楊曉麗 李月 陳東進(jìn) 史文韜 李建軍

?

結(jié)核分枝桿菌核酸檢測在矽肺結(jié)核患者中的應(yīng)用價(jià)值

楊曉麗 李月 陳東進(jìn) 史文韜 李建軍

目的 評(píng)價(jià)核酸檢測法在矽肺結(jié)核患者中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法 選取2015年1—12月在北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院塵肺與結(jié)核病科住院的165例診斷為矽肺結(jié)核患者作為病例組；以同時(shí)期住院的90例矽肺患者作為對(duì)照組。留取研究對(duì)象痰標(biāo)本用于檢測。分別應(yīng)用痰涂片顯微鏡檢法、固體培養(yǎng)法和核酸檢測法對(duì)研究對(duì)象的痰液標(biāo)本進(jìn)行檢測，并對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 以固體培養(yǎng)檢測結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法檢測病例組的敏感度為94.7%(36/38)，特異度為81.1%(103/127)，陽性預(yù)測值為60.0%(36/60)，陰性預(yù)測值為98.1%(103/105)；以痰涂片法為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法檢測病例組的陽性預(yù)測值為55.0%(33/60)，陰性預(yù)測值為100.0%(105/105)，敏感度為100.0%(33/33)，特異度為79.5%(105/132)。與固體培養(yǎng)法和痰涂片法為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法檢測對(duì)照組的特異度均為96.7%(87/90)。病例組中，核酸檢測法檢測陽性率為36.4%(60/165)，高于固體培養(yǎng)法的23.0%(38/165)和痰涂片法的20.0%(33/165)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.85，P<0.05)；對(duì)照組中，核酸檢測法檢測陽性率為3.3%(3/90)，其他方法檢測陽性率為0.0%。結(jié)論 在矽肺結(jié)核患者中，核酸檢測對(duì)Mtb有較高的敏感度和特異度，對(duì)Mtb快速檢測及輔助診斷具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

矽肺結(jié)核； 分枝桿菌,結(jié)核； 核酸

肺結(jié)核是塵(矽)肺常見的并發(fā)癥，合并肺結(jié)核是矽肺患者的直接死亡原因之一[1-3]。目前，塵(矽)肺合并肺結(jié)核的主要診斷依據(jù)是胸部X線攝片和痰液Mtb的檢查。但由于矽肺患者胸部X線攝片檢查結(jié)果的多變性和不確定性，使痰液Mtb檢查結(jié)果成為矽肺患者M(jìn)tb感染和結(jié)核病復(fù)發(fā)確診的直接病原學(xué)證據(jù)[4]。我國常規(guī)應(yīng)用的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷方法，如涂片顯微鏡檢查，敏感度較低。雖然固體培養(yǎng)具有較高的敏感度，但至少需要3～8周的時(shí)間，耗時(shí)較長[5]?，F(xiàn)有的結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷金標(biāo)準(zhǔn)均不能滿足臨床早期、快速診治的需要，可能延誤診斷和治療。開發(fā)靈敏度高、耗時(shí)短、成本低廉并易普及的檢測方法成為大勢(shì)所趨[6]。Mtb核酸檢測試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法)對(duì)Mtb的檢測在速度上較傳統(tǒng)培養(yǎng)方法具有明顯的優(yōu)勢(shì)。本研究用Mtb核酸檢測試劑盒對(duì)矽肺結(jié)核患者痰液標(biāo)本中的Mtb核酸進(jìn)行檢測，并對(duì)該法的特異度、敏感度及準(zhǔn)確性進(jìn)行評(píng)估。

對(duì)象和方法

1.對(duì)象：選取2015年1—12月在北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院塵肺與結(jié)核病科住院的165例診斷為矽肺結(jié)核患者作為病例組；均為男性，年齡38～90歲。以同時(shí)期住院的90例矽肺患者作為對(duì)照組；均為男性，年齡40～86歲。全部患者的塵肺診斷均依據(jù)文獻(xiàn)[7]確診分期；結(jié)核病的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[8]。留取研究對(duì)象痰標(biāo)本，共255份，均嚴(yán)格按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》操作，對(duì)樣本(痰涂片顯微鏡檢法、固體培養(yǎng)法和核酸檢測法三項(xiàng)檢查樣本均為同一份標(biāo)本)進(jìn)行檢測。

