江君麗，任娟娟，唐春春，張超，朱宇航，朱昭瓊

(1貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

·基礎(chǔ)研究·

新生期大鼠重復(fù)吸入七氟醚對其幼年及成年學(xué)習(xí)、記憶能力及腦脊液中ApoE濃度的影響

江君麗1，任娟娟1，唐春春1，張超1，朱宇航2，朱昭瓊1

(1貴州省麻醉與器官保護(hù)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 觀察新生期大鼠重復(fù)吸入七氟醚對其幼年及成年學(xué)習(xí)、記憶能力及腦脊液中載脂蛋白E(ApoE)濃度的影響，探討七氟醚重復(fù)吸入麻醉的安全性。方法 將新生SD大鼠32只隨機(jī)分為四組，七氟醚幼年組、七氟醚成年組及對照幼年組、對照成年組。七氟醚幼年組及成年組均于出生第7、14、21天吸入2.6%七氟醚2 h，對照幼年組及成年組同時間點(diǎn)吸入對照運(yùn)載氣體2 h。幼年期大鼠于出生第31天、成年期大鼠于出生第91天行Morris水迷宮實(shí)驗。所有大鼠于水迷宮實(shí)驗結(jié)束后立即取腦脊液，ELISA法檢測ApoE。結(jié)果 水迷宮實(shí)驗適應(yīng)性訓(xùn)練期間，各組均會游泳，未發(fā)現(xiàn)眼盲、智力障礙大鼠；定位航行能力測試過程中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組逃避潛伏期均逐漸縮短，七氟醚幼年組與對照幼年組、七氟醚成年組與對照成年組逃避潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)；在空間探索試驗過程中，七氟醚幼年組和對照幼年組、七氟醚成年組和對照成年組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。七氟醚幼年組與對照幼年組腦脊液ApoE濃度分別為(35.45±10.60)、(33.24±8.71)ng/mL，兩組比較P>0.05；七氟醚成年組與對照成年組腦脊液ApoE濃度分別為(31.82±4.70)、(15.34±4.71)ng/mL，兩組比較P>0.05。結(jié)論 新生期大鼠重復(fù)吸入七氟醚對其幼年及成年學(xué)習(xí)、記憶能力無明顯影響，對腦脊液中ApoE濃度亦無明顯影響，提示七氟醚重復(fù)吸入麻醉安全。

七氟醚；學(xué)習(xí)；記憶；行為學(xué)；載脂蛋白E；腦脊液

七氟醚為臨床普遍應(yīng)用的新型吸入麻醉劑，具有誘導(dǎo)時間短、對呼吸系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)影響小、停藥后蘇醒迅速等優(yōu)點(diǎn)。但有研究認(rèn)為七氟醚會對嬰幼兒大腦造成一定的影響[1,2]。嬰幼兒時期是大腦發(fā)育的突觸塑形期，在這一時期重復(fù)吸入七氟醚是否會對其遠(yuǎn)期的學(xué)習(xí)和記憶產(chǎn)生影響是人們普遍關(guān)注的問題。載脂蛋白E(ApoE)對神經(jīng)系統(tǒng)的生長及修復(fù)起重要作用。2014年3月～2015年5月，本研究觀察了新生期大鼠重復(fù)吸入七氟醚對其遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)、記憶能力及腦脊液中ApoE濃度的影響，探討七氟醚重復(fù)吸入麻醉的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 SD孕鼠5只，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗動物中心提供(動物許可證號：SCXK渝2012-0005)。孕鼠在SPF級動物房飼養(yǎng)自行產(chǎn)仔，獲得新生SD大鼠32只。七氟醚(益君寧)，魯南貝特制藥有限公司；鈉石灰，英國Intersurgical公司。ApoE ELISA試劑盒，美國MyBioSource公司。Morris水迷宮測試儀，成都泰盟科技有限公司；Drager Julian麻醉機(jī)、氣體監(jiān)測儀，上海德爾格醫(yī)療設(shè)備有限公司；自制吸入麻醉箱。

