程寶倉，白宏英，鄭世茹，楊會杰

450014 河南省鄭州市，鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

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·論著 ·

姜黃素對魚藤酮誘導的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用

程寶倉，白宏英，鄭世茹，楊會杰

450014 河南省鄭州市，鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

【摘要】目的觀察姜黃素對由魚藤酮誘導的慢性帕金森病大鼠模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用并探討其可能機制。方法2014年12月—2015年5月，選取清潔級雄性SD大鼠80只按隨機區(qū)組法分為溶劑對照組、姜黃素組、魚藤酮組、治療組，每組20只。采用腦切片免疫組化染色法檢測大鼠腦黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶(TH)陽性細胞數(shù)，Western blotting法檢測大鼠腦黑質(zhì)區(qū)沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)、P47phox表達水平，流式細胞儀檢測大鼠腦黑質(zhì)區(qū)活性氧(ROS)水平。結(jié)果4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)低于溶劑對照組、姜黃素組(P<0.05)；治療組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)低于溶劑對照組、姜黃素組，高于魚藤酮組(P<0.05)。4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3、P47phox表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3表達水平低于溶劑對照組、姜黃素組(P<0.05)；治療組腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3表達水平低于溶劑對照組、姜黃素組，高于魚藤酮組(P<0.05)。魚藤酮組腦黑質(zhì)區(qū)P47phox表達水平高于溶劑對照組、姜黃素組(P<0.05)；治療組腦黑質(zhì)區(qū)P47phox表達水平高于溶劑對照組、姜黃素組，低于魚藤酮組(P<0.05)。4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平高于溶劑對照組、姜黃素組(P<0.05)；治療組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平高于溶劑對照組、姜黃素組，低于魚藤酮組(P<0.05)。結(jié)論姜黃素可有效拮抗魚藤酮誘導的慢性帕金森病大鼠多巴胺能神經(jīng)元損傷，其機制可能與姜黃素通過促進SIRT3的表達清除小膠質(zhì)細胞源性ROS有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】帕金森??；魚藤酮；姜黃素；多巴胺能神經(jīng)元；沉默信息調(diào)節(jié)因子3；P47phox；大鼠

程寶倉，白宏英，鄭世茹，等.姜黃素對魚藤酮誘導的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損傷的保護作用[J].中國全科醫(yī)學，2016，19(12)：1462-1466.[www.chinagp.net]

Cheng BC,Bai HY,Zheng SR，et al.Protective effect of curcumin on rotenone-induced dopaminergic neuron injury in the substantia nigra[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1462-1466.

帕金森病(Parkinson disease，PD)是神經(jīng)系統(tǒng)第二大變性病,以黑質(zhì)多巴胺(DA)能神經(jīng)元進行性變性死亡為主要病理特征。近年來，在動物模型和PD患者腦中除了發(fā)現(xiàn)大量DA能神經(jīng)元缺失外，還發(fā)現(xiàn)了大量增生的膠質(zhì)細胞[1]。炎性反應在腦中的標志是小膠質(zhì)細胞的激活，因此神經(jīng)炎性反應在 PD 發(fā)病中的作用受到廣泛關(guān)注[2]，抑制小膠質(zhì)細胞過度激活可能代表了在 PD 中減少DA能神經(jīng)元進行性變性死亡的一個治療方向。姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗癌、清除自由基等多方面藥理作用，還能夠調(diào)節(jié)和抑制小膠質(zhì)細胞的表達和遷移[3]。研究顯示，姜黃素能夠通過促進轉(zhuǎn)錄因子Nrf2(NF-E2-related factor 2)的表達減少細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，從而延緩細胞的衰老或凋亡[4]。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)在對抗氧化應激中起重要作用，但是姜黃素能否通過SIRT3減少小膠質(zhì)細胞源性ROS保護PD能神經(jīng)元目前仍缺乏相關(guān)研究。為此，本研究選擇姜黃素治療魚藤酮誘導的慢性PD SD大鼠模型，擬觀察姜黃素對DA能神經(jīng)元的保護作用及SIRT3所介導的具體機制。

1材料與方法

1.1實驗動物2014年12月—2015年5月，選取清潔級健康雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量200～220 g，由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(晉)20150001。室溫(25±2) ℃飼養(yǎng)，自然光照。

1.2主要試劑一抗分別為兔抗大鼠酪氨酸羥化酶(TH)多克隆抗體(1∶200，美國 Santa cruz 公司)、兔抗大鼠SIRT3多克隆抗體(1∶1 000，美國 Santa cruz 公司)、兔抗大鼠P47phox多克隆抗體(1∶1 000，美國 Santa cruz 公司)；二抗為生物素化羊抗兔、抗鼠IgG(1∶4 000，美國 Santa cruz 公司)；ROS檢測試劑盒購自中國碧云天公司；姜黃素、葵花油均購自美國 Sigma 公司；二甲基亞砜購自阿拉丁科技(中國)有限公司。