2.試驗(yàn)材料：Mtb核酸檢測試劑盒(恒溫?cái)U(kuò)增-試紙條法；EasyNAT?TB-CPA)，購自杭州優(yōu)思達(dá)生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZBZ/國0528-2014；最低檢出量：102個(gè)菌/ml [國家參考品(S2)]。固體培養(yǎng)的培養(yǎng)管購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為YZB/粵 0116-2013。

3.痰涂片顯微鏡檢查和固體培養(yǎng)檢測：痰涂片顯微鏡檢查采用萋尼染色法，固體培養(yǎng)采用簡單法。

4.核酸檢測：采用Mtb核酸檢測試劑盒，對(duì)臨床采集的痰標(biāo)本進(jìn)行樣本處理及DNA提取、恒溫?cái)U(kuò)增、檢測。首先，標(biāo)本經(jīng)過液化及洗滌后進(jìn)行DNA提取，在含沉淀物的離心管中加入40 μl DNA提取液，震蕩或移液器吹打混勻，沸水浴(95～100 ℃)10 min，冷卻至室溫；以12 000 r/min、離心半徑5.7 cm，離心10 min，吸取上清液作為模板備用。然后，恒溫?cái)U(kuò)增設(shè)置陽性及陰性對(duì)照。管中加入15 μl復(fù)溶緩沖液，再滴加20 μl石蠟油，室溫靜置2～3 min，使玻璃化試劑充分溶解。取1管反應(yīng)液加入4 μl ddH2O混勻，作為陰性對(duì)照。在其他反應(yīng)液中加入DNA模板或直接吸取陽性對(duì)照4 μl，用移液器吹打均勻后蓋緊。將反應(yīng)管以4100 r/min，離心半徑5.7 cm，瞬時(shí)離心3～5 s。再將反應(yīng)管置恒溫金屬浴上，63 ℃溫浴60 min。將上述擴(kuò)增后的反應(yīng)管放入核酸檢測裝置內(nèi)芯中，合上核酸檢測裝置內(nèi)芯后將其裝入裝置外盒并關(guān)閉。計(jì)時(shí)15～30 min進(jìn)行結(jié)果判讀。

根據(jù)試紙上質(zhì)量控制線(C線)和檢測線(T線)的出現(xiàn)與否判讀檢測結(jié)果，即：T線出現(xiàn)代表檢測到Mtb的DNA；T線未出現(xiàn)而C線出現(xiàn)，代表未檢測到Mtb的DNA；T線和C線均未出現(xiàn)，代表檢測失效，需要重復(fù)檢測。試劑盒包括內(nèi)參系統(tǒng)，用以檢測擴(kuò)增試劑失效、儀器故障、樣品中是否含有擴(kuò)增抑制物。外部控制用于檢測擴(kuò)增試劑和一次性核酸檢測裝置故障及檢測擴(kuò)增試劑或環(huán)境是否被污染。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用 SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以固體培養(yǎng)及痰涂片法為標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)核酸檢測法進(jìn)行敏感度、特異度及陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分析；應(yīng)用χ2檢驗(yàn)對(duì)痰涂片法、固體培養(yǎng)法、核酸檢測法在矽肺結(jié)核患者中檢測效果進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.核酸檢測法與固體培養(yǎng)法比較：以固體培養(yǎng)法作為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法檢測病例組的敏感度為94.7%(36/38)；特異度為81.1%(103/127)；陽性預(yù)測值為 60.0%(36/60)，陰性預(yù)測值為98.1%(103/105)。兩種方法的一致率為84.2%(139/165)，其中有2例患者固體培養(yǎng)與核酸檢測的陽性結(jié)果不一致，見表1。對(duì)照組中，核酸檢測法檢測3例陽性，固體培養(yǎng)法未檢測到陽性病例，核酸檢測法的特異度為96.7%(87/90)

表1 核酸檢測法與固體培養(yǎng)法和痰涂片法檢測165例矽肺結(jié)核患者結(jié)果的對(duì)比

2．核酸檢測法與痰涂片法比較：以痰涂片法為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法檢測病例組的敏感度為100.0%(33/33)；特異度為79.5%(105/132)；陽性預(yù)測值為55.0%(33/60)；陰性預(yù)測值為100.0%(105/105)，見表1。對(duì)照組中，核酸檢測法檢測到3例陽性，固體培養(yǎng)法未檢測到陽性病例，核酸檢測法的特異度為96.7%(87/90)。

