王　新，周　昱，廉奇鑫

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江佳木斯154003)

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乳腺癌生發(fā)過程中WWOX和Caspase－9的表達①

王新，周昱，廉奇鑫

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江佳木斯154003)

摘要:目的: WWOX、Caspase－9兩因子通過檢測是否在人體乳腺癌組織有表達，并分析WWOX、Caspase－9在乳腺癌組織中的表達特點，研究兩者關系。方法:在乳腺正常組織、乳腺癌組織中應用Elivision法測50例正常乳腺組織、乳腺癌組織中，同時整理患者的病理資料進行統計學。結果:在原位癌以及正常乳腺組織、浸潤癌組織中的陽性表達率分別是40.00% (18/45) ;53.85%(7/13)，76.92%(10/13)，66.67% (8/12)，58.33% (7/12)，75.56% (34/45)。且WWOX、Caspase－9每組兩兩相互比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論:①WWOX在乳腺癌組織中呈高表達，Caspase－9在乳腺癌中呈低表達。②WWOX、Csapase－9可能與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預后有關。

關鍵詞:乳腺癌; WWOX、Caspase－9;免疫組織化學Elivision法

在惡性腫瘤中乳腺癌現今已經成為女性最常見的惡性腫瘤之一［1］，我國女性乳腺癌在我國所有惡性腫瘤中比例為7%～10%并且呈上升狀態(tài)。無論在國內外乳腺癌都是女性常見的惡性腫瘤之一，世界衛(wèi)生組織(WHO)統計，全球每年有至少120萬女性診斷為乳腺癌，50萬人死于本病。在發(fā)達國家有報道顯示乳腺癌是女性惡性腫瘤中的第1位，比例約為32%［2］。

WWOX (ww domain contaming oxidoreductase)因子是近些年新發(fā)現的新抑癌基因［3］，它是在人類染色體16q23.3－q24.1中發(fā)現的，它含有414個氨基酸。WWOX因子內含有一個特殊的氧化還原酶它其中的短鏈(short－ehaindehydrogenase reauetasedomainSRD)，國內外學著研究表明WWOX可與ER、雌二醇相結合［3］，并作用于這兩個因子上。

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶－9(Caspase －9)、在人體染色體1號染色體短臂中(p36.3p 36.1)發(fā)現該因子，Caspase－9它的結構非常特殊常以無活性酶原結構存在，至今為止只發(fā)現Caspase－9含有N末端的原域、大亞單位的20KD和小亞的10KD單位。而該區(qū)域中又包含了死亡效應區(qū)域DED和Caspase聚集區(qū)域CARD，且DED和CARD屬于死亡域超家族。本實驗應用研究Elivision法檢驗WWOX、Caspase－9兩因子分別在50例乳腺癌、50例癌旁正常組織中的表達情況，并探索WWOX、Caspase－9兩因子在乳腺中是否有關系及可能存在的臨床意義。

1　資料與方法

1.1標本來源

在佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科選取2014 －01～2015－05進行手術患者，并籌集術中切除的乳腺標本，通過病理科知深大夫給予冰凍切除術及術后免疫組化結果選定正常乳腺組織及正常良性組織13例、原位癌12例以及浸潤癌45例共計70例均為女性，年齡25～66歲。并查詢病理編號，在借用病理科存檔蠟塊，選取術前術后均未放療以及化療內分泌治療靶向治療等。

1.2主要試劑

從北京博奧森生物有限公司購買WWOX兔抗單克隆抗體以及Caspase－9兔抗單克隆抗體，通用Elivision法試劑盒以及DAB顯色試劑都是從北京中衫金橋生物技術有限公司買入。

1.3免疫組化

通過(Elivision法)研究乳腺癌及正常組織中WWOX、Caspase－9是否有表達。

1.4結果判定

WWOX主要以細胞核表達，其表達陽性為內出現黃色或棕褐色顆粒、而Caspase－9在細胞漿內表達，其陽性為出現黃色或棕褐色顆粒。應用雙盲法觀察所有切片并計數，著色強度明顯強于背景處計數。每張病理切片至少在高倍鏡下(×200)觀察不重復的視野10個，以每視野中有100細胞計算其中陽性細胞數。Elivision法結果根據陽性細胞所占百分比和染色強度分別計分，前者計分按0分為≤0% ～10%，1分為10%～25%，2分為26%～50%，3分為為51%～75%，4分為75%～100%。后者計分按0分為無色，1分為淡黃色，2分為黃色，3分為黃褐色，兩者乘積: (－)為0～3分，(+ )為4～6分，()為7～9分，()為10～12分，其中“–”示為陰性表達，“+”以上示為陽性表達。

1.5統計學方法

采用SPSS19.0統計軟件包進行數據分析，采用均數±標準差(±s)的方式對計量數據資料進行表示，采用t進行檢驗，蛋白表達的陽性表達等計數數據資料以率來表示，采用χ2檢驗或Fish檢驗，WWOX、Caspase－9蛋白表達的相關性分析采用Spearman等級相關性分析，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2　結果

2.1 WWOX在正常乳腺組織、乳腺癌組織中的表達

正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中WWOX、Caspase－9蛋白表達水平，見表1～2。

表1　三組間WWOX表達水平

表2　三組間Caspase－9表達水平

WWOX蛋白在13例正常乳腺組織中陽性表達為10例，陽性表達率為76.92%;在12例乳腺原位癌中陽性表達為8例，陽性表達率為66.67%;在45例乳腺浸潤癌中陽性表達為18例，陽性表達率為40.00%。Caspase－9蛋白在13例正常乳腺組織中陽性表達為7例，陽性表達率為53.85%;在12例乳腺原位癌中陽性表達為7例，陽性表達率為58.33%;在45例乳腺浸潤癌中陽性表達為34例，陽性表達率為75.56%。通過秩和檢驗我們可看出(表1，2) WWOX和Caspase－9分別在正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中兩兩比較，具有統計學意義(P＜0.05)。

