董洪亮，劉乃國，苗雙，鄭靜，倪娜，王楠

(1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256600；2濱州醫(yī)學院)

1,25-(OH)2D3對大鼠特發(fā)性肺纖維化的影響及機制

董洪亮1，劉乃國1，苗雙2，鄭靜1，倪娜1，王楠1

(1濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院，山東濱州256600；2濱州醫(yī)學院)

目的 觀察1,25-(OH)2D3對大鼠特發(fā)性肺纖維化(IPF)發(fā)生、發(fā)展的影響，探討其作用機制。方法 90只雄性SD大鼠隨機分為模型組、治療組和對照組，每組30只。模型組和治療組經(jīng)氣管內(nèi)注射博來霉素5 mg/kg建立IPF模型，對照組注射生理鹽水200 μL/只。自注射后第2天開始，模型組腹腔注射1,25-(OH)2D3溶劑(0.1%乙醇、99.9%丙二醇，200 μL/只)，治療組腹腔注射1,25-(OH)2D32 μg/kg，對照組腹腔注射生理鹽水200 μL/只，均隔天1次。各組于給藥后第14、21、28天分別處死10只大鼠，檢測肺組織羥脯氨酸含量；分離培養(yǎng)肺成纖維細胞，采用Fluo-3AM熒光負載，激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)Ca2+濃度；采用Real-time PCR法檢測肺成纖維細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表達。結(jié)果 給藥第14、21、28天，模型組肺組織羥脯氨酸含量、肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度及PI3K、AKT、mTOR mRNA表達均高于對照組，治療組上述指標在各時間點均低于模型組，組間比較P<0.05或<0.01。模型組和治療組肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度與PI3K、AKT、mTOR mRNA表達均呈正相關(guān)(r分別為0.784、0.647、0.805，P均<0.01)。結(jié)論 1,25-(OH)2D3可抑制IPF的發(fā)生、發(fā)展；降低肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度、抑制PI3K-AKT-mTOR通路可能是其作用機制。

特發(fā)性肺纖維化；1,25-(OH)2D3；鈣離子；PI3K-AKT-mTOR信號通路；肺成纖維細胞

特發(fā)性肺纖維化(IPF)是由多種原因引起的病因尚不明確的致死性疾病，目前缺乏有效的治療手段[1～3]。成纖維細胞異常增殖在IPF發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，1,25-(OH)2D3能夠抑制TGF-β1刺激的肺成纖維細胞和上皮細胞發(fā)生纖維化[6]；可改善博來霉素所致的小鼠肺纖維化[7]；提示1,25-(OH)2D3可能對IPF具有潛在的治療作用。PI3K-AKT-mTOR信號通路作為細胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導途徑，具有調(diào)節(jié)細胞生長、增殖、蛋白合成及轉(zhuǎn)錄等重要生理作用[8]，可能參與IPF的發(fā)生[9]。細胞外Ca2+內(nèi)流和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放均可激活PI3K-AKT-mTOR通路[10]。2015年5～6月，本研究觀察了1,25-(OH)2D3對IPF大鼠不變通路的影響，現(xiàn)分析結(jié)果，探討其對IPF的治療作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料 90只6～8周齡SPF級雄性SD大鼠，購自魯抗醫(yī)藥實驗中心(許可證號：SCXK魯2013000)。博來霉素購自日本化學株式會社(15 mg/支，批號：030201)，1,25-(OH)2D3購自Sigma公司(lot#074M4028V，≥99%)。HiFiScript Qμick gDNA Removal cDNA Kit、Maxima SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix購自康為世紀有限公司。Fluo-3AM-DMSO購自北京索萊寶科技有限公司。羥脯氨酸檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所。根據(jù)大鼠PI3K、AKT、mTOR的基因序列，應(yīng)用Primer(version5.0)軟件設(shè)計特異性引物，并由上海生工技術(shù)有限公司合成。內(nèi)參基因 GAPDH引物由上海生工技術(shù)有限公司提供。引物序列見表1。

表1 PI3K、AKT、mTOR基因引物序列

1.2 模型制作及處理 90只SD大鼠隨機分為模型組、治療組、對照組，每組30只。三組均腹腔注射4%水合氯醛(200～300 μL/只)麻醉，模型組、治療組采用單次氣管內(nèi)注射博來霉素5.0 mg/kg建立肺纖維化模型[11]，對照組氣管內(nèi)注射生理鹽水200 μL/只。自注射后第2天起，模型組腹腔注射1,25-(OH)2D3溶劑(0.1%乙醇、99.9%丙二醇)200 μL/只，隔天1次；治療組腹腔注射1,25-(OH)2D3(溶于0.1%乙醇、99.9%丙二醇)2 μg/kg[12]，隔天1次；對照組腹腔注射生理鹽水200 μL/只，隔天1次。各組于給藥第14、21、28 天分別處死10只大鼠，取肺組織進行后續(xù)觀察。