1.3方法

1.3.1分組及PD模型建立所有大鼠經(jīng)3次行為測試確認無自發(fā)行為異常并適應性飼養(yǎng)5 d后，按隨機區(qū)組法分為溶劑對照組、姜黃素組、魚藤酮組、治療組(魚藤酮+姜黃素)，每組20只。魚藤酮組與治療組大鼠采用頸背部皮下注射1.5 mg/ml魚藤酮葵花油乳化液1.5 mg·kg-1·d-1，連續(xù)注射28 d[5]。溶劑對照組及姜黃素組方法同上，但只注射不含魚藤酮的等量葵花油。

本研究創(chuàng)新點：

姜黃素具有抗氧化、抗感染、抗癌、清除自由基等多方面藥理作用，還能夠調(diào)節(jié)和抑制小膠質(zhì)細胞的表達和遷移，延緩細胞的衰老或凋亡。沉默信息調(diào)節(jié)因子3(SIRT3)在對抗氧化應激中起重要作用，但是姜黃素能否通過SIRT3減少小膠質(zhì)細胞源性活性氧類物質(zhì)(ROS)保護黑質(zhì)多巴胺能細胞目前仍缺乏相關(guān)研究。為此，本研究選擇姜黃素治療魚藤酮誘導的慢性帕金森病SD大鼠模型，探討姜黃素對黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的保護作用及SIRT3所介導的具體機制。

1.3.2神經(jīng)功能評分在造模28 d后的同一時間點，觀察大鼠有無毛色變黃粗糙、活動遲緩、弓背豎毛、拒捕行為減弱、不自主運動等異常形態(tài)及行為，并評分。評分標準按照陳忻等[5]建立的大鼠行為變化評分體系進行。行為學評分2分以上為造模成功，最后每組均以TH免疫組化法作組織學鑒定。

1.3.3姜黃素灌胃治療姜黃素組及治療組在造模成功24 h后予以4 mg/ml姜黃素二甲基亞砜溶液40 mg·kg-1·d-1灌胃治療，連續(xù)治療28 d。溶劑對照組與魚藤酮組同步每日灌胃二甲基亞砜10 ml·kg-1·d-1，連續(xù)治療28 d。28 d后將大鼠全部處死。

1.3.4免疫組化染色檢測TH陽性細胞數(shù)每組隨機取10只大鼠經(jīng)心臟灌注4%多聚甲醛溶液固定，取腦，石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗，加入封閉血清、一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗，加二抗、鏈霉卵白液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固,光鏡下觀察，TH陽性細胞呈棕灰色。陰性對照：以正常兔血清代替一抗，其余步驟同上。正常腦組織與魚藤酮損傷后腦組織比較再次驗證了造模成功。

1.3.5Western blotting法檢測SIRT3、P47phox表達水平每組其余10只大鼠新鮮取腦，-80 ℃保存。將腦組織定位取出黑質(zhì)后，把黑質(zhì)部分剪切成小塊，取一半(另一半用于測定ROS水平)放于預冷的玻璃勻漿器中，加入蛋白裂解液，超聲粉碎，4 ℃裂解過夜，裂解液于4 ℃、12 000×g離心10 min，吸取上清液于4 ℃保存。蛋白質(zhì)定量采用考馬斯亮藍G-250染色法(Bradford法)。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，分別加入SIRT3、P47phox抗體，脫脂奶粉孵育過夜，加二抗，曝光，進行圖像分析。

1.3.6流式細胞儀檢測ROS水平取另一半黑質(zhì)，PBS沖洗，300目尼龍網(wǎng)過濾，以1 000×g離心5 min后加入無血清DMEM細胞培養(yǎng)基制成濃度為1×106/ml單細胞懸液；向單細胞懸液中加入終濃度為10 μmol/L 的2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)，37 ℃孵育20 min后用DMEM細胞培養(yǎng)基洗滌細胞3次。流式細胞儀(激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm)檢測熒光強度，以平均熒光強度表示ROS水平。

2結(jié)果

2.14組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)比較4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)低于溶劑對照組、姜黃素組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)低于溶劑對照組、姜黃素組，高于魚藤酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；溶劑對照組與姜黃素組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表1、圖1，本文圖1彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應文章附件)。

Table1ComparisonofthenumberofTHpositivecellsinthesubstantianigraamongthefourgroups

組別只數(shù)TH陽性細胞數(shù)溶劑對照組10389±54 姜黃素組10405±27 魚藤酮組10 50±7ab 治療組10119±11abcF值347.149P值<0.001