3.檢測效果比較：病例組中，核酸檢測法檢測陽性率為36.4%(60/165)，固體培養(yǎng)法檢測陽性率為23.0%(38/165)，痰涂片法檢測陽性率為20.0%(33/165)，核酸檢測法檢測陽性率高于其他檢測方法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.85，P<0.05)；對(duì)照組中，核酸檢測法檢測陽性率為3.3%(3/90)，其他方法檢測陽性率為0.0%。

討 論

矽肺結(jié)核患者通常占矽肺患者的5%～35%[9]。矽肺結(jié)核患者痰中變異的L型 Mtb、抗酸染色呈陰性及肺部嚴(yán)重纖維化、支氣管扭曲變形致痰液引流不暢均可造成結(jié)核病的漏檢及誤診[10]。本研究核酸檢測的靶基因?yàn)镸tb復(fù)合群特異性IS6110插入序列，其為國際公認(rèn)的Mtb復(fù)合群的特征序列，僅存在于Mtb復(fù)合群基因組中。核酸檢測與傳統(tǒng)培養(yǎng)法比較，時(shí)間縮短，特異性好，并且設(shè)有內(nèi)參系統(tǒng)可以監(jiān)控假陰性，避免試劑及環(huán)境被污染。

本研究顯示，與傳統(tǒng)的痰涂片、固體培養(yǎng)比較，核酸檢測陽性率增高。以固體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法的靈敏度為94.7%，特異度為81.1%，陽性預(yù)測值為60.0%，陰性預(yù)測值為98.1%，總一致性為84.2%。以痰涂片法為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測法的敏感度為100.0%，特異度為79.5%，陽性預(yù)測值為55.0%，陰性預(yù)測值為100.0%。而馮慶芳等[11]發(fā)現(xiàn)，Mtb熒光定量PCR法與分離培養(yǎng)法的陽性一致性為100.00%，陰性一致性為98.61%，總一致性為99.01%，高于本研究結(jié)果。究其原因，考慮與實(shí)驗(yàn)方法自身局限性有關(guān)，也不排除與研究對(duì)象自身因素不同有關(guān)。矽肺患者由于自身抵抗力和防御機(jī)能的下降，加之二氧化硅對(duì)Mtb活力和毒性的增強(qiáng)作用；同時(shí)，肺組織的缺血和缺氧等因素有利于Mtb的生長，其肺內(nèi)長期生存的Mtb可產(chǎn)生適應(yīng)性改變，在形態(tài)、毒力、抗原性及藥物敏感性方面發(fā)生變異[12]。

結(jié)果顯示，在涂陰患者中有部分患者核酸檢測陽性，這部分肺結(jié)核患者就可能漏診，而此時(shí)核酸檢測對(duì)于患者的早期輔助診斷、治療進(jìn)行了補(bǔ)充。菌陰肺結(jié)核占全部肺結(jié)核的40%～60%。菌陰肺結(jié)核患者如果不給予治療，將有近1/2的患者發(fā)展為涂陽，成為新的傳染源[13]。結(jié)核病的早期診斷及其耐藥性的檢測，對(duì)于很好地控制耐藥結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義[14]。而單純矽肺患者中以固體培養(yǎng)及痰涂片法為標(biāo)準(zhǔn)，核酸檢測的特異度均為96.7%，在痰涂片、固體培養(yǎng)檢測為陰性的患者中仍有患者核酸檢測陽性，且對(duì)這些患者進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)均為陽性，充分印證了在矽肺結(jié)核的輔助診斷中核酸檢測的特異度較高。值得注意的是，由于筆者所在科室目前尚不能進(jìn)行菌種鑒定，故本研究中不排除有非結(jié)核分枝桿菌感染患者的可能。

總之，核酸檢測是一種速度快、敏感度高、特異度高的Mtb感染的輔助診斷方法，在矽肺結(jié)核患者中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，可以降低漏診率，使患者盡早進(jìn)行有效的抗結(jié)核藥物治療，改善患者生存質(zhì)量，減少矽肺與結(jié)核病的協(xié)同作用，最終降低患者死亡率。同時(shí)，核酸檢測存在一定局限性，不能判斷患者標(biāo)本中是否為活菌。而且，本法為定性檢測，不能反應(yīng)樣本中Mtb的具體水平。

[1] 劉移民．職業(yè)病防治理論與實(shí)踐．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:11-13．

[2] Nasrullah M，Mazurek JM，Wood JM，et al．Silicosis mortality with respiratory tuberculosis in the United States，1968—2006．Am J Epidemiol， 2011，174(7):839-848．

[3] Chaudhury N，Paliwal R，Phatak A，et al．Co-morbidities among silicotics at Shakarpur: a follow up study．Lung India， 2012，29(1):6-10．

[4] 丁麗，王偉，許雪春，等. 矽肺患者結(jié)核分枝桿菌臨床分離培養(yǎng)與抗結(jié)核藥物敏感檢測. 中國職業(yè)醫(yī)學(xué),2015，42(1):46-48.