1.3 肺組織水解液羥脯氨酸含量檢測 精確稱取各組各時間點肺組織30 mg放入試管中，參照試劑盒說明書步驟制備組織水解液。取組織水解液在波長550 nm處檢測吸光度值(A值)，計算羥脯氨酸含量。羥脯氨酸(μg/mg)=(測定管A值-空白管A值)/(標準管A值-空白管A值)×標準管含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/組織濕重(mg)。

1.4 肺成纖維細胞分離及細胞內(nèi)Ca2+濃度檢測 取各組肺組織，剪成1 mm3大小組織塊，放入培養(yǎng)皿，組織塊之間距離約為1 cm，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液1 mL培養(yǎng)12 h，再加入2 mL培養(yǎng)液培養(yǎng)60 h，取出組織塊，去除未貼壁細胞，更換4～5 mL培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，光鏡下觀察細胞形態(tài)均為梭形或多角形，表明分離到的細胞為成纖維細胞。繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用0.25%胰蛋白酶消化后轉(zhuǎn)入激光共聚焦培養(yǎng)皿培養(yǎng)6～8 h，加入終濃度為5 μmol/L的Fluo-3AM-DMSO，混勻，37 ℃避光孵育30 min；D-hanks緩沖液洗3遍，加入600 μL D-hanks緩沖液。采用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內(nèi)Ca2+熒光吸光度。Fluo-3AM的激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為488 nm 和526 nm。利用圖像處理軟件計算各組細胞平均熒光強度。

1.5 肺成纖維細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表達 采用Real-time PCR法。采用TRIzol法提取各組肺成纖維細胞總RNA，分光光度計測定RNA濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。用HiFiScript Qμick gDNA Removal cDNA Kit進行反轉(zhuǎn)錄。合成的cDNA保存于-80 ℃冰箱以備用。以GADPH作為內(nèi)參基因，采用Real-time PCR法對各組肺成纖維細胞內(nèi)PI3K、AKT、mTOR基因表達進行相對定量(對照組表達量設(shè)為1)檢測。反應(yīng)體系：2×Maxima SYBR Green Mix 12.5 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，模板1 μL，RNase-free Water補足至25 μL。擴增反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃變性15 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，35個循環(huán)。所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCT法進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 各組不同時間肺組織羥脯氨酸含量比較 給藥第14、21、28天，模型組和治療組肺組織羥脯氨酸含量均高于對照組(P<0.05或<0.01)，治療組均低于模型組(P<0.05或<0.01)。見表 2。

表2 三組給藥第14、21、28天肺組織羥脯氨酸含量比較

注：與對照組同時間點比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組同時間點比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.2 各組不同時間肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度比較 給藥第14、21、28 天，模型組和治療組肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+熒光強度均高于相應(yīng)時間點的對照組，且治療組均低于模型組，組間比較P<0.05或<0.01。三組Ca2+熒光強度均隨給藥時間增加逐漸增高(P均<0.05)。見表3。

表3 三組給藥第14、21、28天肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+熒光強度比較

注：與對照組同時間點比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組同時間點比較，cP<0.05，dP<0.01；同組各時間點比較，P均<0.05。

2.3 肺成纖維細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA表達比較 給藥第14、21、28天，模型組肺成纖維細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量均高于對照組(P<0.05或<0.01)；在給藥第21、28天時，治療組肺成纖維細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量均高于對照組(P均<0.01)；治療組各時間點三種基因mRNA相對表達量均低于模型組(P<0.05或<0.01)。見表4。

表4 三組給藥第14、21、28天肺成纖維細胞PI3K、AKT、mTOR mRNA相對表達量比較

注：與對照組同時間點比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組同時間點比較，cP<0.05，dP<0.01。

2.4 肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度與PI3K、AKT、mTOR mRNA表達的相關(guān)性 模型組和治療組肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度與PI3K、AKT、mTOR mRNA表達均呈正相關(guān)(r分別為0.784、0.647、0.805，P均<0.01)。

3 討論

IPF是以彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂為特征， 最終導致肺間質(zhì)纖維化的慢性進行性疾病。目前其發(fā)病機制仍不清楚，尚缺乏有效的治療措施和治療藥物。氣管內(nèi)注射博來霉素是建立肺纖維化模型的常用方法，羥脯氨酸含量是反映IPF程度的金標準。本研究模型組各時間點肺組織羥脯氨酸含量均明顯高于對照組，且隨建模時間延長其含量逐漸增高；治療組各時間點肺組織羥脯氨酸含量均明顯低于模型組。上述結(jié)果提示，本研究成功建立了大鼠IPF模型，1,25-(OH)2D3對大鼠IPF的發(fā)生、發(fā)展有明顯的抑制作用。