注：與溶劑對照組比較，aP<0.05；與姜黃素組比較，bP<0.05；與魚藤酮組比較，cP<0.05；TH=酪氨酸羥化酶

2.24組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3、P47phox表達水平比較4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3、P47phox表達水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3表達水平低于溶劑對照組、姜黃素組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3表達水平低于溶劑對照組、姜黃素組，高于魚藤酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組腦黑質(zhì)區(qū)P47phox表達水平高于溶劑對照組、姜黃素組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組腦黑質(zhì)區(qū)P47phox表達水平高于溶劑對照組、姜黃素組，低于魚藤酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。溶劑對照組與姜黃素組腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3、P47phox表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表2、圖2)。

Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofSIRT3andP47phoxinthesubstantianigraamongthefourgroups

組別只數(shù)SIRT3P47phox溶劑對照組100.54±0.050.09±0.01姜黃素組100.55±0.050.08±0.01魚藤酮組100.08±0.01ab0.65±0.05ab治療組100.24±0.02abc0.32±0.03abcF值371.010736.405P值<0.001<0.001

注：與溶劑對照組比較，aP<0.05；與姜黃素組比較，bP<0.05；與魚藤酮組比較，cP<0.05；SIRT3=沉默信息調(diào)節(jié)因子3

注：1為溶劑對照組 ，2為姜黃素組，3為魚藤酮組，4為治療組；SIRT3=沉默信息調(diào)節(jié)因子3

圖2Western blotting法檢測4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3、P47phox的表達

Figure 2Expression of SIRT3 and P47phox in the substantia nigra of the four groups detected by Western blotting method

注：箭頭所指為TH陽性細胞

圖1光鏡下觀察4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)(免疫組化染色，×400)

Figure 1Number of TH positive cells in the substantia nigra of the four groups observed under light microscope

2.34組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平比較4組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。魚藤酮組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平高于溶劑對照組、姜黃素組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；治療組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平高于溶劑對照組、姜黃素組比較，低于魚藤酮組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。溶劑對照組與姜黃素組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)ROS水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

Table3ComparisonofthelevelofROSinthesubstantianigraamongthefourgroups

組別只數(shù)ROS溶劑對照組10 42±4 姜黃素組10 40±4 魚藤酮組10239±19ab治療組10116±22abcF值395.099P值<0.001

注：與溶劑對照組比較，aP<0.05；與姜黃素組比較，bP<0.05；與魚藤酮組比較，cP<0.05；ROS=活性氧

3討論

研究表明，小膠質(zhì)細胞介導的氧化應激損傷在PD的發(fā)病過程中起到了重要的作用[6]。小膠質(zhì)細胞是自由基的一個重要來源，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶是小膠質(zhì)細胞的一種重要的調(diào)質(zhì)，是小膠質(zhì)細胞源性ROS的原始來源和小膠質(zhì)細胞內(nèi)促發(fā)炎癥信息的一個機制。NADPH氧化酶是由p47phox、p67phox、p40phox、p22phox、gp91phox和Rac 6個亞基組成的酶復合體，其中p47phox是NADPH氧化酶的關(guān)鍵亞基，p47phox在小膠質(zhì)細胞源性ROS的形成中發(fā)揮著重要作用。

Sirtuins家族是一組依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的去乙?；?，在哺乳類中表達SIRT1～7 7種亞型，廣泛分布于各種組織，參與調(diào)控細胞的老化、凋亡和能量代謝等[7]。SIRT3是唯一與人類老化相關(guān)的Sirtuins家族成員，作為細胞內(nèi)多個通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，SIRT3開始成為PD等老年神經(jīng)退行性疾病研究的新方向[8]。SIRT3 可通過去乙?；饔糜谙嚓P(guān)底物，激活一系列反應還原ROS，保護細胞免受氧化損傷，其對氧化應激的保護作用，較Sirtuins家族其他成員更為突出。在神經(jīng)系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究中，Someya等[9]發(fā)現(xiàn)，SIRT3可去乙?；€粒體異枸櫞酸脫氫酶2(IDH2) 酶而減少線粒體內(nèi)ROS，上調(diào)其表達可減緩老化相關(guān)性耳聾的發(fā)病。而Kim等[10]更進一步證實SIRT3 在神經(jīng)元中亦表達，可通過降低細胞內(nèi)ROS，減緩NMDA引起的神經(jīng)興奮性損傷。以上證據(jù)均表明SIRT3減少細胞內(nèi)ROS起神經(jīng)保護作用，因此本研究推測SIRT3可能通過抑制p47phox的表達來減少小膠質(zhì)細胞源性ROS的產(chǎn)生從而參與了PD的神經(jīng)保護。