1.2 動物分組及處理 采用隨機(jī)數(shù)字表法將32只新生SD大鼠分為七氟醚幼年組、七氟醚成年組、對照幼年組和對照成年組，每組8只。七氟醚幼年及成年組于出生第7、14、21天置入自制吸入麻醉箱中行吸入麻醉，通過調(diào)節(jié)Drager Julian 麻醉機(jī)使七氟醚濃度維持于2.6%，每次吸入時間為2 h。每次麻醉前在麻醉箱底部放置適量鈉石灰以吸收CO2，并在麻醉箱底鋪上保溫毯維持箱溫于28～32 ℃。麻醉期間嚴(yán)密觀察大鼠呼吸、皮膚色澤，防止大鼠缺氧窒息。麻醉結(jié)束后關(guān)閉揮發(fā)罐，將大鼠取出放置于自然環(huán)境中，待所有大鼠蘇醒后送回動物房與母鼠一同喂養(yǎng)。對照幼年組和成年組分別于出生7、14、21天置于自制吸入麻醉箱中吸入對照運(yùn)載氣體(1 L/min O2+1 L/min 空氣)，每次時長2 h，吸入結(jié)束后送回動物房與母鼠一同喂養(yǎng)。

1.3 學(xué)習(xí)和記憶能力測試 七氟醚幼年組及對照幼年組于出生第31天、七氟醚成年組及對照成年組于出生第91天開始行Morris水迷宮實(shí)驗。①適應(yīng)性訓(xùn)練：各組幼年大鼠于出生第31天、成年大鼠于出生第91天進(jìn)行為期1天的適應(yīng)性訓(xùn)練。將大鼠隨機(jī)放置于水池的任一位置，使其游泳2 min，淘汰不會游泳者。②定位航行試驗：幼年組于出生第32～35天、成年組于出生第92～95天進(jìn)行定位航行試驗。大鼠從某一固定點(diǎn)面向池壁入水，讓其尋找并爬上距水面1.5 cm的隱藏平臺(平臺隨機(jī)放置于水池的任一象限)。如120 s內(nèi)未爬上平臺，則指引其爬上平臺并休息10 s，記錄訓(xùn)練第1～4天的逃避潛伏期(即大鼠找到平臺所需的時間)。每天訓(xùn)練4次，取平均值。③空間探索試驗：各組幼年大鼠于出生第36天、成年大鼠于出生第96天進(jìn)行空間探索試驗。撤去平臺，大鼠自與平臺象限相對的象限入水，游泳120 s。記錄大鼠穿越平臺象限的次數(shù)、通過每個象限的次數(shù)、通過平臺象限的頻率，記錄有效區(qū)域(原平臺區(qū)域的1.5倍范圍)運(yùn)動時間、有效區(qū)域運(yùn)動距離、有效區(qū)域進(jìn)入次數(shù)以及平臺象限滯留時間百分比、平臺象限運(yùn)動距離百分比、平臺象限進(jìn)入次數(shù)百分比。

1.4 腦脊液ApoE濃度檢測 空間探索試驗完成后各組均立即取腦脊液置于-80 ℃冰箱中冷凍保存。采用ELISA法檢測ApoE濃度。一抗為生物素化的抗大鼠ApoE抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)

抗體。操作過程包括加樣、加生物素化抗體工作液、洗板、加辣根過氧化物酶標(biāo)抗體工作液、洗板、加底物工作液、終止。用酶標(biāo)儀在波長450 nm處檢測光密度值(OD值)，根據(jù)OD值繪制ApoE質(zhì)量濃度曲線，計算ApoE濃度。

2 結(jié)果

2.1 學(xué)習(xí)和記憶能力 適應(yīng)性訓(xùn)練期間，各組均會游泳，未發(fā)現(xiàn)眼盲、智力障礙大鼠。在定位航行試驗中，相同時間點(diǎn)七氟醚幼年組與對照幼年組、七氟醚成年組與對照成年組逃避潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表1。在空間探索試驗中，七氟醚幼年組與對照幼年組、七氟醚成年組與對照成年組各指標(biāo)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，見表2。

表1 各組定位航行試驗中逃避潛伏期比較±s)

表2 各組空間探索試驗結(jié)果比較±s)

2.2 腦脊液ApoE濃度 七氟醚幼年組及對照幼年組腦脊液ApoE濃度分別為(35.45±10.60)(33.24±8.71)ng/mL，兩組比較P>0.05；七氟醚成年組及對照成年組腦脊液ApoE濃度分別為(31.82±4.70)、(15.34±4.71)ng/mL，兩組比較P>0.05。

3 討論

新生期是學(xué)習(xí)與記憶形成的關(guān)鍵時期，在這一時期中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在許多突觸的形成與反射的建立；此期如有不良因素刺激可影響認(rèn)知功能的發(fā)展[3,4]。謝娟等[5]研究認(rèn)為，吸入2%或4%七氟醚均會引起大鼠認(rèn)知功能下降，且隨濃度的增加其對認(rèn)知功能的影響顯著增強(qiáng)；朱霞等[1]認(rèn)為，七氟醚影響認(rèn)知功能的效應(yīng)是短期的、一過性的。但上述研究均為單次吸入七氟醚，重復(fù)吸入七氟醚對遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)、記憶的影響未見報道。