Ca2+作為重要的第二信使參與調(diào)節(jié)細胞的生理活動，如細胞的生長分化、增殖與凋亡等[13,14]。細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)一旦被破壞會引發(fā)一系列病理改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠IPF發(fā)生過程中，模型組肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯高于對照組，且隨藥物作用時間延長逐漸增高；說明IPF發(fā)生過程中，肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+調(diào)控系統(tǒng)出現(xiàn)異常，導致細胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸增高。治療組肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯低于模型組、明顯高于對照組；說明1,25-(OH)2D3對肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度升高有抑制作用，但不足以將Ca2+濃度降低到正常水平，提示1,25-(OH)2D3具有一定的穩(wěn)定Ca2+穩(wěn)態(tài)的作用。

PI3K是磷脂激酶家族中的重要一員，其活化產(chǎn)物PI3K作為第二信使能夠與AKT蛋白的PH結(jié)構(gòu)域作用，激活A(yù)KT蛋白，使活化的AKT從胞膜釋放，轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)中或胞核內(nèi)，進一步磷酸化mTOR的Ser2448位點，激活mTOR，促進與細胞生長、分化相關(guān)蛋白的表達[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在IPF發(fā)生過程中，模型組肺成纖維細胞內(nèi)PI3K、AKT、mTOR mRNA表達水平明顯高于對照組，提示PI3K-AKT-mTOR信號通路與IPF發(fā)生相關(guān)。治療組肺成纖維細胞中上述三種基因的mRNA表達量在給藥21、28天時明顯高于對照組，且在三個不同時間點均明顯低于模型組；說明1,25-(OH)2D3在IPF發(fā)生、發(fā)展過程可抑制PI3K-AKT-mTOR信號通路。相關(guān)性分析結(jié)果表明，模型組和治療組中肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度與PI3K、AKT、mTOR三種基因的mRNA表達之間均存在顯著正相關(guān)，說明在IPF發(fā)生過程和1,25-(OH)2D3治療過程中Ca2+與PI3K-AKT-mTOR信號通路之間均具有一定的聯(lián)系。

綜上所述，1,25-(OH)2D3可抑制IPF的發(fā)生、發(fā)展；降低肺成纖維細胞內(nèi)Ca2+濃度、抑制PI3K-AKT-mTOR通路可能是其作用機制。

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Effects of 1, 25-(OH)2D3on idiopathic pulmonary fibrosis of rats and its mechanism

DONGHongliang1,LIUNaiguo,MIAOShuang,ZHENGJing,NINa,WANGNan

(1TheAffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256600,China)

Objective To observe the effects of 1, 25-(OH)2D3on idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) of rats, and to investigate its mechanism. Methods Ninety male SD rats were randomly divided into the model group, treatment group and control group (n=30 each). Bleomycin (5 mg/kg) was injected to the trachea of rats to establish the model of pulmonary fibrosis in the model group and treatment group, while the control group was injected with normal saline (200 μL in each). From the following day, rats in the treatment group and model group received 1, 25-(OH)2D3(2 μg/kg) and solvant (200 μL for each), respectively and once every other day. The control group was treated with normal saline (200 μL for each). Ten mice in each group were killed randomly on day 14, 21 and 28. The hydroxyproline content of lung tissues was measured by basic-hydrolysis method. Lung fibroblasts were separated from lung tissues and labeled by Fluo-3AM, then we used Laser scanning confocal microscope to detect the concentration of Ca2+. The mRNA levels of PI3K, AKT and mTOR in the lung fibroblasts were tested by real-time PCR. Results The hydroxyproline content of lung tissues, the Ca2+concentration and expression of PI3K, AKT and mTOR in lung fibroblasts were increased in the model group as compared with that of the control group on day 14, 21 and 28. The above indicators of treatment group were reduced significantly as compared with those of the model group (P<0.05 orP<0.01). Ca2+concentration was positively correlated with mRNA expression levels of three genes in the model group and treatment group (r=0.784, 0.647, 0.805, allP<0.01). Conclusion 1, 25-(OH)2D3inhibits the occurrence and development of IPF in rats, and its mechanism may be the reduction of Ca2+concentration and inhibition of PI3K-AKT-mTOR pathway.

idiopathic pulmonary fibrosis; 1, 25-(OH)2D3; calcium ion; PI3K-AKT-mTOR signaling pathway; lung fibroblasts

山東省自然科學基金資助項目(ZR2011HM062)；濱州醫(yī)學院科技計劃項目(BY2015KJ39)。

董洪亮(1987-)，男，初級檢驗師，研究方向為間質(zhì)性肺病的分子生物學機制。E-mail: hongliang.234@163.com

劉乃國(1966-)，男，教授，研究方向為間質(zhì)性肺病的分子生物學機制。E-mail: liunaiguo1966@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.006

R563

A

1002-266X(2016)28-0019-04

2016-03-15)