[5] 趙雁林，尚美．我國結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的現(xiàn)狀．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2007,30(7)：725-728．

[6] 梁建琴，高華方，李洪敏，等．PCR-熒光探針法檢測臨床痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌的可靠性研究.中國防癆雜志，2012,34(5)：271-274.

[7] 余晨，齊放，李霖，等.塵肺診斷中讀片差異的分析.中華勞動(dòng)衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2004,22(5):336-339.

[8] 中國疾病預(yù)防控制中心結(jié)核病預(yù)防控制中心.肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)(WS288-2008).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：2-3.

[9] 嚴(yán)碧涯．結(jié)核病學(xué)．北京:北京出版社，2003:957-964．

[10] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)．臨床診療指南:結(jié)核病分冊(cè)．北京:人民衛(wèi)生出版社，2004:52．

[11] 馮慶芳，何小寧，王小婷，等.新型結(jié)核分枝桿菌核酸檢測試劑盒的臨床應(yīng)用初步評(píng)價(jià). 國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2013，34(19):2601-2602.

[12] 何國鈞，肖和平，唐神結(jié)．結(jié)核分枝桿菌休眠菌、L型及治療．中華結(jié)核和呼吸雜志，2002，25(10):585-587．

[13] Dutt AK, Stead WW. Smear-negative pulmonary tuberculosis. Semin Respir Infect, 1994, 9(2): 113-119.

[14] 張治國，歐喜超，孫倩，等．利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增技術(shù)檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的研究．中國防癆雜志，2013，35(1):13-16．

(本文編輯：李敬文)

Application ofMycobacteriumtuberculosisnucleic acid detection in silicotuberculosis patients

YANGXiao-li,LIYue,CHENDong-jin,SHIWen-tao,LIJian-jun.

DepartmentofPneumoconiosisTuberculosis,GeneralHospitalofJingmeiGroup,Beijing102308,China

CHENDong-jin,Email:chendj0317@sohu.com

Objective To evaluate the clinical application of nucleic acid detection in silicotuberculosis patients. Methods 165 patients, who were diagnosed as silicosis tuberculosis in the department of Pneumoconiosis Tuberculosis, General Hospital of Jingmei Group between January to December in 2015, were selected as case group. 90 silicosis patients detected in the same period of time were selected as control group. Sputum smear microscopy, solid culture method and nucleic acid detection method were used to detect Mycobacterium in patient sputum samples and the results were compared. Results Using the results of solid culture test as golden standard, the sensitivity of nucleic acid detection was 94.7% (36/38); specificity was 81.1% (103/127); positive predictive value was 60.0% (36/60) and negative predictive value was 98.1% (103/105) in the case group. With sputum smear method as standard, the nucleic acid detection got the results of positive predictive value: 55.0% (33/60), negative predictive value: 100% (105/105), sensitivity: 100% (33/33) and specificity: 79.5% (105/132). Combining solid culture method and sputum smear method as standard, the specificity of nucleic acid detection in the control group was 96.7% (87/90). In the case group, the positive rate of nucleic acid detection method was 36.4% (60/165), which was significantly (χ2=12.85,P<0.05) higher than solid culture method of 23.0%(38/165)and sputum smear method of 20.0% (33/165). In the control group, the positive rate of nucleic acid detection method was 3.3% (3/90), compared with the other methods with positive rates of 0. Conclusion In patients with tuberculosilicosis, nucleic acid detection has high sensitivity and specificity to Mtb. It is a valuable method in clinical Mtb rapid detection and assist diagnosis.

Silicotuberculosis；Mycobacteriumtuberculosis； Nucleic acids

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.03.009

102308 北京京煤集團(tuán)總醫(yī)院塵肺與結(jié)核病科

陳東進(jìn)，Email：chendj0317@sohu.com

2015-01-21)