臨床常用的七氟醚濃度為2%～3%，新生大鼠七氟醚最低肺泡有效濃度(MAC)約為2%，臨床99%有效劑量(ED99)值為1.3 MAC，即2.6%[6]，故本實(shí)驗七氟醚吸入濃度定為2.6%。Morris水迷宮實(shí)驗受外界因素影響較小，能較好地評價大鼠的認(rèn)知功能；其中定位航行試驗檢測大鼠在多次訓(xùn)練后，找到隱藏在水中的固定平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知，這種空間認(rèn)知是通過加工空間信息形成的，所形成的記憶屬于空間參考記憶，按信息加工和提取的方式來看，這種空間參照記憶又屬于陳述性記憶；空間探索試驗是對定位航行中形成的記憶信息提取的過程，檢測的是空間聯(lián)想和回憶探究能力，屬于認(rèn)知功能中的聯(lián)合型學(xué)習(xí)能力[7]。本研究定位航行試驗中，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組逃避潛伏期均逐漸縮短，說明大鼠通過訓(xùn)練均可逐步形成穩(wěn)定的空間參照記憶。七氟醚幼年組與對照幼年組、七氟醚成年組與對照成年組逃避潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，與謝娟等[5]研究結(jié)果一致，他們認(rèn)為出生第36天已處于認(rèn)知功能損害的修復(fù)階段，此時大鼠的學(xué)習(xí)、記憶功能已大部分恢復(fù)。認(rèn)知功能包括知覺、注意、表象、記憶、學(xué)習(xí)、思維和語言等多個方面，本研究僅從學(xué)習(xí)與記憶方面分析了七氟醚對認(rèn)知功能的影響，目前的結(jié)果僅表明新生期重復(fù)吸入七氟醚不會對幼年期和成年期陳述性記憶的形成及聯(lián)合型學(xué)習(xí)能力產(chǎn)生明顯影響，七氟醚對認(rèn)知功能其他方面的影響還不明確。

ApoE是一種相對分子量為34 145 D的血漿蛋白，主要在肝臟內(nèi)合成，亦可在腦組織中表達(dá)，星形膠質(zhì)細(xì)胞是其主要合成部位。ApoE參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、功能維護(hù)和損傷后修復(fù)等過程[8]。ApoE有三種亞型，包括ApoE2、ApoE3和ApoE4。在神經(jīng)元的生長過程中ApoE具有亞型特異性[9]，ApoE4與微管蛋白的解聚有關(guān)，可抑制神經(jīng)元的生長；ApoE3可增加tau蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)神經(jīng)元的生長[9]。有研究表明，腦脊液中ApoE與大腦中的脂質(zhì)代謝和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理學(xué)發(fā)展聯(lián)系密切[10]。秦斌等[11]發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默(AD)患者腦脊液ApoE濃度明顯高于其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者，說明ApoE大量存在于AD患者腦內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，腦內(nèi)ApoE升高可能與老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)形成和腦血管淀粉樣變性增多有關(guān)，機(jī)制可能為ApoE促進(jìn)β-淀粉樣肽(Aβ)的沉積，從而引起神經(jīng)變性和行為缺陷[12～14]。朱宇航等[15]研究提示，七氟醚誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙與其上調(diào)海馬ApoE mRNA無關(guān)。分析本研究結(jié)果，尚不能認(rèn)為新生期重復(fù)吸入七氟醚會對幼年期及成年期大鼠腦脊液中ApoE濃度產(chǎn)生影響?？赡茉蛴? ①七氟醚麻醉所引起的腦脊液ApoE濃度的變化具有亞型特異性，如ApoE4升高而ApoE3降低，從而表現(xiàn)為總體變化不明顯[14]；②七氟醚所引起的術(shù)后認(rèn)知功能障礙并非僅通過ApoE這一通路[15]。

綜上所述，新生期重復(fù)吸入七氟醚對大鼠近期及遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)、記憶能力無明顯影響，對腦脊液中ApoE濃度亦無明顯影響，說明七氟醚重復(fù)吸入麻醉安全；但其對認(rèn)知功能其他方面的影響及對ApoE各亞型的影響仍需進(jìn)一步研究。

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國家自然科學(xué)基金資助項目(81360180)。

朱昭瓊(E-mail: 314887347@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.28.008

R971

A

1002-266X(2016)28-0026-03

2015-10-28)