本研究結(jié)果顯示，魚藤酮組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)低于溶劑對照組、姜黃素組，ROS水平高于溶劑對照組、姜黃素組，說明環(huán)境毒素魚藤酮能夠使SD大鼠腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)顯著減少，同時使細胞內(nèi)ROS水平明顯升蒿，從而損傷DA能神經(jīng)元。因為魚藤酮能夠抑制線粒體呼吸鏈復合物Ⅰ的活性，選擇性地阻斷Fe-S簇與輔酶Q的作用,使ROS的生成增加。推測姜黃素可能通過使SIRT3表達增加從而抑制p47phox的表達來清除小膠質(zhì)細胞內(nèi)的ROS從而保護DA能神經(jīng)元。于是，本研究測定大鼠腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3、P47phox的表達水平以及小膠質(zhì)細胞內(nèi)的ROS水平，結(jié)果顯示魚藤酮組大鼠腦黑質(zhì)區(qū)SIRT3表達水平明顯減少，P47phox表達水平、ROS水平明顯升高；經(jīng)姜黃素干預治療后，治療組腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細胞數(shù)、SIRT3表達水平較魚藤酮組明顯升高，P47phox表達水平、ROS水平較魚藤酮組明顯降低。因此，筆者推測姜黃素通過促進SIRT3的表達從而抑制p47phox的表達來清除魚藤酮誘導的小膠質(zhì)細胞源性ROS水平，進而保護受損的DA能神經(jīng)元；并且魚藤酮能夠抑制小膠質(zhì)細胞線粒體復合物Ⅰ對氧的利用，產(chǎn)生大量ROS，而小膠質(zhì)細胞源性ROS水平的升高又可促使小膠質(zhì)細胞的過度激活造成DA能神經(jīng)元的損傷。提示姜黃素通過清除小膠質(zhì)細胞源性ROS，抑制小膠質(zhì)細胞的過度激活，從而保護DA能神經(jīng)元。

綜上所述,本研究提示在魚藤酮誘導的PD大鼠模型中，TH陽性細胞數(shù)、SIRT3表達水平減少，P47phox表達水平、ROS水平升高，姜黃素通過促進SIRT3的表達清除小膠質(zhì)細胞源性ROS從而保護DA能神經(jīng)元，為進一步的臨床研究提供了參考依據(jù)。

作者貢獻：程寶倉進行實驗設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；鄭世茹、楊會杰進行實驗實施、評估、資料收集；白宏英進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李婷婷)

Protective Effect of Curcumin on Rotenone-induced Dopaminergic Neuron Injury in the Substantia Nigra

CHENGBao-cang，BAIHong-ying，ZHENGShi-ru，etal.DepartmentofNeurology，theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the protective effect of curcumin on rotenone-induced dopaminergic neuron injury in the substantia nigra of model rats with chronic Parkinson disease (PD) and it possible mechanism.MethodsFrom December 2014 to May 2015,80 cleaned male SD rats were selected and randomly divided into solvent control group,curcumin group,rotenone group and treatment group,20 rats in each group.Brain section immuno-histochemical staining method was used to detect the number of positive cells of tyrosine hydroxylase(TH) in the substantia nigra.The expression levels of SIRT3 and P47phox in the substantia nigra were detected using Western blotting method,and reactive oxygen species (ROS) in the substantia nigra was detected using flow cytometry.ResultsThe four groups were significantly different in the number of TH positive cells in the substantia nigra (P<0.05).Rotenone group was lower than solvent control group and curcumin group in the number of TH positive cells in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was lower than solvent control group and curcumin group and was higher than rotenone group in the number of TH positive cells in the substantia nigra(P<0.05).The four groups were significantly different in the expression levels of SIRT3 and P47phox in the substantia nigra(P<0.05).Rotenone group was lower than solvent control group and curcumin group in the expression level of SIRT3 in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was lower than solvent control group and curcumin group and higher than rotenone group in the expression level of SIRT3 in the substantia nigra(P<0.05).Rotenone group was higher than solvent control group and curcumin group in the expression level of P47phox in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was higher than solvent control group and curcumin group and lower than rotenone group in the expression level of P47phox in the substantia nigra(P<0.05).The four groups were significantly different in ROS level in the substantia nigra(P<0.05).Rotenone group was higher than control group and curcumin group in ROS level in the substantia nigra(P<0.05)；treatment group was higher than solvent control group and curcumin group and lower than rotenone group in ROS level in the substantia nigra(P<0.05).ConclusionCurcumin can effectively antagonize rotenone-induced dopaminergic neuron injury in rats with chronic PD,and the mechanism may be related with the obliteration of microglia-derived ROS by increasing the expression of SITR3.

【Key words】Parkinson disease；Rotenone；Curcumin；Dopaminergic neurons；SIRT3；P47phox；Rats

(收稿日期：2015-10-29；修回日期：2016-01-26)

【中圖分類號】R 742.5

【文獻標識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.021

通信作者：白宏英，450014 河南省鄭州市，鄭州大學第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；E-mail:hybai@126.com

基金項目：2014年河南省科學技術(shù)廳基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目(142300410461)

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·