2.2浸潤癌中WWOX與Caspase－9蛋白表達水平見表3～4。

表3　浸潤癌中WWOX表達水平

表4　浸潤癌Caspase－9表達水平

WWOX蛋白在16例浸潤癌I期乳腺組織中陽性表達為10例，陽性表達率為62.50%;在14例浸潤癌II期乳腺組織中陽性表達為5例，陽性表達率為35.71%;在15例浸潤癌III期乳腺組織中陽性表達為3例，陽性表達率為20.00%。Caspase－9蛋白在16例浸潤癌I期乳腺組織中陽性表達為9例，陽性表達率為56.25%;在14例浸潤癌II期乳腺組織中陽性表達為11例，陽性表達率為78.57%;在15例浸潤癌III期乳腺組織中陽性表達為14例，陽性表達率為93.33%。通過秩和檢驗我們可看出(表3，4) WWOX和Caspase－9分別在浸潤癌I期、潤癌II期、浸潤癌III期中兩兩比較，具有統計學意義(P＜0.05)。

2.3乳腺癌生發(fā)過程中WWOX與Caspase－9蛋

白的相關性

①正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中WWOX與Caspase－9的相關性:在36例WWOX陽性表達的乳腺組織中Caspase－9陽性表達的例數為16例，在24例Caspase－9陰性表達的的乳腺組織中WWOX陰性表達的例數為4例，且兩組數據差異比較具有統計學意義(χ2= 5，P＜0.05)，用統計學方法Spearman分析，結果為二者在正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌組織中表達呈負相關(rs=－0.336，P＜0.05)，提示二者在乳腺癌生發(fā)過程中起到了負相關作用，見表5。

表5　正常乳腺組織、原位癌、浸潤癌中WWOX與Caspase－9的相關性

②乳腺癌中WWOX與Caspase－9的相關性: 在26例WWOX陽性表達的乳腺癌組織中Caspase －9陽性表達的例數為14例，在16例Caspase－9陰性表達的的乳腺癌組織中WWOX陰性表達的例數為4例，且兩組數據差異比較具有統計學意義(χ2= 5.77，P＜0.05)，用統計學方法Spearman分析，結果為二者在乳腺癌組織中表達呈負相關(rs=－0.369，P = 0.005)，提示二者在乳腺癌中起到了負相關作用，并且隨著病情加重負相關性加大，見表6。

表6　原位癌、浸潤癌中WWOX與Caspase－9的相關性

3討論

乳腺癌的發(fā)生與致癌基因的激活、抑癌基因的失活或缺失有密切關系。2000年Bednarek等人鑒定出的新基因WWOX可與多種腫瘤的發(fā)生有一定

關聯，如在食管癌，胃癌，肺癌，乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌等惡性腫瘤中都出現不同程度的WWOX基因外顯子丟失、雜合性缺失及的表達降低等異常表達［5］。前人對WWOX、Caspase－9在各種惡性腫瘤的表達已經進行了初步研究，并且在乳腺癌中也有研究，有過相同的觀點。WWOX在浸潤癌中的陽性表達明顯低于乳腺原位癌組織，兩者比較(P＜0.05)差異均有統計學意義。Caspase－9在浸潤癌中的陽性表達明顯高于乳腺原位癌組織。根據本實驗的WWOX和Caspase－9在乳腺癌組織中陽性表達數據，WWOX、Caspase－9同時陽性表達的例數為14例，WWOX、Caspase－9同時陰性表達的例數為4例，且兩組數據差異比較具有統計學意義(χ2= 5.77，P＜0.05)，用統計學方法Spearman分析，結果為二者在乳腺癌組織中表達呈負相關(rs=－0.369，P＜0.05)。本實驗希望通過WWOX、Caspase－9在乳腺癌生發(fā)過程中的表達以及在病理、臨床分其中數據與結果，能為檢測乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、治療等方面提供新的依據，為治療提供新思路。

參考文獻:

［1］王新，范立君，李壯，等.GRP78、GRP94在乳腺癌中的表達及其意義［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(6) : 89－91

［2］王博，王宇，李壯.雙側乳腺癌24例診治分析［J］.黑龍江醫(yī)藥科學，2004，27(2) : 21

［3］Guler G，Uner A，Guler N，et al.The fragile genes FHIT and WWOX are inactivated coordinately in invasive breast carcinoma［J］.Cancer，2004，100(8) : 1605－1614

［4］Ried K，Finnis M，Hobson L，et al.Common chromosomal fragile site FRA16D sequence: Identification of the FOR gene spanning FRA16D and homozygous deletions and translocation breakpoints in cancer cells［J］.Hum Mol Genet，2010，9: 1651－1663

［5］Chang NS，Doherty J，Ensign A，et al.WOX1 is essential for tumor necrosis factor，UV light，staurosporine，and p53－mediated cell death，and its tyrosine 33－phosphorylated form binds and stabilizes serine 462 phosphorylated p53［J］.Biol Chem，2005，280(52) : 43－100，108

(收稿日期:2015－12－07)

通訊作者:周昱(1969～)男，黑龍江集賢人，學士，副主任醫(yī)師，碩士研究生導師。E－mail: zhouyu731@126.com。

作者簡介:王新(1962～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師。

基金項目:①黑龍江省衛(wèi)生廳科研項目，編號: 2013244。

中圖分類號:R737.9

文獻標識碼:B

文章編號:1008－0104(2016) 02－0016－02