuvir in phase 2 and 3 clinical trials［J］. Clin Infect Dis, 2014, 59(12):1666-1674.

[24] Donaldson EF, Harrington PR, O’Rear JJ, et al. Clinical evidence and bioinformatics characterization of potential hepatitis C virus resistance pathways for sofosbuvir［J］. Hepatology, 2015, 61(1):56-65.

[25] Poordad F, Hezode C, Trinh R, et al. ABT-450/rombitasvir and dasabuvir with ribavirin for hepatitis C with cirrhosis［J］. N Engl J Med, 2014, 370(21):1973-1982.

[26] Kati W, Koev G, Irvin M, et al. In vitro activity and resistance profile of dasabuvir, a nonnucleoside hepatitis C virus polymerase inhibitor［J］. Antimicrob Agents Chemother, 2015, 59(3):1505-1511.

[27] Poordad F, Hezode C, Trinh R, et al. ABT-450/rombitasvir and dasabuvir with ribavirin for hepatitis C with cirrhosis［J］. N Engl J Med, 2014, 370(21):1973-1982.

[28] Shindo H, Maekawa S, Komase K, et al. Characterization of naturally occurring protease inhibitor-resistance mutations in genotype 1b hepatitis C virus patients［J］. Hepatol Int, 2012, 6(2):482-490.

[29] Dietz J, Susser S, Berkowski C, et al. Consideration of viral resistance for optimization of direct antiviral therapy of hepatitis C virus genotype 1-infected patients［J］. PLoS One, 2015, 10(8):e0134395.

[30] Bartels DJ, Sullivan JC, Zhang EZ, et al. Hepatitis C virus variants with decreased sensitivity to direct-acting antivirals (DAAs) were rarely observed in DAA-naive patients prior to treatment［J］. J Virol, 2013, 87(3):1544-1553.

[31] Aissa Larousse J, Trimoulet P, Recordon Pinson P, et al. Prevalence of hepatitis C virus (HCV) variants resistant to NS5A inhibitors in na ve patients infected with HCV genotype 1 in Tunisia［J］. Virol J, 2015, 12:84.

[32] Wang Y, Rao HY, Xie XW, et al. Direct acting antiviral agents resistance -associated polymorphisms in Chinese treatment-na?ve patients infected with genotype 1b hepatitis C virus［J］. Chin Med J, 2015, 128(19):2625-2631.

[33] Kumada H, Suzuki Y, Ikeda K, et al. Daclatasvir plus asunaprevir for chronic HCV genotype 1b infection［J］. Hepatology, 2014, 59(6):2083–2091.

[34] Peiffer KH, Sommer L, Susser S, et al. Interferon lambda 4 genotypes and resistance-associated variants in patients infected with hepatitis C virus genotypes 1 and 3［J］. Hepatology, 2016, 63(1):63-73.

[35] 張霞霞，徐小元. 小分子化合物抗丙型肝炎治療新方案［J］.傳染病信息，2015，28(4):197-199.

（2016-01-04 收稿 2016-02-18 修回）

（責(zé)任編委 李 軍 本文編輯 盧福昱）

Research of HCV variants resistant to direct-acting antiviral agents

CHEN Jian-hong, XU Xiao-yuan*
Department of Infectious Diseases, Peking University First Hospital, Beijing 100034, China
*Corresponding author, E-mail: xiaoyuanxu6@163.com

[Abstract]The development of direct-acting antiviral agents (DAAs) leads the antiviral therapy of chronic hepatitis C (CHC) into a new era, and all-oral DAA combination regimens have highly antiviral activity with improved drug safety and reduced side effects. The selection of resistance-associated variants attenuates the antiviral activity of DAAs and brings a great challenge to the clinical application of DAAs. This review provides a systematic elaboration of HCV variants resistant to DAAs observed in clinical trials and invitro studies and their natural prevalence in CHC patients, in the hope of providing useful information for predicting therapeutic efficacy and selecting DAA combination regimens.

[Key words]hepatitis C; direct-acting antivirals; resistance-associated variants

[通訊作者]徐小元，E-mail: xiaoyuanxu6@163.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金（81373056）；國(guó)家“十二五”科技重大專項(xiàng)（2012ZX10002003-004-003）

DOI:10.3969/j.issn.1007-8134.2016.02.014

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼][中國(guó)圖書資料分類號(hào)] R512.63；R392.116 A

[文章編號(hào)]1007-8134(2016)02-0116-05